Name: Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de loxygène à lIslet Plain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Découvrez le contrôle microfluidique de l'oxygène pour moduler l'hypoxie intermittente dans les îlots pancréatiques. Cette technique permet une surveillance en temps réel et une livraison précise d'oxygène pour étudier la physiopathologie des îlots.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE) et Chicago Diabetes Project.

1. Préparation des îlots de souris
<ol>
	<li>Disséquer des souris C57BL/6 et isoler les îlots par digestion par collagénase et séparation par gradient de densité de Ficoll. (Reportez-vous aux articles de JOVE référencés en2,3).</li>
	<li>Incuber les îlots dans un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine et 20 mM d’HEPES dans des boîtes de Pétri (37 °C, 5 % de CO2). Après l’isolement, cultiver les îlots pendant 24 heures avant d’être utilisé dans des expériences. Utilisez les îlots dans un délai de 1 à 2 jours pour garantir des résultats cohérents.</li>
</ol>
2. Fabrication de la plate-forme microfluidique
<ol>
	<li>Générez les géométries de microstructure sur des photomasques transparents pour chaque couche du dispositif : 1) entrée et sortie, 2) couche microfluidique de glucose avec chambre de périfusion (8 mm de diamètre x 3 mm, 150 μl), 3) membrane de 200 μm avec micropuits (500 μm de diamètre, 100 μm de profondeur) et 4) couches microfluidiques gazeuses.</li>
	<li>Pour fabriquer les couches d’entrée et de sortie, versez du PDMS dégazé et prémélangé à une hauteur de 1,5 mm dans une boîte de Pétri vierge et durcissez à 80 °C pendant 2 heures. Perforez des orifices d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre.</li>
	<li>Pour fabriquer la couche microfluidique de glucose, faites tourner deux couches de 350 μm de SU8-2150 pour former une seule couche de 700 μm sur une plaquette de silicium de 4 pouces.
	<ol>
		<li>Exposez la lumière UV à travers le photomasque approprié pour transférer le motif à microcanaux sur le SU8 après le développement, produisant un master de 700 μm de haut.</li>
		<li>Versez le PDMS dégazé et prémélangé sur ce master à une hauteur de 3 mm et durcissez à 80 °C pendant 2 h. Coupez ce PDMS à l’aide d’une lame de rasoir.</li>
		<li>Perforez les ports d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre ainsi que la chambre de 8 mm de diamètre.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour fabriquer la membrane de 200 μm avec des micropuits, faites pivoter SU8-2100 à 100 μm. Appliquez la même lithographie UV pour transférer les motifs de micropuits sur ce master de 100 μm de haut.
	<ol>
		<li>Essorez le PDMS dégazé et prémélangé sur ce maître à 900 tr/min pendant 30 secondes et durcissez à 80 °C pendant 10 min. Faites tourner une deuxième couche sur la première en utilisant les mêmes conditions, ce qui permet d’obtenir une membrane PDMS de 200 μm contenant des motifs de micropuits.</li>
		<li>Perforez des ports d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre à travers cette membrane</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour fabriquer la couche microfluidique gazeuse, faites pivoter SU8-2100 à 100 μm. Appliquez la même lithographie UV pour transférer des motifs microfluidiques gazeux sur ce master de 100 μm de haut.
	<ol>
		<li>Versez le PDMS dégazé et prémélangé sur ce master à une hauteur de 1,5 mm et durcissez à 80 °C pendant 2 h. Coupez le PDMS à l’aide d’une lame de rasoir.</li>
		<li>Perforez des ports d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre à travers cette couche</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour coller les multiples couches, préparez-les en les nettoyant avec du scotch, en les exposant à l’arc corona, puis en les alignant à la main dans l’ordre suivant.
	<ol>
		<li>Collez la membrane à la couche gazeuse inférieure avec les micropuits vers le haut.</li>
		<li>Collez le glucose microfluidique sur la membrane du micropuits.</li>
		<li>Collez les couches d’entrée et de sortie sur le dessus, encapsulant l’ensemble de l’ensemble.</li>
		<li>Renforcez le collage en ajoutant 1 kg de poids sur le dessus et en cuisant à 100 °C pendant 3 heures.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testez l’étanchéité de l’appareil terminé en chargeant de l’eau dans la couche aqueuse, puis en immergeant l’ensemble de l’appareil sous l’eau. Ensuite, faites circuler l’air à travers la couche de gaz avec une seringue vide.</li>
	<li>Stérilisez les dispositifs étanches avec de l’éthanol à 70 % à travers la couche aqueuse, puis rincez-les avec un tampon PBS, dans lequel le dispositif est stocké à 4 °C jusqu’à son utilisation.</li>
</ol>
3. Configuration du microdistributeur
<ol>
	<li>Procurez-vous 2 microdistributeurs, des alimentations 5 V et 20 V CC et une carte d’E/S numérique pour construire la configuration de mélange et de distribution d’oxygène.
	<ol>
		<li>Connectez les fils de commande des microdistributeurs aux unités d'entraînement incluses.</li>
		<li>Connectez les drivers à la carte d’E/S numérique aux ports correspondant aux commandes Labview.</li>
		<li>Connectez les alimentations 5 V et 20 V aux contacts correspondants sur les unités d’entraînement.</li>
		<li>Connectez les E/S numériques à un ordinateur portable pour exécuter les codes Labview pour le contrôle des gaz (Annexe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Connectez un microdistributeur à de l’azote tandis qu’un autre à de l’air comprimé, tous deux contenant 5 % de CO2. Réglez les deux gaz à 2 psi. Branchez les sorties des distributeurs dans une jonction en T avant d'entrer dans le dispositif microfluidique.</li>
	<li>À l’aide d’un appareil testé d’étanchéité, caractérisez la réponse transitoire de la modulation de l’oxygène en faisant fonctionner les microdistributeurs entre 5 et 21 % d’oxygène, tout en mesurant l’oxygène dissous dans l’eau à l’aide d’un capteur d’oxygène à fibre optique (voir la liste des équipements et les résultats représentatifs).</li>
</ol>
4. Installation à la microscopie
<ol>
	<li>Montez l’appareil sur la platine chauffée du microscope inversé.</li>
	<li>Connectez les gaz 0 % et 21 % O2 à l’appareil et calibrez avec le capteur d’oxygène.</li>
	<li>Connectez l’orifice de sortie de la microfluidique de glucose à un collecteur de fractions.</li>
	<li>Préparez le tampon bicarbonaté Krebs Ringer (KRB) : 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2·2H2O, 1,2 mM MgSO4·7H2O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40, 2 mM de glucose basal et 5 % de FBS.</li>
	<li>Préparez deux solutions tampons contenant respectivement 2 mM et 14 mM de glucose dans des tubes coniques de 50 ml baignés dans un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Connectez une pompe péristaltique pour aspirer un tampon à 250 μl/min dans le tube. Faire couler le tube sur une plaque chauffante à 37 °C avant d’entrer dans le dispositif microfluidique.</li>
	<li>Pour colorer les îlots, ajoutez du Fura-2 AM dans du DMSO et du Rh123 dans de l’éthanol à 100 % à 2 ml de KRB pour atteindre des concentrations finales de colorant de 5 μM et 2,5 μM, respectivement.</li>
	<li>Prélever les îlots à l’aide d’une pipette de 10 μl et incuber dans des colorants pendant 30 min à 37 °C.</li>
	<li>Chargez environ 20 îlots dans l’appareil via l’entrée du microcanal de glucose. Dirigez les îlots dans la chambre en amorçant le tampon de la sortie dans l’entrée.</li>
	<li>Perfuser les îlots dans un tampon pendant 10 min pour éliminer l’excès de colorants.</li>
</ol>
5. Exécution de la stimulation simultanée de l’oxygène et du glucose
<ol>
	<li>Administrer une impulsion de stimulation du glucose avec 5 min de base établie par KRB2, suivie de 15 min de stimulation 14 mM, puis laver pendant 15 min dans KRB2.</li>
	<li>Enregistrez une longueur d’onde d’excitation de 340/380 nm pour Fura-2 et une émission de 534 pour Rh123.</li>
	<li>Effectuer des mesures d’une impulsion normale (14 mM normoxique) avant chaque expérience.</li>
	<li>Pour la modulation de l’oxygène (hypoxie/hypoxie intermittente), n’appliquez un débit tampon que pendant les étapes de stimulation et de lavage et aucun débit dans les autres étapes, afin de minimiser les perturbations convectives.</li>
	<li>Prélever les effluents de la sortie du glucose à des intervalles de 1 minute pour le dosage de l’insuline ELISA.</li>
</ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les multiples modalités intégrées dans cette technique d’hypoxie des îlots présentent plusieurs points notés ici pour le dépannage. Tout d’abord, les îlots isolés continuent de se dégrader et de se désintégrer en culture en raison des enzymes digestives des cellules acineuses. Il est donc essentiel de normaliser les expériences jusqu’à 1 à 2 jours après l’isolement des îlots de Langerhans pour obtenir des résultats cohérents. Deuxièmement, l’écoulement aqueux a été arrêté pendant l’hypoxie et l’hypoxie intermittente pour...

L’hypoxie dynamique est importante en biologie, en particulier pour les greffes d’îlots
L’hypoxie dynamique est un paramètre physiologique et physiopathologique important dans de nombreux tissus biologiques. Le changement d’oxygène, par exemple, est un puissant signal de développement dans l’angiogenèse. De plus, les modèles spatiaux et temporels de l’hypoxie modulent HIF1-alpha et jouent un rôle dans des maladies comme le cancer du pancréas. L’hypoxie est également un facteur de confusion affectant les résultats de la greffe d’îlots. Récemment, des oscillations temporelles de l’hypoxie, ou hypoxie intermittente (IH), ont démontré des avantages dans le « préconditionnement » des îlots1. Cependant, les effets de l'hypoxie statique et transitoire sur la physiologie des îlots pancréatiques n'ont pas encore été bien compris ou étudiés, principalement en raison du manque d'outils appropriés pour contrôler le microenvironnement des îlots.
Les îlots sont bien vascularisés in vivo
Les îlots pancréatiques sont des agrégats sphéroïdaux de 50 à 400 μm de cellules endocrines, y compris les cellules bêta et les cellules alpha qui sont responsables de l’homéostasie du glucose. Lorsque les îlots sont exposés à du glucose stimulateur dans le sang, l’absorption et la glycolyse entraînent une production d’ATP, ce qui ouvre les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP) et entraîne un afflux de calcium qui déclenche l’exocytose des granules d’insuline. L’oxygène est important pour piloter ce processus fortement métabolique et la sécrétion d’insuline est considérablement influencée par la dynamique du flux sanguin et de l’approvisionnement en oxygène en plus des gradients de glucose. Les îlots de Langerhans exécutent facilement cette réponse glucose-insuline in vivo car ils sont fortement irréguliers dans le pancréas, chacun à moins d’une longueur de cellule d’un vaisseau capillaire. Cependant, le réseau dense de capillaires intra-îlots est éliminé par la collagénase lors de l’isolement des îlots2,3. Par conséquent, les réserves d’oxygène et de nutriments sont limitées à un périmètre de 100 μm en raison des limites de diffusion.
Les techniques actuelles ont un succès limité dans la recréation du microenvironnement des îlots de Langerhans
La recréation de la dynamique native de l'oxygène et du glucose des îlots, essentielle à la modélisation des conditions physiologiques et physiopathologiques, est difficile à réaliser avec des chambres hypoxiques standard qui nécessitent un débit élaboré et manquent de surveillance continue des fonctions des îlots. De plus, les traitements de transplantation pour le diabète de type I exposent des îlots isolés à une hypoxie dans le système portehépatique 4 qui a une pO2 beaucoup plus faible (<2 %, 5-15 mmHg) par rapport au pancréas physiologique (5,6 %, 40 mmHg). Après la greffe, les greffons d’îlots mettent deux semaines ou plus à être revascularisés. Il a été démontré que l'exposition hypoxique altère le mécanisme de couplage glucose-insuline des îlots. Parmi les facteurs de couplage stimulus-sécrétion, la signalisation calcique, les potentiels mitochondriaux et la cinétique de l’insuline peuvent être facilement surveillés à l’aide de la microfluidique. Notre précédente technique microfluidique a démontré cette surveillance en temps réel avec une modulation précise du microenvironnement aqueux autour de l’îlotunique 5,6. Cependant, la quantification de l'insuffisance hypoxique des îlots est entravée par l'absence de techniques de stimulation et de surveillance simultanées. Par conséquent, la combinaison du contrôle microfluidique de l’oxygène et de la surveillance des îlots pancréatiques peut améliorer les études d’hypoxie des îlots pancréatiques.
Microfluidics peut recréer et moduler le microenvironnement aqueux et oxygéné
La technique standard pour les études d’hypoxie tissulaire et de culture a été basée sur des chambres hypoxiques. En général, les chambres hypoxiques fournissent des concentrations d’oxygène uniques avec des temps d’équilibre en ~10-30 min, incompatibles avec l’hypoxie dynamique à l’échelle de la minute. Deux études récentes ont utilisé de petites chambres personnalisées pour l’exposition intermittente à l’hypoxie sur des souris entières, avec des résultats contradictoires sur la réponse insulinique induite par le glucose7,8. Gardez à l’esprit qu’au niveau de l’ensemble de l’animal, l’oxygène respiré n’est pas directement traduit en pO2 capillaire des îlots, en raison des contrôles dans le système respiratoire. De plus, ces études n’ont pas de niveaux d’oxygène standardisés, ni ne fournissent de mesures en temps réel au niveau tissulaire des îlots.
D’autre part, la microfluidique d’oxygène peut dépasser ces limites en contrôlant l’oxygène via des réseaux de canaux gazeux. De plus, la microfluidique est compatible avec l’imagerie en direct pendant la modulation de l’oxygène, un exploit actuellement impossible avec les chambres hypoxiques standard. Un certain nombre de ces nouvelles approches microfluidiques utilisent la perméabilité aux gaz du polydiméthylsiloxane pour dissoudre les concentrations d’oxygène dans des microcanaux qui font circuler le milieu sur les cellules cibles9 à 14. Ces appareils ont également intégré plusieurs concentrations d’oxygène discrètes, des capteurs d’oxygène basés sur la fluorescence et même la génération chimique d’oxygène sur puce.
La microfluidique basée sur la solvatation liquide a du mal à maintenir des gradients stables et continus car elle dépend du mélange convectif qui est sensible aux conditions d’écoulement. En comparaison, la technique que nous utilisons ici se concentre sur la diminution de la voie de diffusion de l’administration d’oxygène. La solvatation gazeuse et l’écoulement de cisaillement sont éliminés en diffusant directement de l’oxygène à travers une membrane ensemencée de cellules ou de tissus d’îlots. Cela élimine la microfluidique supplémentaire nécessaire pour contrôler la solvatation et empêche les contraintes de cisaillement inutiles sur les îlots, qui peuvent elles-mêmes déclencher la libération d’insuline. Cette plateforme a été utilisée pour démontrer la régulation positive des espèces réactives de l’oxygène (ROS) aux extrêmes hyperoxiques et hypoxiques (2-97 %O2) dans la culture cellulaire1,15. En raison de l’apport direct d’oxygène et de l’élimination de l’écoulement de cisaillement, notre plateforme basée sur la diffusion fournit la solution microfluidique optimale pour l’étude de l’hypoxie des îlots de Langerhans.
Stimulation et surveillance multimodales
La microfluidique basée sur la diffusion apporte également des avantages supplémentaires lorsqu’elle est adaptée à l’étude de la microphysiologie des îlots de Langerhans. En utilisant une membrane comme barrière de diffusion, le liquide peut être isolé des modulations de l’oxygène, ce qui permet de contrôler les stimulations aqueuses du glucose indépendamment des stimulations hypoxiques. Cela crée une stimulation simultanée en forme de sandwich qui localise spatialement l’accouchement vers les îlots. De plus, comme le gaz est modulé temporellement via des micro-injecteurs informatisés, nous pouvons moduler numériquement la concentration d’oxygène de 21 à 0 % avec un temps transitoire inférieur à 60 secondes. Les contrôles dynamiques du microenvironnement de l’oxygène et du glucose au microscope permettent un protocole multimodal en temps réel qui ne serait pas possible ou extraordinairement lourd avec des chambres hypoxiques standard. À l’aide de ce dispositif, la signalisation calcique (Fura-AM), les potentiels mitochondriaux (rhodamine 123) et la cinétique de l’insuline (ELISA) ont été surveillés pour fournir une image complète de la réponse dynamique glucose-insuline en cas d’hypoxie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactif/Matériel</td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150/SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de cuisson numérique</td><td>PMC Dataplate</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>Lampe de polymérisation UV</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>Dow Chemical</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Baguette Corona</td><td>ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>Chambre à vide</td><td>Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>Microdistributeurs</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr><td>5 V et 20 V DC Power</td><td>Radio Shack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>National Instrument</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>Capteur d’oxygène</td><td>Ocean Optics</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>Fraction Collector</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&mu ; </td><td></td>l</tr><tr><td>Microscope à épifluorescence inversée</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 Sondes</td> moléculaires à colorant de fluorescence<td>, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123 Sondes</td> moléculaires à colorant de fluorescence<td>, Milieux de culture Life</td> Technologies <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes en silicone 30 po</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 po x 1/8 po</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes Eppendorf Fisher</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connecteurs en Y</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Connecteurs de seringue 1/16 po et 4 mm</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>femelle Connecteur Luer 1/16 po</td></tr><tr><td>Connecteurs droits</td><td>Cole-Parmer</td><td></td> Connecteur coudé <td>1/16 po</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 po</td></tr></tbody></table>

contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l&#39;oxygène à l&#39;islet plain

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Oxygénation simultanée et la surveillance de glucose stimulus-sécrétion de facteurs de couplage dans une seule technique est essentielle pour la modélisation états physiopathologiques de l&#39;îlot hypoxie, en particulier dans les environnements de transplantation. Techniques de la chambre hypoxique standard ne peuvent pas moduler les stimulations en même temps, ni assurer le suivi en temps réel des facteurs de couplage stimulus-sécrétion glucose. Pour répondre à ces difficultés, nous avons appliqué une technique microfluidique multicouche à intégrer à la fois aqueuse et modulations de phase de gaz par une membrane de diffusion. Cela crée un sandwich de stimulation autour des îlots microscaled sein du polydiméthylsiloxane transparent (PDMS) de l&#39;appareil, ce qui permet la surveillance des éléments d&#39;accouplement susmentionnés par microscopie à fluorescence. En outre, l&#39;entrée de gaz est commandé par une paire de microdispensers, en fournissant des modulations quantitatives, les sous-minute d&#39;oxygène entre 0-21%. Cette hypoxie intermittente est utilisée pour étudier un nouveau phénomène de l&#39;Islet préconditionnement. En outre, armés de microscopie multimodale, nous avons pu regarder calcium détaillée et K ATP dynamique de canal lors de ces événements hypoxiques. Nous envisageons l&#39;hypoxie microfluidique, en particulier cette technique à deux phases simultanément, comme un outil précieux pour l&#39;étude des îlots ainsi que de nombreux ex vivo des tissus.

La technique d'hypoxie des îlots pancréatiques repose sur la capacité de moduler simultanément les stimulations en phase aqueuse et en phase gazeuse dans la même chambre microfluidique, avec des transitoires à l'échelle de la minute. Figure 1 présente un résultat représentatif des a) stimulations doubles et b) modulations rapides mesurées à l'intérieur de la chambre d'îlots. La modulation en phase aqueuse, illustrée par l'introduction de fluorescéine dans la chambre, atteint l'équilibre après trois à qua...

Le contrôle microfluidique de l’oxygène confère plus que la commodité et la rapidité par rapport aux chambres hypoxiques pour les expériences biologiques. En particulier lorsqu’il est mis en œuvre par diffusion à travers une membrane, l’oxygène microfluidique peut fournir des modulations simultanées en phase liquide et gazeuse au niveau microscopique. Cette technique permet des expériences multiparamétriques dynamiques essentielles à l’étude de la physiopathologie des îlots de Langerhans.

Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l&#39;oxygène à l&#39;Islet Plain

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

L'objectif général de cette procédure est d'appliquer une hypoxie intermittente à l'échelle des minutes sur des ilots pancréatiques à l'échelle microscopique afin d'étudier les effets de préconditionnement. Cela est réalisé en fabriquant tout d'abord un dispositif microfluidique multimodal doté d'une membrane perméable aux gaz et mince. La deuxième étape consiste à créer un système informatisé de modulation de l'oxygène.Les œillets suivants sont soigneusement chargés dans le dispositif, puis les microfluidiques de liquide et d'oxygène sont connectées. La dernière étape consiste à synchroniser la microscopie avec les microfluidiques multimodales afin de visualiser les paramètres des œillets qui changent pendant la modulation de l'oxygène. En définitive, la technique de l'œillet en hypoxie intermittente est utilisée pour montrer que la réponse au glucose est clairement altérée en condition d'hypoxie.Bien que les modulations temporelles de l'hypoxie puissent entraîner les œillets à répondre avec moins d'altération. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la mesure de l'oxygène dissous ou l'utilisation d'une chambre hypoxique, est qu'ell

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Bioengineering

Bioingénierie

Un dispositif microfluidique périfusion îlot a été développé pour l'évaluation de la sécrétion d'insuline des îlots dynamiques multiples et simultanées imagerie de fluorescence de l'influx de calcium et mitochondrial changements potentiels.

Un système multi-paramétriques Islet périfusion dans un dispositif microfluidique périfusion

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Le but du présent protocole est de mesurer l’effet des changements induite par le glucose de la respiration mitochondriale en présence de composés naturels sur les cellules bêta intact 832/13 à l’aide de respirométrie haute résolution.

Haute résolution respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale des cellules bêta intactes en présence de composés naturels

Ici, nous présentons un protocole pour la formation image et la quantification de la dynamique du calcium dans les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules des isfètes pancréatiques. Les reporters fluorescents sont livrés dans la couche périphérique des cellules dans l'înet, qui est alors immobilisé et image, et l'analyse par cellule de la dynamique de l'intensité de fluorescence est effectuée.

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Ici, nous présentons un protocole pour produire des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle des cellules simples des îlots pancréatiques humains isolés utilisant une technologie microfluidique de séquençage d'ARN à base de gouttelettes.

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Ce protocole démontre la mesure précise et reproductible de la consommation d'oxygène dans les îlots pancréatiques non-humains de primate. Les techniques de chargement des îfles et le revêtement de la microplaque fournissent un cadre pour une mesure efficace de la respiration dans d'autres types de sphéroïdes cultivés.

Analyse de la consommation d'oxygène des primates non humains

Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.

Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure

Ce protocole décrit une méthode d’acquisition synchrone et de co-enregistrement d’événements de signalisation intracellulaire et de sécrétion d’insuline et de glucagon par des pseudo-îlots humains primaires en utilisant l’administration adénovirale d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), d’un détecteur de différence d’AMPc in situ (cADDis) et d’un système de micropérifusion.

Système de pseudo-îlots humains pour l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion hormonale

Ici, nous fournissons des détails sur la réalisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact comme technique supplémentaire pour évaluer la fonction pancréatique endocrine avec réduction des facteurs de confusion possibles.

Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact

Ce protocole présente une méthode de fabrication d’une puce microfluidique à double couche et d’analyse de la croissance microbienne sous des oscillations rapides de l’oxygène. Les performances de l’appareil ont été validées par la détection de l’oxygène dans les canaux fluides et la culture microbienne.

Création d’oscillations rapides de l’oxygène dans l’analyse de la croissance microbienne d’une cellule unique à l’aide d’un dispositif microfluidique à double couche

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Découvrez le contrôle microfluidique de l'oxygène pour moduler l'hypoxie intermittente dans les îlots pancréatiques. Cette technique permet une surveillance en temps réel et une livraison précise d'oxygène pour étudier la physiopathologie des îlots.

Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l'oxygène à l'Islet Plain

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