Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des images en lapse de temps du comportement des cellules gliales après une lésion du nerf périphérique chez des larves de zebrafish vivantes. Pour ce faire, on commence par monter des larves de zebrafish anesthésiées dans de l'agarose à bas point de fusion sur des boîtes de Pétri à fond de verre, puis on les positionne à l'aide d'une aiguille de dissection. Ensuite, les larves montées sont placées sur le microscope confocal.

Un nerf est sélectionné pour l'ablation et une image des axones et des cellules gliales du nerf non lésé est acquise. Ensuite, des zones d'intérêt (ROIs) sont choisies le long du nerf et le laser est activé pour ablater les zones sélectionnées, créant ainsi une section du nerf. Enfin, les axones et les cellules gliales sont observés en imagerie en temps réel après la section du nerf.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent le comportement dynamique des cellules gliales au cours de la dégénérescence et de la régénération nerveuse, grâce à la microscopie confocale en temps réel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la régénération et de la biologie des cellules gliales, telles que : comment les cellules gliales réagissent-elles à une lésion nerveuse ? Et comment les différents sous-types gliaux coordonnent-ils leur comportement pendant la dégénérescence et la régénération ?

Après avoir croisé des zebrafish adultes contenant des transgènes marquant de façon fluorescente les motoneurones et les types cellulaires gliaux d'intérêt, et après avoir incubé les embryons jusqu'à 24 heures post-fécondation (HPF), retirez l'eau des œufs et remplacez-la par de l'eau d'œufs contenant du 1-phényl-2-thioureuse (PTU), puis remettez les embryons dans l'incubateur. À partir de ce moment jusqu'à environ 96 HPF, utilisez un microscope stéréofluorescent pour dépister les embryons présentant le gène fluorescent souhaité. Transférez les embryons positifs dans de l'eau d'œufs fraîche contenant du PTU et remettez-les dans l'incubateur.

Lorsque les larves atteignent six jours post-fécondation (DPF), sélectionnez quelques embryons pour la monture et transférez-les dans un petit plat. Retirez l'eau du plat et remplacez-la immédiatement par de l'eau d'œuf PTU contenant 0,02 % de trica. Incubez les larves dans l'anesthésique pendant environ cinq minutes. Placez un Eloqua d'agarose à faible point de fusion à 0,8 %, préparé précédemment selon le protocole décrit dans le texte, dans un bécher contenant de l'eau du robinet et chauffez au micro-ondes.

Pendant 30 secondes ou jusqu'à ce que l'agarose soit fondue, laissez refroidir le bécher jusqu'à ce que le tube d'agarose soit tiède au toucher. Ensuite, transférez une larve anesthésiée dans une boîte en verre de 35 millimètres à fond de verre. Retirez tout l'eau présente dans la boîte.

Ensuite, recouvrir immédiatement les larves d'assez d'agarose tiède pour remplir la partie de la boîte à fond en verre. Au fur et à mesure que l'agarose durcit, utiliser une aiguille de dissection pour positionner les larves sur le côté. Puis les incliner légèrement sur le dos, en veillant à ce que les larves montées soient en contact avec le verre au fond de la boîte, ce qui est nécessaire pour les blessures et l'imagerie.

Utilisez l'aiguille pour maintenir les larves en place jusqu'à ce que l'agarose durcisse et que les larves soient immobilisées. Ensuite, pipetez lentement suffisamment d'eau trica dans la boîte pour recouvrir complètement les agaroses et les larves. Allumez tous les instruments du microscope confocal, les lasers à diode appropriés pour exciter les transgènes du poisson zèbre, ainsi que le laser à colorant pompé par azote.

Veillez à ce que le séparateur de faisceau vierge soit en place et que la cellule de teinture au laser de 435 nanomètres soit installée. Ouvrez complètement l'atténuateur du laser, puis lancez le logiciel d'imagerie avec l'objectif à immersion dans l'eau de 63 x 1,2 NA et une lame en verre présentant un côté réfléchissant. Utilisez l'éclairage en champ clair pour localiser et focaliser sur une rayure ou une gravure présente sur le miroir.

À l’aide d’un logiciel d’imagerie, visualisez et mettez au point les gravures sur l’écran d’ordinateur depuis la fenêtre qui contrôle l’étalonnage du laser et les réglages de puissance. Réglez le nombre d’impulsions à un et l’atténuation à 3 % de transmission depuis la barre d’outils principale. Sélectionnez l’outil ellipse et cliquez sur l’image à l’écran.

Pour créer une seule zone d'intérêt circulaire, répétez le processus trois fois supplémentaires jusqu'à obtenir quatre ZI circulaires réparties aléatoirement sur l'image. Ensuite, déclenchez le laser. Si le laser fonctionne correctement et est bien calibré, cela produira quatre petites gravures ponctuelles, une dans chaque ZI circulaire. Retirez ensuite la lame de verre de la platine du microscope et nettoyez l'objectif.

Remplacez le séparateur de faisceau vide par le séparateur de faisceau 100 %ILL pour sectionner un nerf moteur à l’aide d’une ablation laser. Appliquez une petite goutte de milieu d’immersion à l’eau sur l’objectif et placez la boîte contenant la larve montée sur le porte-objet approprié à l’aide de pinces pour la stabiliser, en utilisant l’oculaire et l’éclairage en champ large. Mettez au point sur les larves et localisez les neurones moteurs.

Scannez les nerfs dans les hémisegments 10 à 20 et sélectionnez un nerf moteur pour la section. Ensuite, affichez une vue en direct du nerf sur l'écran de l'ordinateur. Choisissez les plans Z et acquérez une image des axones et des cellules gliales du nerf non lésé.

Préparez ensuite les paramètres d'acquisition en lapso-temporel pour capturer des projections Z de tous les types cellulaires à des intervalles de cinq à trente minutes. Selon l'expérience, retirez le séparateur de faisceau 100 %ILL et remplacez-le par le cache. Revenez à la vue en direct du nerf et utilisez le canal de fluorescence approprié pour visualiser les axones qui seront tranchés.

À l’aide de l’outil ellipse, créez une région d’intérêt (ROI) elliptique fine dans la zone à ablationner. Ensuite, créez des ROI plus petites à l’intérieur de la région sélectionnée dans la fenêtre qui contrôle les paramètres du laser. Réglez le nombre d’impulsions sur deux et la plaque d’atténuation sur 18 % de transmission.

Ensuite, déclenchez le laser dans les ROI sélectionées. Attendez 10 secondes ou plus, puis vérifiez à nouveau la zone ablatée pour la fluorescence. Sachez qu'une ROI peut initialement sembler avoir subi une ablation alors qu'elle a en réalité subi un blanchiment photochimique, et que les ROI peuvent nécessiter des ajustements légers au cours de l'ablation afin d'obtenir une section complète.

Si la fluorescence réapparaît, augmentez la puissance du laser et déclenchez le laser. Répétez à nouveau cette étape jusqu'à ce que la fluorescence disparaisse dans la R OIS et ne réapparaisse pas dans les 10 secondes. Une fois l'ablation terminée, commencez l'acquisition en laps de temps lorsque le laps de temps est complet.

Utilisez un logiciel d'imagerie pour compiler les données et créer des projections Z composites en couleurs pour chaque point temporel. Créez un film accéléré pour analyser simultanément le comportement des axones et des cellules gliales. Le test décrit ici peut être utilisé pour évaluer la réponse des cellules gliales et d'autres populations cellulaires associées aux nerfs à une lésion axonale in vivo.

Voici un exemple de lésion nerveuse créée à l'aide de cette méthode, ainsi que la réponse des cellules gliales environnantes. L'expérience a été réalisée sur six poissons-zèbres transgéniques DPF exprimant une EGFP ciblée vers la membrane dans les cellules gliales périnéurales et une DS rouge cytosolique dans les neurones moteurs. La lésion a été réalisée le long de la projection rostrale d'un nerf moteur du tronc, puis observée en imagerie en temps réel dans les deux canaux EGFP et DS rouge.

Cela a permis la visualisation simultanée des comportements des axones et des cellules gliales immédiatement après la lésion. Ces images sont des points temporels fixes extraits du film en accéléré. L'ellipse en pointillés indique la région d'intérêt (ROI) qui a été ablatée à l'aide du laser après une minute.

Après la transection ou à 120 MPT, la zone ablatée ne présentait pas de fluorescence et la région lésée mesurait environ 3,5 micromètres du moignon proximal au moignon distal. La réussite d'une transection peut être confirmée en imagerie du moignon nerveux distal et en recherchant des signes de dégénérescence wallérienne, notamment la fragmentation de l'axone distal et son élimination rapide. L'absence de fluorescence axonale le long du moignon distal à 120 MPT indique que ces axones ont effectivement subi une dégénérescence wallérienne et que la transection a été couronnée de succès.

Régler la puissance du laser à une valeur idéale est essentiel lors de la réalisation d'expériences d'ablation laser. Des réglages optimaux de la puissance laser permettent d'ablater proprement le nerf uniquement dans la région d'intérêt (ROI) sélectionnée ; des réglages de puissance laser trop faibles ou trop élevés produisent des résultats sous-optimaux. Ici, une lésion a été réalisée avec une puissance laser trop faible. La fluorescence est restée à l'intérieur de la ROI après l'impulsion laser, entraînant une section incomplète.

D'autre part, comme le montre cette figure, une puissance laser trop élevée a produit une ablation extrêmement importante. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment monter des poissons-zèbres pour des expériences de transection au laser. Réalisez une transection à l’aide d’un laser à colorant pompé par un laser azote, puis évaluez la réponse des cellules environnantes par imagerie confocale en laps de temps.