Protocoles optimisés pour

L'objectif de ce travail est de montrer comment préparer une suspension lipidique de mycobactéries hautement viable. Pour injection chez des souris nues. Nous prélevons le tissu vivant d'une souris infectée, de préférence au stade précoce de l'infection.

Pour garantir des rendements de fragments très viables, euthanasier l'animal à l'intérieur de la cabine de sécurité biologique. Maintenir la patte arrière à l’aide de pinces hémostatiques. Les sectionner avec des ciseaux et les immerger dans de l’iode à 2 % pendant 20 minutes. Pour la décontamination, maintenir l’animal en position dorsale avec la plante du pied tournée vers le haut.

Prélevez le tissu mou. À l’aide d’une lame de scalpel, retirez les os des première et cinquième phalanges afin de faciliter l’homogénéisation du tissu. Placez le tissu dans une boîte de Pétri stérile. Grattez l’épiderme.

Coupez le tissu granulomateux en petits morceaux à l’aide de ciseaux et attendez le calcul ultérieur du rendement en tissu. Transférez les petits morceaux dans un tube contenant un ml de solution saline tamponnée de Hank. Ajoutez un ml supplémentaire de Hank et homogénéisez le tissu trois fois, pendant 15 secondes à chaque fois, à la vitesse quatre.

Placer un tamis cellulaire dans un tube conique stérile de 50 ml. Prélever la suspension à l’aide d’une pipette et la déposer sur le tamis, puis laisser la solution s’écouler par gravité. Pour éliminer les débris, ajouter encore deux mL de Hank’s à la suspension et homogénéiser à nouveau.

À l’aide du même cycle, faire passer la suspension à travers cette passoire. Rincer la passoire en ajoutant des hanks. Pour amener le volume total de la suspension à neuf ml, ajouter un ml de solution de tripsine à 0,5 % à la suspension afin d’obtenir une concentration finale de 0,05 %.

Mélangez en retournant doucement le tube, incubez à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Après l'incubation, amenez le volume de la suspension à quatre mL en ajoutant du sérum physiologique stérile, puis centrifugez à 1700 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, jetez le surnageant et resuspendez le culot en tapotant le tube. Ajoutez un mL de sérum physiologique et mélangez.

Transférez la suspension dans un nouveau tube. Homogénéisez la suspension vasculaire à l’aide d’une seringue d’insuline de un ml munie d’une aiguille de calibre 26 tout en transférant la suspension dans un nouveau tube. Effectuez un contrôle microbiologique de la suspension en plaçant deux gouttes de milieu 18, sept H neuf infusion cerveau-cœur.

11 incuber Genesen Stein à 37 degrés Celsius. Puis suivre les procédures de contrôle microbiologique de routine. Pour la coloration au code Z.

Préparez une dilution au un sur dix et une au un sur cent de la suspension S dans du sérum physiologique. Homogénéisez chaque dilution avant de préparer ces prélèvements pour le comptage. Préparez trois lames en traçant trois cercles de dix millimètres de diamètre interne sur la surface de chaque lame à l’aide d’un marqueur à encre permanente.

Entourez maintenant les cercles avec un stylo d'immunohistochimie. Étiquetez ces lames à l’aide d’un crayon numéro deux afin de préparer les lames pour les trois concentrations de sérum : non dilué, 1/10 et 1/100.

Prélvez à la pipette cinq microlitres de la solution de sérum phénolée et 10 microlitres de la suspension saliveuse dans chaque cercle, homogénéisez et répartissez uniformément la suspension sur toute la surface du cercle. À l’aide du manche d’un anneau jetable, placez ces lames sur une table plane pour les faire sécher après le séchage. Fixez-les en passant ces lames trois fois au-dessus de la flamme bleue, les suspensions salivaires étant orientées vers le haut.

Effectuez un maintien de code Zuni. Examinez ces lames. Les trois dilutions.

Choisissez la dilution la plus appropriée pour le comptage des sary. Préparez 200 microlitres de suspension de sary tués en autoclavant la suspension vasculaire pendant 30 minutes à 121 degrés Celsius. Utilisez le kit de viabilité bactérienne L 7 0 0 7 live dead back light pour la coloration fluorescente du lipide microbactérien.

Préparez une dilution de 1 à 10 de la solution A et une dilution de 1 à 20 de la solution B juste avant utilisation. À chaque 200 microlitres de suspension vasculaire initiale, non diluée et inactivée, ajoutez 3,6 microlitres de la solution A diluée et 6 microlitres de la solution B diluée. Après 15 minutes d'incubation à l'obscurité, centrifugez la suspension à 10 600 ×g pendant cinq minutes à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette réutilisable.

Suspendez le culot dans 50 microlitres de glycérol à 10 %, homogénéisez par pipetage montant et descendant. Déposez huit microlitres de chaque suspension sur une lame de verre et recouvrez d’un petit chevalet. Protégez de la lumière.

Observer les suspensions au microscope fluorescent. Préparer une suspension avec une concentration de 10 à sept liposomes BA par ml, correspondant à un ml de milieu de congélation dans chaque cryoampoule. Ensuite, ajouter 150 microlitres de la suspension S au un ml de milieu de congélation et homogénéiser en inversant le tube.

Placer le tube cryogénique à l'intérieur du conteneur de congélation. Maintenir le conteneur à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Transférer les tubes dans une boîte de stockage et les conserver à moins 80 degrés Celsius en prévision de la décongélation.

Décongeler la suspension congelée dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius. Transférer la suspension dans un tube conique contenant 20 miles de solution saline stérile cent. Refusé de concentrer.

La baline a suivi le protocole Z de maintien pour le comptage et le protocole de coloration fluorescente pour la détermination de la variabilité. Préparez une suspension contenant de 10 à 8 BA par repas, homogénéisez la suspension avant d'inoculer chaque animal. Aspirez cent microlitres dans une seringue à insuline et inoculez 30 microlitres dans les coussinets postérieurs de chaque animal pour la détermination de la viabilité.

La fluorescence verte est observée dans tous les BAI, tandis que la fluorescence rouge n'apparaît que dans ce bai. Lorsque ces BAI sont des témoins sans ajout de substance, une intensité identique de lumière verte et rouge des BAI est observée. L'inoculation de M Lepar congelé pendant différentes durées conduit à une augmentation de 10 à 1000 fois du nombre de BAI récupérés après sept mois.

En guise de remarque finale, nous aimerions préciser que, puisque IL leid ne se développe pas in vitro, ce protocole permet un moyen rapide et simple de maintenir des yl Leid viables disponibles pour des utilisations ultérieures en laboratoire.