Name: Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de loxygène à lIslet Plain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Découvrez le contrôle microfluidique de l'oxygène pour moduler l'hypoxie intermittente dans les îlots pancréatiques. Cette technique permet une surveillance en temps réel et une livraison précise d'oxygène pour étudier la physiopathologie des îlots.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE) et Chicago Diabetes Project.

1. Préparation des îlots de souris
<ol>
	<li>Disséquer des souris C57BL/6 et isoler les îlots par digestion par collagénase et séparation par gradient de densité de Ficoll. (Reportez-vous aux articles de JOVE référencés en2,3).</li>
	<li>Incuber les îlots dans un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine et 20 mM d’HEPES dans des boîtes de Pétri (37 °C, 5 % de CO2). Après l’isolement, cultiver les îlots pendant 24 heures avant d’être utilisé dans des expériences. Utilisez les îlots dans un délai de 1 à 2 jours pour garantir des résultats cohérents.</li>
</ol>
2. Fabrication de la plate-forme microfluidique
<ol>
	<li>Générez les géométries de microstructure sur des photomasques transparents pour chaque couche du dispositif : 1) entrée et sortie, 2) couche microfluidique de glucose avec chambre de périfusion (8 mm de diamètre x 3 mm, 150 μl), 3) membrane de 200 μm avec micropuits (500 μm de diamètre, 100 μm de profondeur) et 4) couches microfluidiques gazeuses.</li>
	<li>Pour fabriquer les couches d’entrée et de sortie, versez du PDMS dégazé et prémélangé à une hauteur de 1,5 mm dans une boîte de Pétri vierge et durcissez à 80 °C pendant 2 heures. Perforez des orifices d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre.</li>
	<li>Pour fabriquer la couche microfluidique de glucose, faites tourner deux couches de 350 μm de SU8-2150 pour former une seule couche de 700 μm sur une plaquette de silicium de 4 pouces.
	<ol>
		<li>Exposez la lumière UV à travers le photomasque approprié pour transférer le motif à microcanaux sur le SU8 après le développement, produisant un master de 700 μm de haut.</li>
		<li>Versez le PDMS dégazé et prémélangé sur ce master à une hauteur de 3 mm et durcissez à 80 °C pendant 2 h. Coupez ce PDMS à l’aide d’une lame de rasoir.</li>
		<li>Perforez les ports d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre ainsi que la chambre de 8 mm de diamètre.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour fabriquer la membrane de 200 μm avec des micropuits, faites pivoter SU8-2100 à 100 μm. Appliquez la même lithographie UV pour transférer les motifs de micropuits sur ce master de 100 μm de haut.
	<ol>
		<li>Essorez le PDMS dégazé et prémélangé sur ce maître à 900 tr/min pendant 30 secondes et durcissez à 80 °C pendant 10 min. Faites tourner une deuxième couche sur la première en utilisant les mêmes conditions, ce qui permet d’obtenir une membrane PDMS de 200 μm contenant des motifs de micropuits.</li>
		<li>Perforez des ports d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre à travers cette membrane</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour fabriquer la couche microfluidique gazeuse, faites pivoter SU8-2100 à 100 μm. Appliquez la même lithographie UV pour transférer des motifs microfluidiques gazeux sur ce master de 100 μm de haut.
	<ol>
		<li>Versez le PDMS dégazé et prémélangé sur ce master à une hauteur de 1,5 mm et durcissez à 80 °C pendant 2 h. Coupez le PDMS à l’aide d’une lame de rasoir.</li>
		<li>Perforez des ports d’entrée/sortie de 2 mm de diamètre à travers cette couche</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour coller les multiples couches, préparez-les en les nettoyant avec du scotch, en les exposant à l’arc corona, puis en les alignant à la main dans l’ordre suivant.
	<ol>
		<li>Collez la membrane à la couche gazeuse inférieure avec les micropuits vers le haut.</li>
		<li>Collez le glucose microfluidique sur la membrane du micropuits.</li>
		<li>Collez les couches d’entrée et de sortie sur le dessus, encapsulant l’ensemble de l’ensemble.</li>
		<li>Renforcez le collage en ajoutant 1 kg de poids sur le dessus et en cuisant à 100 °C pendant 3 heures.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testez l’étanchéité de l’appareil terminé en chargeant de l’eau dans la couche aqueuse, puis en immergeant l’ensemble de l’appareil sous l’eau. Ensuite, faites circuler l’air à travers la couche de gaz avec une seringue vide.</li>
	<li>Stérilisez les dispositifs étanches avec de l’éthanol à 70 % à travers la couche aqueuse, puis rincez-les avec un tampon PBS, dans lequel le dispositif est stocké à 4 °C jusqu’à son utilisation.</li>
</ol>
3. Configuration du microdistributeur
<ol>
	<li>Procurez-vous 2 microdistributeurs, des alimentations 5 V et 20 V CC et une carte d’E/S numérique pour construire la configuration de mélange et de distribution d’oxygène.
	<ol>
		<li>Connectez les fils de commande des microdistributeurs aux unités d'entraînement incluses.</li>
		<li>Connectez les drivers à la carte d’E/S numérique aux ports correspondant aux commandes Labview.</li>
		<li>Connectez les alimentations 5 V et 20 V aux contacts correspondants sur les unités d’entraînement.</li>
		<li>Connectez les E/S numériques à un ordinateur portable pour exécuter les codes Labview pour le contrôle des gaz (Annexe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Connectez un microdistributeur à de l’azote tandis qu’un autre à de l’air comprimé, tous deux contenant 5 % de CO2. Réglez les deux gaz à 2 psi. Branchez les sorties des distributeurs dans une jonction en T avant d'entrer dans le dispositif microfluidique.</li>
	<li>À l’aide d’un appareil testé d’étanchéité, caractérisez la réponse transitoire de la modulation de l’oxygène en faisant fonctionner les microdistributeurs entre 5 et 21 % d’oxygène, tout en mesurant l’oxygène dissous dans l’eau à l’aide d’un capteur d’oxygène à fibre optique (voir la liste des équipements et les résultats représentatifs).</li>
</ol>
4. Installation à la microscopie
<ol>
	<li>Montez l’appareil sur la platine chauffée du microscope inversé.</li>
	<li>Connectez les gaz 0 % et 21 % O2 à l’appareil et calibrez avec le capteur d’oxygène.</li>
	<li>Connectez l’orifice de sortie de la microfluidique de glucose à un collecteur de fractions.</li>
	<li>Préparez le tampon bicarbonaté Krebs Ringer (KRB) : 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2·2H2O, 1,2 mM MgSO4·7H2O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40, 2 mM de glucose basal et 5 % de FBS.</li>
	<li>Préparez deux solutions tampons contenant respectivement 2 mM et 14 mM de glucose dans des tubes coniques de 50 ml baignés dans un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Connectez une pompe péristaltique pour aspirer un tampon à 250 μl/min dans le tube. Faire couler le tube sur une plaque chauffante à 37 °C avant d’entrer dans le dispositif microfluidique.</li>
	<li>Pour colorer les îlots, ajoutez du Fura-2 AM dans du DMSO et du Rh123 dans de l’éthanol à 100 % à 2 ml de KRB pour atteindre des concentrations finales de colorant de 5 μM et 2,5 μM, respectivement.</li>
	<li>Prélever les îlots à l’aide d’une pipette de 10 μl et incuber dans des colorants pendant 30 min à 37 °C.</li>
	<li>Chargez environ 20 îlots dans l’appareil via l’entrée du microcanal de glucose. Dirigez les îlots dans la chambre en amorçant le tampon de la sortie dans l’entrée.</li>
	<li>Perfuser les îlots dans un tampon pendant 10 min pour éliminer l’excès de colorants.</li>
</ol>
5. Exécution de la stimulation simultanée de l’oxygène et du glucose
<ol>
	<li>Administrer une impulsion de stimulation du glucose avec 5 min de base établie par KRB2, suivie de 15 min de stimulation 14 mM, puis laver pendant 15 min dans KRB2.</li>
	<li>Enregistrez une longueur d’onde d’excitation de 340/380 nm pour Fura-2 et une émission de 534 pour Rh123.</li>
	<li>Effectuer des mesures d’une impulsion normale (14 mM normoxique) avant chaque expérience.</li>
	<li>Pour la modulation de l’oxygène (hypoxie/hypoxie intermittente), n’appliquez un débit tampon que pendant les étapes de stimulation et de lavage et aucun débit dans les autres étapes, afin de minimiser les perturbations convectives.</li>
	<li>Prélever les effluents de la sortie du glucose à des intervalles de 1 minute pour le dosage de l’insuline ELISA.</li>
</ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les multiples modalités intégrées dans cette technique d’hypoxie des îlots présentent plusieurs points notés ici pour le dépannage. Tout d’abord, les îlots isolés continuent de se dégrader et de se désintégrer en culture en raison des enzymes digestives des cellules acineuses. Il est donc essentiel de normaliser les expériences jusqu’à 1 à 2 jours après l’isolement des îlots de Langerhans pour obtenir des résultats cohérents. Deuxièmement, l’écoulement aqueux a été arrêté pendant l’hypoxie et l’hypoxie intermittente pour...

L’hypoxie dynamique est importante en biologie, en particulier pour les greffes d’îlots
L’hypoxie dynamique est un paramètre physiologique et physiopathologique important dans de nombreux tissus biologiques. Le changement d’oxygène, par exemple, est un puissant signal de développement dans l’angiogenèse. De plus, les modèles spatiaux et temporels de l’hypoxie modulent HIF1-alpha et jouent un rôle dans des maladies comme le cancer du pancréas. L’hypoxie est également un facteur de confusion affectant les résultats de la greffe d’îlots. Récemment, des oscillations temporelles de l’hypoxie, ou hypoxie intermittente (IH), ont démontré des avantages dans le « préconditionnement » des îlots1. Cependant, les effets de l'hypoxie statique et transitoire sur la physiologie des îlots pancréatiques n'ont pas encore été bien compris ou étudiés, principalement en raison du manque d'outils appropriés pour contrôler le microenvironnement des îlots.
Les îlots sont bien vascularisés in vivo
Les îlots pancréatiques sont des agrégats sphéroïdaux de 50 à 400 μm de cellules endocrines, y compris les cellules bêta et les cellules alpha qui sont responsables de l’homéostasie du glucose. Lorsque les îlots sont exposés à du glucose stimulateur dans le sang, l’absorption et la glycolyse entraînent une production d’ATP, ce qui ouvre les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP) et entraîne un afflux de calcium qui déclenche l’exocytose des granules d’insuline. L’oxygène est important pour piloter ce processus fortement métabolique et la sécrétion d’insuline est considérablement influencée par la dynamique du flux sanguin et de l’approvisionnement en oxygène en plus des gradients de glucose. Les îlots de Langerhans exécutent facilement cette réponse glucose-insuline in vivo car ils sont fortement irréguliers dans le pancréas, chacun à moins d’une longueur de cellule d’un vaisseau capillaire. Cependant, le réseau dense de capillaires intra-îlots est éliminé par la collagénase lors de l’isolement des îlots2,3. Par conséquent, les réserves d’oxygène et de nutriments sont limitées à un périmètre de 100 μm en raison des limites de diffusion.
Les techniques actuelles ont un succès limité dans la recréation du microenvironnement des îlots de Langerhans
La recréation de la dynamique native de l'oxygène et du glucose des îlots, essentielle à la modélisation des conditions physiologiques et physiopathologiques, est difficile à réaliser avec des chambres hypoxiques standard qui nécessitent un débit élaboré et manquent de surveillance continue des fonctions des îlots. De plus, les traitements de transplantation pour le diabète de type I exposent des îlots isolés à une hypoxie dans le système portehépatique 4 qui a une pO2 beaucoup plus faible (<2 %, 5-15 mmHg) par rapport au pancréas physiologique (5,6 %, 40 mmHg). Après la greffe, les greffons d’îlots mettent deux semaines ou plus à être revascularisés. Il a été démontré que l'exposition hypoxique altère le mécanisme de couplage glucose-insuline des îlots. Parmi les facteurs de couplage stimulus-sécrétion, la signalisation calcique, les potentiels mitochondriaux et la cinétique de l’insuline peuvent être facilement surveillés à l’aide de la microfluidique. Notre précédente technique microfluidique a démontré cette surveillance en temps réel avec une modulation précise du microenvironnement aqueux autour de l’îlotunique 5,6. Cependant, la quantification de l'insuffisance hypoxique des îlots est entravée par l'absence de techniques de stimulation et de surveillance simultanées. Par conséquent, la combinaison du contrôle microfluidique de l’oxygène et de la surveillance des îlots pancréatiques peut améliorer les études d’hypoxie des îlots pancréatiques.
Microfluidics peut recréer et moduler le microenvironnement aqueux et oxygéné
La technique standard pour les études d’hypoxie tissulaire et de culture a été basée sur des chambres hypoxiques. En général, les chambres hypoxiques fournissent des concentrations d’oxygène uniques avec des temps d’équilibre en ~10-30 min, incompatibles avec l’hypoxie dynamique à l’échelle de la minute. Deux études récentes ont utilisé de petites chambres personnalisées pour l’exposition intermittente à l’hypoxie sur des souris entières, avec des résultats contradictoires sur la réponse insulinique induite par le glucose7,8. Gardez à l’esprit qu’au niveau de l’ensemble de l’animal, l’oxygène respiré n’est pas directement traduit en pO2 capillaire des îlots, en raison des contrôles dans le système respiratoire. De plus, ces études n’ont pas de niveaux d’oxygène standardisés, ni ne fournissent de mesures en temps réel au niveau tissulaire des îlots.
D’autre part, la microfluidique d’oxygène peut dépasser ces limites en contrôlant l’oxygène via des réseaux de canaux gazeux. De plus, la microfluidique est compatible avec l’imagerie en direct pendant la modulation de l’oxygène, un exploit actuellement impossible avec les chambres hypoxiques standard. Un certain nombre de ces nouvelles approches microfluidiques utilisent la perméabilité aux gaz du polydiméthylsiloxane pour dissoudre les concentrations d’oxygène dans des microcanaux qui font circuler le milieu sur les cellules cibles9 à 14. Ces appareils ont également intégré plusieurs concentrations d’oxygène discrètes, des capteurs d’oxygène basés sur la fluorescence et même la génération chimique d’oxygène sur puce.
La microfluidique basée sur la solvatation liquide a du mal à maintenir des gradients stables et continus car elle dépend du mélange convectif qui est sensible aux conditions d’écoulement. En comparaison, la technique que nous utilisons ici se concentre sur la diminution de la voie de diffusion de l’administration d’oxygène. La solvatation gazeuse et l’écoulement de cisaillement sont éliminés en diffusant directement de l’oxygène à travers une membrane ensemencée de cellules ou de tissus d’îlots. Cela élimine la microfluidique supplémentaire nécessaire pour contrôler la solvatation et empêche les contraintes de cisaillement inutiles sur les îlots, qui peuvent elles-mêmes déclencher la libération d’insuline. Cette plateforme a été utilisée pour démontrer la régulation positive des espèces réactives de l’oxygène (ROS) aux extrêmes hyperoxiques et hypoxiques (2-97 %O2) dans la culture cellulaire1,15. En raison de l’apport direct d’oxygène et de l’élimination de l’écoulement de cisaillement, notre plateforme basée sur la diffusion fournit la solution microfluidique optimale pour l’étude de l’hypoxie des îlots de Langerhans.
Stimulation et surveillance multimodales
La microfluidique basée sur la diffusion apporte également des avantages supplémentaires lorsqu’elle est adaptée à l’étude de la microphysiologie des îlots de Langerhans. En utilisant une membrane comme barrière de diffusion, le liquide peut être isolé des modulations de l’oxygène, ce qui permet de contrôler les stimulations aqueuses du glucose indépendamment des stimulations hypoxiques. Cela crée une stimulation simultanée en forme de sandwich qui localise spatialement l’accouchement vers les îlots. De plus, comme le gaz est modulé temporellement via des micro-injecteurs informatisés, nous pouvons moduler numériquement la concentration d’oxygène de 21 à 0 % avec un temps transitoire inférieur à 60 secondes. Les contrôles dynamiques du microenvironnement de l’oxygène et du glucose au microscope permettent un protocole multimodal en temps réel qui ne serait pas possible ou extraordinairement lourd avec des chambres hypoxiques standard. À l’aide de ce dispositif, la signalisation calcique (Fura-AM), les potentiels mitochondriaux (rhodamine 123) et la cinétique de l’insuline (ELISA) ont été surveillés pour fournir une image complète de la réponse dynamique glucose-insuline en cas d’hypoxie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactif/Matériel</td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150/SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de cuisson numérique</td><td>PMC Dataplate</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>Lampe de polymérisation UV</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>Dow Chemical</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Baguette Corona</td><td>ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>Chambre à vide</td><td>Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>Microdistributeurs</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr><td>5 V et 20 V DC Power</td><td>Radio Shack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>National Instrument</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>Capteur d’oxygène</td><td>Ocean Optics</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>Fraction Collector</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&mu ; </td><td></td>l</tr><tr><td>Microscope à épifluorescence inversée</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 Sondes</td> moléculaires à colorant de fluorescence<td>, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123 Sondes</td> moléculaires à colorant de fluorescence<td>, Milieux de culture Life</td> Technologies <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes en silicone 30 po</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 po x 1/8 po</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes Eppendorf Fisher</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connecteurs en Y</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Connecteurs de seringue 1/16 po et 4 mm</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>femelle Connecteur Luer 1/16 po</td></tr><tr><td>Connecteurs droits</td><td>Cole-Parmer</td><td></td> Connecteur coudé <td>1/16 po</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 po</td></tr></tbody></table>

contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l&#39;oxygène à l&#39;islet plain

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Oxygénation simultanée et la surveillance de glucose stimulus-sécrétion de facteurs de couplage dans une seule technique est essentielle pour la modélisation états physiopathologiques de l&#39;îlot hypoxie, en particulier dans les environnements de transplantation. Techniques de la chambre hypoxique standard ne peuvent pas moduler les stimulations en même temps, ni assurer le suivi en temps réel des facteurs de couplage stimulus-sécrétion glucose. Pour répondre à ces difficultés, nous avons appliqué une technique microfluidique multicouche à intégrer à la fois aqueuse et modulations de phase de gaz par une membrane de diffusion. Cela crée un sandwich de stimulation autour des îlots microscaled sein du polydiméthylsiloxane transparent (PDMS) de l&#39;appareil, ce qui permet la surveillance des éléments d&#39;accouplement susmentionnés par microscopie à fluorescence. En outre, l&#39;entrée de gaz est commandé par une paire de microdispensers, en fournissant des modulations quantitatives, les sous-minute d&#39;oxygène entre 0-21%. Cette hypoxie intermittente est utilisée pour étudier un nouveau phénomène de l&#39;Islet préconditionnement. En outre, armés de microscopie multimodale, nous avons pu regarder calcium détaillée et K ATP dynamique de canal lors de ces événements hypoxiques. Nous envisageons l&#39;hypoxie microfluidique, en particulier cette technique à deux phases simultanément, comme un outil précieux pour l&#39;étude des îlots ainsi que de nombreux ex vivo des tissus.

La technique d'hypoxie des îlots pancréatiques repose sur la capacité de moduler simultanément les stimulations en phase aqueuse et en phase gazeuse dans la même chambre microfluidique, avec des transitoires à l'échelle de la minute. Figure 1 présente un résultat représentatif des a) stimulations doubles et b) modulations rapides mesurées à l'intérieur de la chambre d'îlots. La modulation en phase aqueuse, illustrée par l'introduction de fluorescéine dans la chambre, atteint l'équilibre après trois à qua...

Le contrôle microfluidique de l’oxygène confère plus que la commodité et la rapidité par rapport aux chambres hypoxiques pour les expériences biologiques. En particulier lorsqu’il est mis en œuvre par diffusion à travers une membrane, l’oxygène microfluidique peut fournir des modulations simultanées en phase liquide et gazeuse au niveau microscopique. Cette technique permet des expériences multiparamétriques dynamiques essentielles à l’étude de la physiopathologie des îlots de Langerhans.

Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l&#39;oxygène à l&#39;Islet Plain

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

L'objectif général de cette procédure est d'appliquer une hypoxie intermittente à l'échelle des minutes sur des ilots pancréatiques à l'échelle microscopique afin d'étudier les effets de préconditionnement. Cela est réalisé en fabriquant tout d'abord un dispositif microfluidique multimodal doté d'une membrane perméable aux gaz et mince. La deuxième étape consiste à créer un système informatisé de modulation de l'oxygène.Les œillets suivants sont soigneusement chargés dans le dispositif, puis les microfluidiques de liquide et d'oxygène sont connectées. La dernière étape consiste à synchroniser la microscopie avec les microfluidiques multimodales afin de visualiser les paramètres des œillets qui changent pendant la modulation de l'oxygène. En définitive, la technique de l'œillet en hypoxie intermittente est utilisée pour montrer que la réponse au glucose est clairement altérée en condition d'hypoxie.Bien que les modulations temporelles de l'hypoxie puissent entraîner les œillets à répondre avec moins d'altération. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la mesure de l'oxygène dissous ou l'utilisation d'une chambre hypoxique, est qu'elle permet une livraison précise de la concentration d'oxygène aux paupières selon des intervalles de temps rapides et minuscules, sans contrainte de cisaillement due à des écoulements complexes.Il permet également une surveillance en temps réel associant fluorimétrie et microscopie. Ce protocole peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la greffe Alli, telles que la définition des atteintes hypoxiques au niveau des sites de greffe ou l'optimisation de régimes de préconditionnement afin d'améliorer les résultats de la greffe. Ainsi, cette méthode peut fournir des informations sur l'hypoxie Alli.Il peut également être appliqué à d'autres tissus et systèmes, tels que le système nerveux central, les tissus cardiaques, le rein et d'autres organes destinés à la greffe. La démonstration vidéo de cette méthode est essentielle, car de nombreuses étapes concernant la fabrication du dispositif et la manipulation de l'œillet sont difficiles à apprendre en raison du caractère novateur et interdisciplinaire de la technique, mais deviennent inhérentes une fois les gestes maîtrisés. Commencez par fabriquer la couche supérieure du dispositif microfluidique.Pour réaliser cette étape, versez le PDMS pré-mélangé contenant les DGAs dans une boîte de Pétri vide sur une hauteur de 1,5 millimètre et polymérisez-le à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, fabriquez la couche microfluidique de glucose avec le moule maître de la chambre de perfusion en appliquant par centrifugation deux couches de 350 microns d'épaisseur de SU 8 21 50 afin de former une couche unique de 700 microns sur une plaquette de silicium de quatre pouces. Puis exposez-la à la lumière UV à l’aide du masque photolithographique de la couche microfluidique de glucose pour transférer le motif des microcanaux sur la couche de SU 8.Rincez la zone non exposée avec le révélateur SU. Ensuite, versez le PDMS pré-mélangé DGA sur le MA jusqu'à une hauteur de trois millimètres et polymérisez à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois polymérisé, découpez la couche microfluidique de glucose selon la forme souhaitée et utilisez un poinçon de deux millimètres pour créer les orifices d'entrée et de sortie, ainsi qu'un poinçon de huit millimètres de diamètre pour la chambre principale.Ensuite, fabriquez le moule maître des micropuits pour l'immobilisation de la paupière en appliquant par centrifugation une couche de 100 microns d'épaisseur de SU 8 2100 sur une plaquette de silicium propre de quatre pouces, puis utilisez la lithographie UV pour transférer le motif des micropuits sur cette couche. Rincez les zones non exposées avec un révélateur une fois le moule maître des micropuits terminé. Ajoutez deux couches de 100 microns de PDMS en appliquant par centrifugation à 900 tr/min pendant 30 secondes, puis en durcissant pendant 10 minutes à 80 degrés Celsius pour produire chaque couche.Une fois terminé, percer les orifices d'entrée et de sortie de deux millimètres de diamètre. Enfin, fabriquer le modèle maître de la microfluidique à gaz en déposant par rotation du SU 8 2100 sur une épaisseur de 100 microns, comme pour la couche précédente, puis transférer à nouveau les motifs de microfluidique à gaz par lithographie UV. Rincer la zone non exposée avec le révélateur.Ensuite, versez une couche de 1,5 millimètre d'épaisseur de PDMS sur le moule maître de la microfluidique gazeuse et polymérisez à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Puis découpez le PDMS selon la forme souhaitée à l’aide de la lame de rasoir. Ensuite, percez des orifices d’entrée et de sortie de deux millimètres de diamètre dans la couche de couverture afin qu’ils s’alignent avec ceux présents sur les autres couches, dans le but d’assembler les différentes couches entre elles.Tout d'abord, préparez-les en nettoyant les surfaces avec du ruban adhésif, en les exposant à un arc Corona, puis en alignant manuellement les couches dans l'ordre suivant. Commencez par fixer la membrane à la couche inférieure de gaz, les microcavités orientées vers le haut. Ensuite, fixez la couche microfluidique de glucose sur la membrane des microcavités.Enfin, fixer la couche d'entrée et de sortie sur le dessus, encapsulant ainsi l'ensemble du dispositif. Faciliter la formation d'une liaison étanche en plaçant un poids d'un kilogramme sur l'assemblage et en le faisant cuire à 100 degrés Celsius pendant trois heures. Puis vérifier les fuites.Testez le dispositif en chargeant de l'eau dans la couche aqueuse, en immergeant le dispositif et en faisant circuler de l'air à travers la couche gazeuse à l'aide de la seringue, tout en recherchant d'éventuelles fuites. Enfin, stérilisez les dispositifs sans fuite en faisant passer de l'éthanol à 70 % à travers la couche aqueuse pendant une à deux minutes. Configurez les micro-distributeurs en connectant d'abord les câbles de commande des micro-distributeurs aux unités pilotes fournies.Ensuite, connectez les pilotes à la carte d'entrées-sorties numériques sur les ports correspondant à leurs commandes LabVIEW. Puis, reliez les alimentations électriques continues de cinq volts et de 20 volts à leurs contacts respectifs sur les unités de commande, et connectez la carte d'E/S numérique à un ordinateur portable afin d'exécuter les codes LabVIEW pour la commande des gaz, comme décrit dans l'annexe du protocole texte associé. Connectez ensuite un micro-distributeur à l'azote et l'autre à l'air comprimé, chacun contenant 5 % de dioxyde de carbone, et réglez les deux gaz à deux PS.I. Raccordez les sorties des distributeurs en un raccord en T avant qu'elles n'entrent dans le dispositif microfluidique.Ensuite, fixez l'appareil sur la platine chauffante d'un microscope inversé avec 0 % et 21 % d'oxygène reliés à l'appareil. Placez ensuite un capteur d'oxygène à fibre optique à la sortie du fluide de l'appareil pour mesurer en temps réel l'oxygène dissous dans l'effluent. Puis, reliez l'appareil à une pompe péristaltique et commencez à faire circuler de l'eau à travers l'appareil à un débit de 250 microlitres par minute.Caractérisez la réponse transitoire de la modulation de l'oxygène en faisant varier les microdistributeurs entre 5 et 21 % d'oxygène. Connectez une pompe péristaltique au dispositif microfluidique et positionnez le tube au-dessus d'une plaque chauffante réglée à 37 degrés Celsius afin de réchauffer le fluide avant qu'il n'entre dans le dispositif microfluidique. Connectez également le port de sortie des microfluidiques de glucose à un collecteur fractionné pour commencer à disséquer des souris C57 Black Six et isoler les ilots pancréatiques par digestion à la collagénase et séparation par gradient de densité Ficoll, comme décrit dans les vidéos suivantes disponibles sur JoVE, une fois l'isolement effectué.Incuber les lamelles dans du milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine et 20 millimolaire de HEPES, dans des boîtes de Pétri pendant 24 à 48 heures. Utiliser les lamelles dans les deux jours suivant leur préparation afin d'obtenir des résultats reproductibles. Ensuite, préparer un tampon fraîchement fait de Krebs-Ringer bicarbonate selon le protocole décrit dans le texte accompagnant, composé d'une solution contenant 2 millimolaire de glucose et d'une autre contenant 14 millimolaire de glucose.Chauffer les solutions dans des tubes coniques de 50 millilitres en les plaçant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Préparer ensuite la solution de coloration pour les ocelles isolés en ajoutant cinq micromolaires de 4:02 AM et de DMSO et 2,5 micromolaires de RH 1 23 et d'éthanol à 100 % à deux millilitres de tampon de Krebs contenant deux millimolaires de glucose. Ensuite, prélever les ocelles à l’aide d’une pipette de 10 microlitres et les incuber dans la solution de coloration pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Une fois colorés, charger environ 20 œillets dans le dispositif par l'entrée du microcanal de glucose. Diriger les œillets vers la chambre en amorçant le tampon depuis la sortie vers l'entrée. Ensuite, perfuser les œillets et le tampon pendant 10 minutes afin d'éliminer les colorants en excès.Tout d'abord, faites circuler un tampon bicarbonate de Krebs à deux millimolaires dans le système pendant cinq minutes afin d'établir une ligne de base normale du pouls. Ensuite, stimulez la chambre avec le tampon de glucose à 14 millimolaires pendant 15 minutes, suivi d'un rinçage de 15 minutes avec le tampon de glucose à deux millimolaires. Pendant ce processus, enregistrez l'émission à 510 nanomètres en excitant à 340 nanomètres et 380 nanomètres.En outre, enregistrez l'émission à 530 de RH 1 23 en excitant le colorant à 480 nanomètres. Pour minimiser les perturbations convectives durant la modulation de l'oxygène, appliquez un flux tampon pendant les étapes de stimulation et de lavage, et veillez à arrêter le flux lors des autres étapes du test. Collectez l'effluent provenant de la sortie de glucose à intervalles d'une minute pour une analyse complémentaire. Grâce à l'approche microfluidique illustrée dans cette vidéo, il est possible de réguler rapidement le pourcentage d'oxygène circulant près de la fine membrane en PDMS à l'aide d'injecteurs micro-informatisés.Voici un exemple de cette modulation allant d'une minute à six minutes. Il est également possible d'obtenir des modulations quantitatives de moins d'une minute en ajustant la concentration d'oxygène entre deux et 8,5 parties par million, en délivrant de l'oxygène entre 5 et 21 %. La ligne bleue indique le pourcentage d'oxygène délivré, et la ligne verte représente la concentration d'oxygène dissous résultante, exprimée en parties par million. Lorsque ce cycle est appliqué pour induire une hypoxie intermittente au niveau des orifices, on peut observer les effets bénéfiques d'une préconditionnement de ces orifices contre l'hypoxie, comparé à une impulsion normoxique irrégulière, en examinant le rapport for amélioré après traitement. Les effets de l'hypoxie et de l'hypoxie intermittente peuvent être observés au niveau du dépassement et de l'amortissement des oscillations des transitoires calciques ; ici, la réponse normoxique est indiquée en bleu.En rouge figure la réponse à l'hypoxie, et la ligne verte représente la réponse à l'hypoxie conditionnée. La mesure du calcium, du potentiel mitochondrial et de l'insuline est présentée ici. Il s'agit des résultats obtenus par microscopie fluorescente en temps réel et par dosage EISA hors puce utilisant l'effluent microfluidique du système. Ensemble, ces données commencent à établir une vue multiforme de la réponse glucose-insuline en conditions d'hypoxie transitoire.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée : un jour pour la fabrication du dispositif et l'isolement des cellules de la paupière, et un jour pour les expériences sur la paupière elles-mêmes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier la concentration d'oxygène délivrée en calibrant le débitmètre de gaz du dispositif après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie microtissulaire fœtale et d'autres tissus pour explorer comment l'hypoxie et les profils transitoires d'oxygène peuvent influencer des maladies telles que le diabète, les troubles cardiovasculaires et les troubles neurologiques.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de contrôler la modulation de l'oxygène, de manipuler des micro-tissus et de générer des mesures reproductibles et significatives de l'hypoxie tissulaire à l'aide de dispositifs microfluidiques multimodaux.

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Un dispositif microfluidique périfusion îlot a été développé pour l'évaluation de la sécrétion d'insuline des îlots dynamiques multiples et simultanées imagerie de fluorescence de l'influx de calcium et mitochondrial changements potentiels.

Un système multi-paramétriques Islet périfusion dans un dispositif microfluidique périfusion

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Haute résolution respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale des cellules bêta intactes en présence de composés naturels

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Découvrez le contrôle microfluidique de l'oxygène pour moduler l'hypoxie intermittente dans les îlots pancréatiques. Cette technique permet une surveillance en temps réel et une livraison précise d'oxygène pour étudier la physiopathologie des îlots.

Contrôle quantitatif et temporelle des micro-environnement de l'oxygène à l'Islet Plain

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