Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l'oxygène à l'Islet Plain

L'objectif général de cette procédure est d'appliquer une hypoxie intermittente à l'échelle des minutes sur des ilots pancréatiques à l'échelle microscopique afin d'étudier les effets de préconditionnement. Cela est réalisé en fabriquant tout d'abord un dispositif microfluidique multimodal doté d'une membrane perméable aux gaz et mince. La deuxième étape consiste à créer un système informatisé de modulation de l'oxygène.

Les œillets suivants sont soigneusement chargés dans le dispositif, puis les microfluidiques de liquide et d'oxygène sont connectées. La dernière étape consiste à synchroniser la microscopie avec les microfluidiques multimodales afin de visualiser les paramètres des œillets qui changent pendant la modulation de l'oxygène. En définitive, la technique de l'œillet en hypoxie intermittente est utilisée pour montrer que la réponse au glucose est clairement altérée en condition d'hypoxie.

Bien que les modulations temporelles de l'hypoxie puissent entraîner les œillets à répondre avec moins d'altération. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la mesure de l'oxygène dissous ou l'utilisation d'une chambre hypoxique, est qu'elle permet une livraison précise de la concentration d'oxygène aux paupières selon des intervalles de temps rapides et minuscules, sans contrainte de cisaillement due à des écoulements complexes.

Il permet également une surveillance en temps réel associant fluorimétrie et microscopie. Ce protocole peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la greffe Alli, telles que la définition des atteintes hypoxiques au niveau des sites de greffe ou l'optimisation de régimes de préconditionnement afin d'améliorer les résultats de la greffe. Ainsi, cette méthode peut fournir des informations sur l'hypoxie Alli.

Il peut également être appliqué à d'autres tissus et systèmes, tels que le système nerveux central, les tissus cardiaques, le rein et d'autres organes destinés à la greffe. La démonstration vidéo de cette méthode est essentielle, car de nombreuses étapes concernant la fabrication du dispositif et la manipulation de l'œillet sont difficiles à apprendre en raison du caractère novateur et interdisciplinaire de la technique, mais deviennent inhérentes une fois les gestes maîtrisés. Commencez par fabriquer la couche supérieure du dispositif microfluidique.

Pour réaliser cette étape, versez le PDMS pré-mélangé contenant les DGAs dans une boîte de Pétri vide sur une hauteur de 1,5 millimètre et polymérisez-le à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, fabriquez la couche microfluidique de glucose avec le moule maître de la chambre de perfusion en appliquant par centrifugation deux couches de 350 microns d'épaisseur de SU 8 21 50 afin de former une couche unique de 700 microns sur une plaquette de silicium de quatre pouces. Puis exposez-la à la lumière UV à l’aide du masque photolithographique de la couche microfluidique de glucose pour transférer le motif des microcanaux sur la couche de SU 8.

Rincez la zone non exposée avec le révélateur SU. Ensuite, versez le PDMS pré-mélangé DGA sur le MA jusqu'à une hauteur de trois millimètres et polymérisez à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois polymérisé, découpez la couche microfluidique de glucose selon la forme souhaitée et utilisez un poinçon de deux millimètres pour créer les orifices d'entrée et de sortie, ainsi qu'un poinçon de huit millimètres de diamètre pour la chambre principale.

Ensuite, fabriquez le moule maître des micropuits pour l'immobilisation de la paupière en appliquant par centrifugation une couche de 100 microns d'épaisseur de SU 8 2100 sur une plaquette de silicium propre de quatre pouces, puis utilisez la lithographie UV pour transférer le motif des micropuits sur cette couche. Rincez les zones non exposées avec un révélateur une fois le moule maître des micropuits terminé. Ajoutez deux couches de 100 microns de PDMS en appliquant par centrifugation à 900 tr/min pendant 30 secondes, puis en durcissant pendant 10 minutes à 80 degrés Celsius pour produire chaque couche.

Une fois terminé, percer les orifices d'entrée et de sortie de deux millimètres de diamètre. Enfin, fabriquer le modèle maître de la microfluidique à gaz en déposant par rotation du SU 8 2100 sur une épaisseur de 100 microns, comme pour la couche précédente, puis transférer à nouveau les motifs de microfluidique à gaz par lithographie UV. Rincer la zone non exposée avec le révélateur.

Ensuite, versez une couche de 1,5 millimètre d'épaisseur de PDMS sur le moule maître de la microfluidique gazeuse et polymérisez à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Puis découpez le PDMS selon la forme souhaitée à l’aide de la lame de rasoir. Ensuite, percez des orifices d’entrée et de sortie de deux millimètres de diamètre dans la couche de couverture afin qu’ils s’alignent avec ceux présents sur les autres couches, dans le but d’assembler les différentes couches entre elles.

Tout d'abord, préparez-les en nettoyant les surfaces avec du ruban adhésif, en les exposant à un arc Corona, puis en alignant manuellement les couches dans l'ordre suivant. Commencez par fixer la membrane à la couche inférieure de gaz, les microcavités orientées vers le haut. Ensuite, fixez la couche microfluidique de glucose sur la membrane des microcavités.

Enfin, fixer la couche d'entrée et de sortie sur le dessus, encapsulant ainsi l'ensemble du dispositif. Faciliter la formation d'une liaison étanche en plaçant un poids d'un kilogramme sur l'assemblage et en le faisant cuire à 100 degrés Celsius pendant trois heures. Puis vérifier les fuites.

Testez le dispositif en chargeant de l'eau dans la couche aqueuse, en immergeant le dispositif et en faisant circuler de l'air à travers la couche gazeuse à l'aide de la seringue, tout en recherchant d'éventuelles fuites. Enfin, stérilisez les dispositifs sans fuite en faisant passer de l'éthanol à 70 % à travers la couche aqueuse pendant une à deux minutes. Configurez les micro-distributeurs en connectant d'abord les câbles de commande des micro-distributeurs aux unités pilotes fournies.

Ensuite, connectez les pilotes à la carte d'entrées-sorties numériques sur les ports correspondant à leurs commandes LabVIEW. Puis, reliez les alimentations électriques continues de cinq volts et de 20 volts à leurs contacts respectifs sur les unités de commande, et connectez la carte d'E/S numérique à un ordinateur portable afin d'exécuter les codes LabVIEW pour la commande des gaz, comme décrit dans l'annexe du protocole texte associé. Connectez ensuite un micro-distributeur à l'azote et l'autre à l'air comprimé, chacun contenant 5 % de dioxyde de carbone, et réglez les deux gaz à deux PS.I. Raccordez les sorties des distributeurs en un raccord en T avant qu'elles n'entrent dans le dispositif microfluidique.

Ensuite, fixez l'appareil sur la platine chauffante d'un microscope inversé avec 0 % et 21 % d'oxygène reliés à l'appareil. Placez ensuite un capteur d'oxygène à fibre optique à la sortie du fluide de l'appareil pour mesurer en temps réel l'oxygène dissous dans l'effluent. Puis, reliez l'appareil à une pompe péristaltique et commencez à faire circuler de l'eau à travers l'appareil à un débit de 250 microlitres par minute.

Caractérisez la réponse transitoire de la modulation de l'oxygène en faisant varier les microdistributeurs entre 5 et 21 % d'oxygène. Connectez une pompe péristaltique au dispositif microfluidique et positionnez le tube au-dessus d'une plaque chauffante réglée à 37 degrés Celsius afin de réchauffer le fluide avant qu'il n'entre dans le dispositif microfluidique. Connectez également le port de sortie des microfluidiques de glucose à un collecteur fractionné pour commencer à disséquer des souris C57 Black Six et isoler les ilots pancréatiques par digestion à la collagénase et séparation par gradient de densité Ficoll, comme décrit dans les vidéos suivantes disponibles sur JoVE, une fois l'isolement effectué.

Incuber les lamelles dans du milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine et 20 millimolaire de HEPES, dans des boîtes de Pétri pendant 24 à 48 heures. Utiliser les lamelles dans les deux jours suivant leur préparation afin d'obtenir des résultats reproductibles. Ensuite, préparer un tampon fraîchement fait de Krebs-Ringer bicarbonate selon le protocole décrit dans le texte accompagnant, composé d'une solution contenant 2 millimolaire de glucose et d'une autre contenant 14 millimolaire de glucose.

Chauffer les solutions dans des tubes coniques de 50 millilitres en les plaçant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Préparer ensuite la solution de coloration pour les ocelles isolés en ajoutant cinq micromolaires de 4:02 AM et de DMSO et 2,5 micromolaires de RH 1 23 et d'éthanol à 100 % à deux millilitres de tampon de Krebs contenant deux millimolaires de glucose. Ensuite, prélever les ocelles à l’aide d’une pipette de 10 microlitres et les incuber dans la solution de coloration pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Une fois colorés, charger environ 20 œillets dans le dispositif par l'entrée du microcanal de glucose. Diriger les œillets vers la chambre en amorçant le tampon depuis la sortie vers l'entrée. Ensuite, perfuser les œillets et le tampon pendant 10 minutes afin d'éliminer les colorants en excès.

Tout d'abord, faites circuler un tampon bicarbonate de Krebs à deux millimolaires dans le système pendant cinq minutes afin d'établir une ligne de base normale du pouls. Ensuite, stimulez la chambre avec le tampon de glucose à 14 millimolaires pendant 15 minutes, suivi d'un rinçage de 15 minutes avec le tampon de glucose à deux millimolaires. Pendant ce processus, enregistrez l'émission à 510 nanomètres en excitant à 340 nanomètres et 380 nanomètres.

En outre, enregistrez l'émission à 530 de RH 1 23 en excitant le colorant à 480 nanomètres. Pour minimiser les perturbations convectives durant la modulation de l'oxygène, appliquez un flux tampon pendant les étapes de stimulation et de lavage, et veillez à arrêter le flux lors des autres étapes du test. Collectez l'effluent provenant de la sortie de glucose à intervalles d'une minute pour une analyse complémentaire. Grâce à l'approche microfluidique illustrée dans cette vidéo, il est possible de réguler rapidement le pourcentage d'oxygène circulant près de la fine membrane en PDMS à l'aide d'injecteurs micro-informatisés.

Voici un exemple de cette modulation allant d'une minute à six minutes. Il est également possible d'obtenir des modulations quantitatives de moins d'une minute en ajustant la concentration d'oxygène entre deux et 8,5 parties par million, en délivrant de l'oxygène entre 5 et 21 %. La ligne bleue indique le pourcentage d'oxygène délivré, et la ligne verte représente la concentration d'oxygène dissous résultante, exprimée en parties par million. Lorsque ce cycle est appliqué pour induire une hypoxie intermittente au niveau des orifices, on peut observer les effets bénéfiques d'une préconditionnement de ces orifices contre l'hypoxie, comparé à une impulsion normoxique irrégulière, en examinant le rapport for amélioré après traitement. Les effets de l'hypoxie et de l'hypoxie intermittente peuvent être observés au niveau du dépassement et de l'amortissement des oscillations des transitoires calciques ; ici, la réponse normoxique est indiquée en bleu.

En rouge figure la réponse à l'hypoxie, et la ligne verte représente la réponse à l'hypoxie conditionnée. La mesure du calcium, du potentiel mitochondrial et de l'insuline est présentée ici. Il s'agit des résultats obtenus par microscopie fluorescente en temps réel et par dosage EISA hors puce utilisant l'effluent microfluidique du système. Ensemble, ces données commencent à établir une vue multiforme de la réponse glucose-insuline en conditions d'hypoxie transitoire.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée : un jour pour la fabrication du dispositif et l'isolement des cellules de la paupière, et un jour pour les expériences sur la paupière elles-mêmes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier la concentration d'oxygène délivrée en calibrant le débitmètre de gaz du dispositif après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie microtissulaire fœtale et d'autres tissus pour explorer comment l'hypoxie et les profils transitoires d'oxygène peuvent influencer des maladies telles que le diabète, les troubles cardiovasculaires et les troubles neurologiques.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de contrôler la modulation de l'oxygène, de manipuler des micro-tissus et de générer des mesures reproductibles et significatives de l'hypoxie tissulaire à l'aide de dispositifs microfluidiques multimodaux.