Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

L’objectif global de cette procédure est d’imager en accéléré le comportement des cellules gliales à la suite de lésions nerveuses périphériques chez des larves de poisson-zèbre vivantes. Ceci est accompli en montant d’abord des larves de poisson-zèbre anesthésiées dans des aros à bas point de fusion sur des boîtes de Pétri à fond de verre et en les positionnant avec une aiguille de dissection. Ensuite, les larves montées sont placées sur le microscope confocal.

Un nerf est sélectionné pour l’ablation et une image est acquise des axones et des cellules gliales du nerf non blessé. Ensuite, les zones d’intérêt sont sélectionnées le long du nerf et le laser est tiré pour ablater les zones sélectionnées, créant ainsi une transsection nerveuse. Enfin, les axones et les cellules gliales sont imagés en accéléré après la transection nerveuse.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent le comportement dynamique des cellules gliales pendant la dégénérescence et la régénération nerveuses grâce à la microscopie confocale time-lapse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la régénération et de la biologie des cellules gliales, telles que comment les cellules gliales réagissent-elles aux lésions nerveuses ? Et comment les sous-types gliaux distincts coordonnent-ils leur comportement pendant la dégénérescence et la régénération ?

Après avoir croisé des poissons-zèbres adultes contenant des transgènes qui marquent par fluorescence les motoneurones et les types de cellules gliales d’intérêt et incubé les embryons jusqu’à 24 heures après la fécondation ou HPF, retirez l’eau de l’œuf et remplacez-la par une dentée de pH ou PTU dans l’eau d’œuf avant de retourner les embryons dans l’incubateur. À partir de ce moment jusqu’à environ 96 HPF, utilisez une lunette de dissection fluorescente pour dépister les embryons afin de détecter la présence du gène fluorescent souhaité. Transférez les embryons positifs dans de l’eau fraîche d’œuf PTU et retournez-les dans l’incubateur.

Lorsque les larves ont atteint six jours après la fécondation ou le DPF, sélectionnez quelques embryons pour la montée et transférez-les dans une boîte plus petite. Retirez l’eau du plat et remplacez-la immédiatement par 0,02 % de trica Dans de l’eau d’œuf PTU, incubez les larves dans un anesthésique environ cinq minutes. Placez un Eloqua de 0,8 % d’agros à faible point de fusion préalablement préparé selon le protocole de texte dans un bécher avec de l’eau du robinet et un micro-ondes.

Pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que l’agros soit fondu, laissez le bécher refroidir jusqu’à ce que le tube d’agros soit tiède au toucher. Ensuite, transférez une larve anesthésiée dans une parabole à fond de verre de 35 millimètres. Retirez toute eau dans le plat.

Ensuite, couvrez immédiatement les larves avec suffisamment d’aros chauds pour remplir la partie à fond de verre du plat. Au fur et à mesure que l’agros durcit, utilisez une aiguille à disséquer pour positionner les larves sur le côté. Ensuite, inclinez-le légèrement sur le dos, en vous assurant que les larves montées touchent le verre au fond du plat, ce qui est nécessaire pour les blessures et l’imagerie.

Utilisez l’aiguille pour maintenir les larves en position jusqu’à ce que l’agro se solidifie et que les larves soient immobilisées. Ensuite, pipetez lentement suffisamment d’eau trica dans le plat pour couvrir complètement les agros et les larves. Allumez tous les instruments du microscope confocal, les lasers à diodes appropriés pour exciter les transgènes du poisson-zèbre et le laser à colorant pompé à l’azote.

Assurez-vous que le séparateur de faisceau à blanc est en place et que la cellule de 435 nanomètres est en place. Ouvrez complètement l’atténuateur laser, puis ouvrez le logiciel d’imagerie avec la lentille d’immersion dans l’eau 63 x 1,2 na et une lame de verre avec une face réfléchissante. Utilisez l’éclairage en fond clair pour trouver et faire la mise au point sur une égratignure ou une gravure dans le miroir.

À l’aide d’un logiciel d’imagerie, affichez et concentrez les gravures sur l’écran de l’ordinateur à partir de la fenêtre qui contrôle l’étalonnage du laser et les paramètres d’alimentation. Réglez le nombre d’impulsions à un et l’atténuation à 3 % de transmission à partir de la barre d’outils principale. Sélectionnez l’outil ellipse et cliquez sur l’image sur l’écran de l’ordinateur.

Pour créer un retour sur investissement circulaire unique, répétez le processus trois fois de plus jusqu’à ce qu’il y ait quatre IR circulaires espacées de manière aléatoire sur l’image. Ensuite, tirez le laser. Si le laser fonctionne et est correctement calibré, cela créera quatre petites gravures ponctuelles, une dans chaque retour sur investissement circulaire, puis retirez la lame de verre de la platine du microscope et nettoyez l’objectif.

Remplacez le séparateur de faisceau à blanc par le séparateur de faisceau 100 % ILL pour transecter un nerf moteur à l’aide de l’ablation au laser. Appliquez une petite goutte de milieu d’immersion dans l’eau sur l’objectif et placez la parabole avec la larve montée sur la scène appropriée à l’aide de clips pour la stabiliser à l’aide de l’oculaire et d’un éclairage à grand champ. Concentrez-vous sur les larves et localisez les motoneurones.

Scannez les nerfs des segments hémi 10 à 20 et sélectionnez un nerf moteur pour la transection. Ensuite, affichez une vue en direct du nerf sur l’écran de l’ordinateur. Sélectionnez les plans Z et obtenez une image des axones et des cellules gliales du nerf non blessé.

Préparez ensuite les paramètres d’imagerie en accéléré pour capturer des projections Z de tous les types de cellules à des intervalles de cinq à 30 minutes. Selon l’expérience, retirez le séparateur de faisceau 100 %ILL et remplacez-le par l’ébauche. Revenez à la vue en direct du nerf et utilisez le canal fluorescent approprié pour voir les axones qui seront transectés.

À l’aide de l’outil ellipse, créez un retour d’intérêt elliptique mince dans la zone à ablater. Créez ensuite des zones d’intérêt plus petites dans la région sélectionnée dans la fenêtre qui contrôle les paramètres laser. Réglez le nombre d’impulsions sur deux et la plaque d’atténuation sur 18 % de transmission.

Tirez ensuite le laser dans les zones d’intérêt sélectionnées. Attendez 10 secondes ou plus et vérifiez à nouveau la zone ablée pour la fluorescence. Sachez qu’un retour sur investissement peut initialement sembler ablaté lorsqu’il est réellement photoblanchi et que les retours sur investissement peuvent devoir être légèrement modifiés au cours de l’ablation pour obtenir une transition complète.

Si la fluorescence revient, augmentez la puissance du laser et tirez le laser. Encore une fois, répétez cette opération jusqu’à ce que la fluorescence disparaisse dans l’OIS R et ne revienne pas dans les 10 secondes. Une fois l’ablation terminée, commencez l’imagerie en accéléré lorsque le temps est terminé.

Utilisez un logiciel d’imagerie pour compiler des données et créer des projections Z composites en couleur pour chaque point temporel. Créez un film rapide pour analyser simultanément le comportement des axones et des cellules gliales. Le test décrit ici peut être utilisé pour évaluer la réponse des cellules gliales et d’autres populations de cellules associées aux nerfs aux lésions axonales in vivo.

Voici un exemple d’une lésion nerveuse créée à l’aide de cette méthode et de la réponse des cellules gliales environnantes. L’expérience a été réalisée chez six poissons zèbres transgéniques DPF qui exprimaient une membrane ciblant l’EGFP dans le ggl périneural et le rouge DS cytosolique dans les motoneurones. La blessure a été causée le long de la projection rostrale d’un nerf moteur du tronc qui a ensuite été imagé en accéléré dans les canaux rouges EGFP et DS.

Cela a permis de visualiser simultanément les comportements des axones et des cellules gliales immédiatement après la blessure. Ces images sont des points temporels statiques tirés de la vidéo en accéléré. L’ellipse pointillée montre le retour sur investissement qui a été ablaté à l’aide du laser à une minute.

Après la transection ou MPT, la zone ablée manquait de fluorescence et la zone de blessure mesurait environ 3,5 micromètres du moignon proximal au moignon distal. Le succès d’une section peut être confirmé en imageant le moignon du nerf distal et en recherchant des signes de dégénérescence wallérienne, y compris la fragmentation des axones distaux et la clairance rapide. L’absence de fluorescence axonale le long du moignon distal à 120 MPT indique que ces axones ont effectivement subi une dégénérescence wallérienne et que la transaction a été couronnée de succès.

Il est essentiel d’ajuster la puissance du laser à un réglage idéal lors de la réalisation d’expériences d’ablation laser. Les réglages idéaux de puissance laser n’ablèveront proprement le nerf que dans les limites du retour sur investissement sélectionné, et les paramètres de puissance laser qui sont trop faibles ou trop élevés donneront des résultats sous-optimaux. La fluorescence est restée dans le ROI après le tir du laser, ce qui a entraîné une transection incomplète.

D’autre part, comme le montre cette figure, une puissance laser trop élevée a produit une ablation extrêmement importante. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de monter le poisson-zèbre pour les expériences de section laser. Créez une section à l’aide d’un laser à colorant de pompe à azote et évaluez la réponse des cellules environnantes à l’aide de l’imagerie confocale en accéléré.