Name: Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Apprenez à isoler et caractériser le lipide A de bactéries à Gram négatif par spectrométrie de masse en tandem. Cette méthode avancée révèle les mécanismes de résistance aux antibiotiques et les réponses immunitaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été financé par des subventions AI064184 et AI76322 des National Institutes of Health (NIH) et par Grant 61789-MA-MUR de l&#39;Army Research Office de MST de recherche a également été soutenue par Welch Foundation Grant F1155 et NIH accorder R01GM103655 à ACC

<ol><li>Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+endotoxin+and+its+impact+on+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+endotoxin+research%22%5BJournal%5D)">Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis.</a> Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).</li>
<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+Modification+Systems+in+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).</li>
<li>Kim, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+TLR4-MD-2+complex+with+bound+endotoxin+antagonist+Eritoran%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran.</a> Cell. 130, 906-917 (2007).</li>
<li>Rietschel, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin%3A+molecular+relationships+of+structure+to+activity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).</li>
<li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Innate immunity.</a> The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).</li>
<li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+interleukin-1+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism.</a> Blood. 77, 1627-1652 (1991).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+acylation+and+bacterial+resistance+against+vertebrate+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides.</a> Cell. 95, 189-198 (1998).</li>
<li>Yi, E. C., Hackett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+method+for+lipopolysaccharide+and+lipid+A+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria.</a> The Analyst. 125, 651-656 (2000).</li>
<li>Westphal, O. aJ., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Lipopolysaccharide.+Extraction+with+phenol-water+and+further+application+of+the+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohydr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure.</a> Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).</li>
<li>Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+extraction+of+R+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry+%2F+FEBS%22%5BJournal%5D)">A new method for the extraction of R lipopolysaccharides.</a> European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).</li>
<li>Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+eight+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octylosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).</li>
<li>Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+unmodified+endotoxin+preparations+by+252Cf+plasma+desorption+mass+spectrometry.+Determination+of+molecular+masses+of+the+constituent+native+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides.</a> The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+journal+of+biochemistry+and+physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+NMR+spectroscopy+of+lipid+A+molecules+containing+4-amino-4-deoxy-L-arabinose+and+phosphoethanolamine+substituents.+Different+attachment+sites+on+lipid+A+molecules+from+NH4VO3-treated+Escherichia+coli+versus+kdsA+mutants+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biosynthesis+of+free+lipid+A+molecules+that+replace+lipopolysaccharide+in+Francisella+tularensis+subsp.+novicida%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida.</a> Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).</li>
<li>Strain, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+polar+substituents+and+fatty+acyl+chains+on+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octulosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium.+Studies+by+1H%2C+13C%2C+and+31P+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).</li>
<li>Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IR+and+UV+Photodissociation+as+Analytical+Tools+for+Characterizing+Lipid+A+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry+%28Washington%2C+DC%2C+United+States%22%5BJournal%5D)">IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures.</a> Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).</li>
<li>Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigation+of+bacterial+lipopolysaccharides+by+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+acylation+of+Vibrio+cholerae+lipopolysaccharide+requires+phosphorylation+of+Kdo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).</li>
<li>Hankins, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+novel+Vibrio+cholerae+lipid+A+secondary+hydroxy-acyltransferase+and+its+role+in+innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition.</a> Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).</li>
<li>Chan, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+characterization+of+lipid+A%3A+electrospray+ionization+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).</li>
<li>Boue, S. M., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+the+structure+of+lipid+A+from+Enterobacter+agglomerans+by+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).</li>
<li>Kussak, A., Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadrupole+ion-trap+mass+spectrometry+to+locate+fatty+acids+on+lipid+A+from+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria.</a> Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).</li>
<li>El-Aneed, A., Banoub, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+molecular+structure+of+lipid+A+isolated+from+both+a+rough+mutant+and+a+wild+strain+of+Aeromonas+salmonicida+lipopolysaccharides+using+electrospray+ionization+quadrupole+time-of-flight+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).</li>
<li>Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+advances+in+lipidomica%3A+collision-induced+decomposition+of+Kdo2-lipid+A%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediators%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).</li>
<li>Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lipid+A+from+Escherichia+coli+O157%3AH7%3AK-+using+thin-layer+chromatography+and+ion-trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).</li>
<li>Wang, Z., Li, J., Altman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+the+lipid+A+region+of+Aeromonas+salmonicida+subsp.+salmonicida+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide.</a> Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).</li>
<li>Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+lipid+A+from+nontypeable+and+type+f+Haemophilus+influenzae%3A+variability+of+fatty+acid+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution.</a> Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).</li>
<li>Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+bacterial+lipid+A+analysis+by+negative+electrospray+ion+trap+mass+spectrometry%3A+Stepwise+dissociations+of+deprotonated+species+under+low+energy+CID+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions.</a> Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).</li>
<li>Silipo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterizations+of+lipids+A+by+MS%2FMS+of+doubly+charged+ions+on+a+hybrid+linear+ion+trap%2Forbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer.</a> J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+pyrophosphorylated+forms+of+lipid+A+in+gram-negative+bacteria+using+a+multivaried+mass+spectrometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.+A%22%5BJournal%5D)">Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+structure+characterization+of+lipid+A+extracted+from+Yersinia+pestis+for+determination+of+its+phosphorylation+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+addition+to+Vibrio+cholerae+LPS+establishes+a+link+between+surface+remodeling+in+gram-positive+and+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).</li>
<li>Han, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+sulfation+in+a+Gram-negative+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium.</a> Nature. 3, 1153-1110 (2012).</li>
<li>Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+phosphorylation+of+lipid+A+is+linked+to+the+synthesis+of+undecaprenyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate.</a> Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).</li>
<li>Galloway, S. M., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Escherichia+coli+defective+in+the+first+step+of+endotoxin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis.</a> The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).</li>
<li>Trent, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+a+polyisoprene-linked+amino+sugar+in+polymyxin-resistant+Salmonella+typhimurium+and+Escherichia+coli%3A+structural+characterization+and+transfer+to+lipid+A+in+the+periplasm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).</li>
<li>Chung, H. S., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxygenases+in+Burkholderia+ambifaria+and+Yersinia+pestis+that+hydroxylate+the+outer+Kdo+unit+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).</li>
<li>Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+modifications+characteristic+of+Salmonella+typhimurium+are+induced+by+NH4VO3+in+Escherichia+coli+K12.+Detection+of+4-amino-4-deoxy-L-arabinose%2C+phosphoethanolamine+and+palmitate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).</li>
<li>Raetz, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kdo2-Lipid+A+of+Escherichia+coli%2C+a+defined+endotoxin+that+activates+macrophages+via+TLR-4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4.</a> Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans ce protocole, nous avons détaillé l&#39;isolement des lipides Une espèce de cellules entières de bactéries, et décrit les méthodes d&#39;analyse TLC ou MS pour caractériser chimiquement ce matériel isolé. Spectrométrie de masse tandem est une stratégie puissante pour de novo caractérisation structurale des composés biologiques, et est inestimable pour la caractérisation chimique de la panoplie de molécules lipidiques A observés dans la nature. CID et UVPD existe deux méthodes d&#39;activation complémentair...

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface extérieure de presque tous les organismes gram-négatif et est constituée de trois domaines moléculaires: un antigène O polysaccharidiques distale, un oligosaccharide de noyau et le lipide associé à la membrane Un domaine déposé sur le feuillet externe de la membrane bicouche externe 1,2. Le lipide Un domaine se compose de 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) les résidus et un lipide une espèce moléculaire, où le lipide A peut être définie comme la fraction soluble dans le chloroforme de LPS lors de l&#39;hydrolyse légère acide 1, 2. Le lipide A de la molécule de type peut être défini chimiquement comme une épine dorsale qui est diglucosamine hexa-acylé et le bis-phosphorylé, en accord avec les principales espèces de lipide A observées dans l&#39;organisme modèle Escherichia coli (E. coli) 1,2. Neuf gènes exprimés de manière constitutive, conservés tout au long de bactéries gram-négatives, sont responsables de la production du domaine de lipide A (Figure 1) 1,2. La plupart des bactéries ont un jeu supplémentaire de gènes, qui varient en degré de conservation phylogénétique, qui participent à une autre modification chimique du lipide A 3. La déphosphorylation, l&#39;élimination des chaînes acyle, et l&#39;addition de groupements chimiques, tels que des amino-sucres (par exemple aminoarabinose) et / ou de la phosphoéthanolamine sont les activités les plus fréquemment observés (Figure 1). Beaucoup des enzymes responsables de lipides Une modification sont directement activés par des signaux environnementaux, tels que des cations bivalents ou leur expression est régulée par deux systèmes de réponse-régulateur composants 3. Reconnaissance d&#39;espèces lipidiques A par le système immunitaire inné hôte est médiée par le récepteur de type Toll-like facteur de différenciation 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-récepteur 4. Forces hydrophobes entre MD2 et le lipide A des chaînes acyle, ainsi qu&#39;entre TLR4 et les 1 et 4 &#39;groupes phosphates de lipide A promouvoir la forte association de la lèvreid avec TLR4/MD2 4,5. Les modifications qui modifient l&#39;état d&#39;acylation ou la charge négative du lipide A à base de lipide A TLR4/MD2 incidence reconnaissance et en aval de la stimulation de la réponse immunitaire innée activateurs de NF-kB et de médiateurs de l&#39;inflammation tels que TNFa et IL1-β 6,7. Modifications qui masquent la charge négative de lipide A éviter également des peptides antimicrobiens cationiques bactéricides de se lier à Gram négatif surfaces cellulaires 3,8. De nombreuses modifications de lipide A sont émis l&#39;hypothèse d&#39;améliorer la condition physique des bactéries dans des conditions environnementales spécifiques, tels que l&#39;intérieur de l&#39;hôte humain ou dans une niche écologique. Pour cette raison, de nombreuses enzymes de modification sont des cibles intéressantes dans le développement rationnel de composés antimicrobiens. La diversité chimique des structures lipidiques A, par rapport à l&#39;organisme et / ou de l&#39;environnement, et les implications biologiques de ces diverses structures rendre la caractérisation structurale de lipide A un effort important dans de til étudier des bactéries gram-négatives. L&#39;isolement des molécules de lipide A de bactéries entières implique l&#39;extraction de LPS à partir de la surface de la cellule bactérienne, une étape d&#39;hydrolyse pour libérer le lipide A, suivie par une procédure de purification finale 9-11. Le LPS procédure la plus fréquemment citée d&#39;extraction est le chaud phénol procédure d&#39;extraction de l&#39;eau, d&#39;abord introduit par Westphal et Jann 10. Après extraction LPS ensemble est soumis à une hydrolyse douce-acide, qui sépare chimiquement Kdo de la 6&#39;-hydroxy du sucre de glucosamine distale du lipide A (figure 1). De nombreux écueils existent pour la procédure de l&#39;eau chaude-phénol y compris l&#39;utilisation d&#39;un réactif de risque élevé, la nécessité de dégrader les acides co-extraits nucléiques et des protéines, et plusieurs jours sont nécessaires pour compléter le protocole 10. Notre laboratoire a développé l&#39;extraction et l&#39;isolement du lipide A comme premier développé par Caroff et Raetz 12,13. Par rapport aux procédés de l&#39;eau chaude-phénol, le procédé présenté ici est plus rapide et efficace et s&#39;adapte à une large gamme de volumes de culture de 5 ml à plusieurs litres. En outre, contrairement à l&#39;extraction de l&#39;eau chaude-phénol, notre méthode ne sélectionne pas pour rugueuses ou lisses-types de LPS, en fournissant une récupération optimale des espèces lipidiques A. Dans notre protocole, la lyse chimique des cellules bactériennes entières est effectuée en utilisant un mélange de chloroforme, de méthanol et d&#39;eau, où LPS peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation. Une combinaison d&#39;une hydrolyse douce-acide et extractions par solvant (Bligh-Dyer) sont utilisés pour libérer le lipide A de polysaccharide lié de manière covalente. La méthode de Bligh et Dyer a été appliqué d&#39;abord à l&#39;extraction d&#39;espèces lipidiques à partir d&#39;une variété d&#39;animaux et des végétaux tissus 14, modifié ici pour séparer le polysaccharide hydrolysé de lipide A. Dans cette étape de séparation finale, le chloroforme lipides solubles partitionner de manière sélective dans la phase organique inférieure phase. Pour purifier davantage le lipide A, en phase inverse ouChromatographie sur colonne d&#39;échange anionique peut être utilisé 12. Après isolement des espèces lipidiques A partir de cellules entières, un certain nombre de méthodes d&#39;analyse peut être utilisée pour caractériser la structure chimique de la matière d&#39;isolement telles que la RMN, chromatographie sur couche mince, et l&#39;analyse MS. RMN permet élucidation de la structure non-destructive, et fournit des détails structurel lié à des liaisons glycosidiques, l&#39;attribution sans équivoque des positions de la chaîne acyle, et cession de sites de fixation pour le lipide A modifications comme aminoarabinose ou phosphoethanolamine 15-17. analyse par RMN du lipide A n&#39;est pas discutée au sein de notre protocole, mais a été correctement décrit ailleurs 15,16. Pour une analyse rapide TLC basées méthodes sont fréquemment utilisées, mais ne parviennent pas à fournir des informations directes sur la structure de la chimie fine. Protocoles MS sont la méthode la plus fréquemment utilisée pour caractériser les structures lipidiques A 18,19. Matrice associée ionisation par désorption laser (MALDI)-MS est souvent utilisé pour sonder initialement espèce de lipide A intactes. Ions à charge sont générés à partir analyte préparée selon nos procédures d&#39;extraction. Comme l&#39;analyse structurale plus fine est nécessaire, des méthodes basées MS / MS s&#39;avèrent plus informatif que MALDI-MS. Couplé à ionisation électrospray (ESI) de lipides seuls ou à plusieurs charges A ions précurseurs sont encore fragmenté par dissociation induite par collision (CID) ou photodissociation ultraviolet (UVPD), pour générer des ions structurellement information sur les produits 18,20,21. Produits de perte de neutre lipide A ions précurseurs sont également fréquemment générés pendant ESI-MS à fournir une couche supplémentaire d&#39;information structurale. Spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) s&#39;est avérée être une méthode indispensable et polyvalent pour l&#39;élucidation des structures lipidiques A. Au cours de MS / MS, les ions sont activés pour obtenir un schéma de fragmentation de diagnostic qui peut être utilisée pour élucider la structure de l&#39;ion précurseur. Le plus largement available méthode MS / MS est CID. Cette méthode produit des ions fragmentés par collision de l&#39;ion précurseur choisi avec un gaz inerte cible, ce qui entraîne le dépôt d&#39;énergie qui conduit à la dissociation. CID s&#39;est avéré un outil essentiel dans l&#39;attribution des lipides Une structure pour un large éventail d&#39;espèces bactériennes 22-33. Bien que le procédé est CID MS / MS plus universellement mis en oeuvre, il génère un éventail limité d&#39;ions sur les produits. 193 nm UVPD est une alternative et complémentaire méthode MS / MS. Cette méthode utilise un laser pour irradier des ions, et l&#39;absorption de photons se traduit par excitation des ions et la dissociation subséquente. Cette énergie technique MS / MS plus élevée produit un éventail plus diversifié d&#39;ions produits que CID et fournit des modèles de fragmentation plus informatifs ainsi. En particulier, UVPD donne des informations sur les changements subtils dans les espèces lipidiques A sur la base de clivages au glycosidique, amine, acyle et CC obligations indexées 18,21,34.

<table><tbody><tr><td>Chloroforme</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific C607</td><td>Méthanol de qualité HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452</td> Bouteilles de centrifugeuse en téflon <td>FEP de qualité HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-562-21</td><td></td></tr><tr><td>Gel de silice 60 Plaques TLC</td><td>EMD Biosciences</td><td>5626-6</td><td></td></tr><tr><td>Grade No. 3MM Papier de chromatographie</td><td>Whatman</td><td>3030700</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre</td><td></td> de masse Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td></td> ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoTip Nanospray Émetteurs ESI</td><td>Nouveaux Obectives</td><td></td><td>&#8805 ; 30 &mu ; m pour réduire l’encrassement</td></tr><tr><td>Modèle 505 Générateur d’impulsions/retards</td><td>Berkeley Nucleonics Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate Thermoylne 2200</td><td>Barnstead/Thermolyne</td><td>HPA2235MQ</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm GPI 15-415 Tubes de culture en borosilicate jetables filetés</td><td>Corning Pyrex</td><td>99449-16X</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons à vis en PTFE filetés réutilisables GPI 45-415</td><td>Corning</td><td>9999-152</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie moléculaire personnelle (phosphorimager)</td><td>BioRad</td><td>170-9400</td><td></td></tr><tr><td>Cassette d’autoradiographie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FBCS810</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorscreen SO230</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide Mass Standards Kit</td><td>Sequazyme</td><td>P2-3143-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier S250-A</td><td>Branson</td><td>101063196</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml 12x32 mm Base conique Filetage</td><td>Flacon Thermo Fisher Scientific</td><td>C4000-V1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation chimique du lipide a de bactéries à gram négatif

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface cellulaire des bactéries gram-négatives, déposée sur le feuillet externe de la bicouche de la membrane externe. LPS peuvent être subdivisés en trois domaines: le O-polysaccharide distale, un oligosaccharide de noyau, et le lipide A domaine constitué d&#39;un lipide A des espèces moléculaires et des résidus d&#39;acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo). Le lipide A est le seul domaine composant essentiel pour la survie de la cellule bactérienne. Suite à la synthèse, le lipide A est chimiquement modifiée en réponse à des stress environnementaux tels que le pH ou la température, de favoriser la résistance aux composés antibiotiques, et d&#39;échapper à la reconnaissance par les médiateurs de la réponse immunitaire innée hôte. Le protocole suivant détaille l&#39;isolement à petite et grande échelle de lipide A partir de bactéries gram-négatives. Matériau isolé chimiquement est alors caractérisé par chromatographie sur couche mince (TLC) ou la spectrométrie de masse (MS). En plus de laser assistée par matrice de désorption / ionisation à temps de flumière (MALDI-TOF) MS, nous décrivons également les protocoles MS en tandem pour l&#39;analyse des lipides Une espèce moléculaire en utilisant l&#39;ionisation électrospray (ESI) couplée à dissociation induite par collision (CID) et nouvellement employés photodissociation ultraviolet (UVPD) des méthodes. Nos protocoles de MS permettent une détermination sans faille de la structure chimique, primordiale pour la caractérisation de molécules lipidiques A qui contiennent des modifications uniques ou de nouveaux produits chimiques. Nous décrivons également l&#39;étiquetage radio-isotopique, et isolement subséquent, de lipide A partir de cellules bactériennes pour l&#39;analyse par CCM. Par rapport à des protocoles MS, CCM fournit une méthode de caractérisation plus économique et plus rapide, mais ne peut pas être utilisé pour attribuer sans ambiguïté lipide A structures chimiques sans l&#39;utilisation des normes de la structure chimique connue. Au cours des deux dernières décennies isolement et la caractérisation de lipide A a conduit à de nombreuses découvertes passionnantes qui ont amélioré notre compréhension de la physiologie des bactéries, des mécanismes de résistance aux antibiotiques à Gram négatiftance, la réponse immunitaire innée humaine, et ont fourni de nombreuses nouvelles cibles pour le développement de composés antibactériens.

Canonical lipide A de E. coli et Salmonella enterica sérotype Typhimurium est un disaccharide hexa-acylés de la glucosamine avec des groupes de phosphate à 1 - et 4 &#39;positions. Au cours de la croissance dans des milieux riches (par exemple Luria Broth) une partie du lipide A contient un groupe pyrophosphate en position 1 qui donne une espèce de tris-phosphorylée 36 (figure 1). Kdo (3-désoxy-D-manno-octulosonique acide), est fixé à la 6&#39;-hyd...

Isolement et caractérisation des lipides Un domaine de lipopolysaccharide (LPS) des bactéries à Gram négatif donne un aperçu des mécanismes de surface cellulaire sur la base de la résistance aux antibiotiques, la survie des bactéries et de remise en forme, et comment chimiquement lipidique diversifié A espèces moléculaires moduler différemment les réponses immunitaires innées de l&#39;hôte.

Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler le lipopolysaccharide de la surface externe des bactéries à Gram négatif et de caractériser structuralement la portion de lipid A à l'aide de protocoles de spectrométrie de masse en tandem. Cela est réalisé par extraction chimique du lipopolysaccharide à partir de la surface cellulaire bactérienne, suivie d'une hydrolyse acide douce permettant de libérer le lipid A de la partie polysaccharidique du lipopolysaccharide. Dans un deuxième temps, une solution de lipid A est analysée par spectrométrie de masse en tandem avec ionisation par électrospray (ESI-MS/MS).Dans notre protocole, le lipid A est analysé par spectrométrie de masse en tandem fondée soit sur la dissociation induite par collision, soit sur la photodissociation ultraviolette, afin de caractériser sa structure. Les résultats révèlent des différences dans les profils de fragmentation observés dans les spectres de masse obtenus par ces deux approches, la photodissociation ultraviolette produisant un profil de fragmentation plus informatif. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait que la spectrométrie de masse en

isolation-chemical-characterization-lipid-from-gram-negative

Research

Recherche

JoVE Journal

Chemistry

Chimie

Nous décrivons une méthode modifiée de chaud extraction aqueuse de phénol pour purifier le lipopolysaccharide (LPS) de bactéries Gram-négatives. Une fois extraite, les LPS peuvent ensuite être analysées par SDS-PAGE et visualisés par coloration directe ou immunoblot de l'Ouest.

Purification et visualisation de lipopolysaccharide de bactéries à Gram négatif par Hot-phénol aqueux d&#39;extraction

Cette vidéo montre la séparation des acides mycoliques par chromatographie sur couche mince. Cette technique sépare les différents acides mycoliques – des lipides à longue chaîne présents dans la paroi cellulaire des mycobactéries – en fonction de leur polarité.

Séparation par chromatographie sur couche mince de variants d’acide mycolique : une méthode pour séparer les lipides de la paroi cellulaire mycobactérienne en fonction de la polarité

La paroi cellulaire bactérienne est composée de peptidoglycane, un réseau macromoléculaire de brins de sucre réticulés par des peptides. La chromatographie liquide ultra-performante offre une résolution et un débit élevés pour de nouvelles découvertes de composition de peptidoglycane. Nous présentons un procédé pour l’isolement des murs de cellules (sacculi) et leur préparation suivante pour l’analyse par l’intermédiaire d’UPLC.

Isolement et préparation de parois cellulaires bactériennes pour l’analyse de composition par chromatographie liquide ultra-performante

L’enrichissement des lipoprotéines bactériennes à l’aide d’une phase de surfactant non ionique, méthode de partitionnement est décrite pour une utilisation directe dans des essais de TLR ou d’autres applications. D’autres mesures sont détaillées pour préparer des N-terminal lipopeptides tryptique pour la caractérisation structurale par spectrométrie de masse.

Enrichissement des lipoprotéines bactériennes et préparation des Lipopeptides N-terminal pour la détermination de structure par spectrométrie de masse

Cette méthode fournit un cadre pour étudier l'incorporation des acides gras exogènes des sources hôtes complexes dans les membranes bactériennes, en particulier Staphylococcus aureus. Pour ce faire, des protocoles pour l'enrichissement des particules de lipoprotéines du jaune d'oeuf de poulet et le profilage suivant d'acide gras des phospholipides bactériens utilisant la spectrométrie de masse sont décrits.

Isolement des particules de lipoprotéine du jaune d'oeuf de poulet pour l'étude de l'incorporation d'acide gras de pathogène bactérien dans les phospholipides de membrane

Les bactéries gram-négatives produisent deux membranes spatialement séparées. La membrane externe est divisée de la membrane interne par un périplasme et une couche peptidoglycan. La capacité d’isoler les bilayers doubles de ces microbes a été critique pour comprendre leur physiologie et leur pathogénie.

Séparation de l’enveloppe cellulaire pour les bactéries Gram-négatives dans les fractions de membrane intérieure et extérieure avec des ajustements techniques pour Acinetobacter baumannii

Un protocole est présenté pour extraire la teneur totale en lipides de la paroi cellulaire d’un large éventail de mycobactéries. De plus, les protocoles d’extraction et d’analyse des différents types d’acides mycoliques sont présentés. Un protocole chromatographique sur couche mince pour surveiller ces composés mycobactériens est également fourni.

Analyse de la composition lipidique des mycobactéries par chromatographie sur couche mince

Radical basé sur la chimie biomimétique a été appliquée à la construction-up bibliothèques nécessaires pour le développement de biomarqueurs.

Radicaux libres en biologie chimique: de Comportement chimique au développement de biomarqueurs

L’origami d’ADN est une méthode puissante pour fabriquer des objets précis à l’échelle nanométrique en programmant l’auto-assemblage de molécules d’ADN. Nous décrivons ici un protocole pour le pliage d’un robot bio-réactif à partir d’origami d’ADN, sa purification et sa coloration négative pour l’imagerie au microscope électronique à transmission (MET).

Pliant et caractérisation d&#39;un Robot Bio-sensible de l&#39;ADN Origami

Le protocole décrit ici vise à expliquer et abréger les nombreux obstacles sur le chemin de la route complexe menant à nucléosides triphosphates modifiés. Par conséquent, ce protocole facilite à la fois la synthèse de ces éléments constitutifs activés et leur disponibilité pour les applications pratiques.

Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique

Apprenez à isoler et caractériser le lipide A de bactéries à Gram négatif par spectrométrie de masse en tandem. Cette méthode avancée révèle les mécanismes de résistance aux antibiotiques et les réponses immunitaires.

Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif

Explorer plus de vidéos