Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l'oxygène à l'Islet Plain

L’objectif global de cette procédure est d’appliquer une hypoxie intermittente à l’échelle des minutes à des œillets pancréatiques à l’échelle microscopique pour étudier les effets de préconditionnement. Ceci est accompli en fabriquant d’abord un dispositif microfluidique multimodal avec une fine membrane perméable aux gaz. La deuxième étape consiste à créer un système informatisé de modulation de l’oxygène.

Ensuite, les œillets sont soigneusement chargés dans l’appareil, puis la microfluidique de liquide et d’oxygène est connectée. La dernière étape consiste à coordonner la microscopie avec la microfluidique multimodale afin de visualiser les paramètres de l’œillet qui sont modifiés pendant la modulation de l’oxygène. En fin de compte, la technique de l’hypoxie intermittente à œillet est utilisée pour montrer que la réponse glycémique est clairement altérée en hypoxie.

Alors que les modulations temporelles de l’hypoxie peuvent entraîner les œillets à répondre avec moins d’altération. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’oxygène dissous ou l’utilisation d’une chambre hypoxique est sa précision. La concentration d’oxygène pourrait être délivrée aux paupières dans des intervalles de temps rapides et minuscules sans être soumise au stress de flux compliqués.

Il permet également un suivi en temps réel avec le sol et la microscopie. Ce master peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la transplantation d’Alli, telles que la définition des déficiences hypoxiques dans les sites de transplantation ou les régimes de préconditionnement pour améliorer les résultats de la greffe. Cette méthode peut donc donner un aperçu de l’hypoxie d’Alli.

Il peut également être appliqué à d’autres tissus et systèmes tels que le système nerveux central, les tissus cardiaques, le rein et d’autres organes de transplantation. La démonstration vidéo de cette méthode est essentielle car de nombreuses poignées de fabrication et d’œillet de l’appareil. Les étapes sont difficiles à apprendre en raison de la nature interdisciplinaire nouvelle de la technique, mais inhérentes à la difficulté ou à la familiarité de commencer par la fabrication de la couche de couverture du dispositif microfluidique.

Pour ce faire, versez le PDMS pré-mélangé DGA à une hauteur de 1,5 millimètre dans une boîte de Pétri vierge et faites-le durcir à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, fabriquez la couche microfluidique de glucose avec la chambre de profusion en enrobant par centrifugation deux couches de 350 microns d’épaisseur de SU 8 21 50 pour former une seule couche de 700 microns sur une plaquette de silicone de quatre pouces. Ensuite, exposez-le à la lumière UV à l’aide du masque photo de la couche microfluidique de glucose pour transférer le motif du microcanal sur la huitième couche SU.

Rincez la zone non exposée avec le révélateur SU eight. Ensuite, versez le PDMS pré-mélangé DGAs sur le MA jusqu’à une hauteur de trois millimètres et durcissez à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois durci, coupez la couche microfluidique de glucose pour lui donner forme et utilisez un poinçon de deux millimètres pour former les orifices d’entrée et de sortie, ainsi qu’un poinçon de huit millimètres de diamètre pour la chambre principale.

Ensuite, fabriquez le maître de micro-puits pour l’immobilisation des paupières en appliquant un revêtement par centrifugation d’une couche de 100 microns d’épaisseur de SU 8 2100 sur une plaquette de silicium propre de quatre pouces, puis utilisez la lithographie UV pour transférer le motif de micro-puits sur cette couche. Rincez les zones non exposées avec un révélateur lorsque le maître du micropuits est terminé. Ajoutez deux couches de 100 microns de PDMS en appliquant un revêtement par centrifugation à 900 tr/min pendant 30 secondes, puis un durcissement pendant 10 minutes à 80 degrés Celsius pour produire chaque couche.

Une fois terminé, perforez l’entrée de deux millimètres de diamètre dans les orifices de sortie. Enfin, fabriquez le master microfluidique gazeux en filant SU 8 2100 à 100 microns d’épaisseur comme dans la couche précédente, et transférez à nouveau les motifs microfluidiques gazeux à l’aide de la lithographie UV. Rincez la zone non exposée avec un révélateur.

Ensuite, versez une couche de PDMS de 1,5 millimètre d’épaisseur sur le maître microfluidique gazeux et durcissez à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Coupez ensuite le PDMS à l’aide de la lame de rasoir. Ensuite, perforez des orifices d’entrée et de sortie de deux millimètres de diamètre dans la couche de couverture pour les aligner avec l’endroit où ils se trouvent sur les autres couches pour lier les multiples couches ensemble.

Tout d’abord, préparez-les en nettoyant les surfaces avec du scotch, en les exposant à un arc Corona, puis en alignant les couches à la main dans l’ordre suivant. Tout d’abord, collez la membrane à la couche de gaz inférieure avec les micro-puits vers le haut. Ensuite, collez la couche microfluidique de glucose sur la membrane du micro-puits.

Enfin, collez les couches d’entrée et de sortie sur le dessus, encapsulant l’ensemble de l’ensemble. Aidez à former un lien serré en ajoutant un poids d’un kilogramme sur le dessus de l’ensemble et en le cuisant à 100 degrés Celsius pendant trois heures. Puis fuite.

Testez l’appareil en chargeant de l’eau dans la couche aqueuse, en immergeant l’appareil et en faisant circuler de l’air à travers la couche de gaz avec la seringue tout en recherchant des fuites. Enfin, stérilisez les dispositifs étanches en faisant passer 70 % d’éthanol à travers la couche aqueuse pendant une à deux minutes. Configurez les micro-distributeurs en connectant d’abord les fils de commande des micro-distributeurs aux unités d’entraînement incluses.

Connectez ensuite les pilotes à la carte d’E/S numérique aux ports correspondant à leurs commandes de vue de laboratoire. Ensuite, connectez les alimentations cinq volts et 20 volts CC à leurs contacts correspondants sur les unités d’entraînement et connectez l’E/S numérique à un ordinateur portable afin d’exécuter des codes de vue de laboratoire pour le contrôle du gaz, comme décrit dans l’annexe du protocole texte ci-joint. Connectez ensuite un micro-distributeur à de l’azote et l’autre à de l’air comprimé, tous deux contenant 5 % de dioxyde de carbone, et réglez les deux gaz sur deux PS. Je branche les sorties du distributeur dans une jonction en T avant d’entrer dans le dispositif microfluidique.

Ensuite, montez l’appareil sur la platine chauffée d’un microscope inversé avec 0 % et 21 % d’oxygène connectés à l’appareil. Ensuite, placez un capteur d’oxygène à fibre optique à la sortie du fluide de l’appareil pour mesurer l’oxygène dissous dans la sortie en temps réel. Connectez ensuite l’appareil à une pompe péristaltique et commencez à faire circuler l’eau à travers l’appareil à 250 microlitres par minute.

Caractérisez la réponse transitoire de la modulation de l’oxygène en faisant alterner les micro-distributeurs entre 5 et 21 % d’oxygène. Connectez une pompe péristaltique au dispositif microfluidique et positionnez le tube sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius pour réchauffer le fluide avant qu’il n’entre dans le dispositif microfluidique. Connectez également l’orifice de sortie de la microfluidique de glucose à un collecteur de fractions pour commencer à disséquer les souris noires C 57 et isoler les œillets pancréatiques par digestion de la collagénase et séparation du gradient de densité Fccal comme décrit dans les vidéos suivantes disponibles auprès de JoVE une fois isolé.

Incuber les œillets dans un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS, 1 % de pénicilline streptomycine et 20 tas millimolaires dans des boîtes de Pétri pendant 24 à 48 heures. Utilisez les œillets dans les deux jours pour garantir des résultats cohérents. Ensuite, préparez un tampon de bicarbonate de Krebs Ringer frais comme décrit dans le protocole de texte ci-joint avec une solution contenant deux millimolaires de glucose et une autre contenant 14 millimolaires de glucose.

Réchauffez les solutions dans des tubes coniques de 50 millilitres en les plaçant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, préparez la coloration pour les œillets isolés en ajoutant cinq micromolaires de 4:02 AM et de DMSO et 2,5 micromolaires de RH 1 23 et d’éthanol à 100 % à deux millilitres de tampon Krebs contenant deux millimolaires de glucose. Ensuite, prélevez des œillets avec une pipette de 10 microlitres et incubez-les dans la teinture pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Une fois colorés, chargez environ 20 œillets dans l’appareil via l’entrée du microcanal de glucose. Dirigez les œillets dans la chambre en amorçant le tampon de la sortie dans l’entrée. Ensuite, perfuser les œillets et tamponner pendant 10 minutes pour éliminer l’excès de colorants.

Tout d’abord, prélevez deux tampons millimolaires de bicarbonate de sonnerie Krebs dans le système pendant cinq minutes pour établir une base d’impulsion normale. Stimulez ensuite la chambre avec le tampon de glucose de 14 millimolaires pendant 15 minutes, suivi d’un lavage de 15 minutes avec le tampon de glucose de deux millimolaires. Au cours de ce processus, enregistrez les 510 nanomètres pour deux émissions en excitant le régime 340 nanomètres et 380 nanomètres.

Enregistrez également l’émission 530 de RH 1 23 en excitant le colorant à 480 nanomètres. Pour minimiser les perturbations convectives pendant la modulation de l’oxygène, appliquez un flux tampon pendant les étapes de stimulation et de lavage, et assurez-vous d’arrêter le flux dans les autres étapes pendant le test. Collectez l’effluence de la sortie de glucose à des intervalles d’une minute pour l’utiliser dans une analyse supplémentaire En utilisant l’approche microfluidique montrée dans cette vidéo, il est possible de réguler rapidement le pourcentage d’oxygène circulant au-delà de la fine membrane PDMS à l’aide des micro-injecteurs informatisés.

Voici un exemple de cette modulation allant d’une minute à six minutes. Il est également possible de fournir des modulations quantitatives sub-minute de l’oxygène entre deux et 8,5 parties par million en fournissant de l’oxygène entre 5 et 21 %. La ligne bleue indique le pourcentage d’oxygène fourni et la ligne verte est l’oxygène dissous résultant en parties par million. Lorsque ce cycle est appliqué pour créer une hypoxie intermittente au niveau des œillets, on peut observer les avantages du préconditionnement des œillets contre l’hypoxie par rapport au pouls normoxique irrégulier en observant l’amélioration du rapport après traitement des effets de l’hypoxie et de l’hypoxie intermittente peut être observé dans le dépassement et l’amortissement des oscillations des transitoires calciques, comme indiqué ici en bleu, est la réponse normoxique.

En rouge se trouve la réponse hypoxique, et la ligne verte est la réponse hypoxique conditionnée. La mesure du calcium, du potentiel mitochondrial et de l’insuline est montrée ici. Ce sont les résultats de la microscopie fluorescente en temps réel et du test EISA hors puce utilisant l’effluence microfluidique du système, ceux-ci commencent à construire une vue multimodale de la réponse gluco-insuline sous transitoire hypoxique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée, un jour pour la fabrication du dispositif et pour isoler les cellules de la paupière et un jour pour les expériences de la paupière elles-mêmes. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier la concentration d’oxygène délivrée en mariant l’émetteur de gaz de l’appareil après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs de la sortie fœtale et d’autres microphysiologies tissulaires pour explorer comment l’hypoxie et les schémas temporaires d’oxygène peuvent affecter des maladies comme le diabète, les troubles cardiovasculaires et neurologiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de contrôler la modulation de l’oxygène, de manipuler les micro-tissus et de générer des mesures reproductibles et significatives de l’hypoxie tissulaire à l’aide de dispositifs microfluidiques multimodaux.