Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler le lipopolysaccharide de la surface externe des bactéries à Gram négatif et de caractériser structuralement la portion de lipid A à l'aide de protocoles de spectrométrie de masse en tandem. Cela est réalisé par extraction chimique du lipopolysaccharide à partir de la surface cellulaire bactérienne, suivie d'une hydrolyse acide douce permettant de libérer le lipid A de la partie polysaccharidique du lipopolysaccharide. Dans un deuxième temps, une solution de lipid A est analysée par spectrométrie de masse en tandem avec ionisation par électrospray (ESI-MS/MS).

Dans notre protocole, le lipid A est analysé par spectrométrie de masse en tandem fondée soit sur la dissociation induite par collision, soit sur la photodissociation ultraviolette, afin de caractériser sa structure. Les résultats révèlent des différences dans les profils de fragmentation observés dans les spectres de masse obtenus par ces deux approches, la photodissociation ultraviolette produisant un profil de fragmentation plus informatif. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait que la spectrométrie de masse en tandem permet de déterminer la structure des analytes ciblés grâce à l'interprétation de profils de fragmentation diagnostiques.

Les photos ultraviolettes, en particulier la dissociation par photolyse, constituent une méthode de spectrométrie de masse en tandem à haute énergie qui produit des ions fragments plus variés que les techniques existantes telles que la dissociation induite par collision. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la spectrométrie de masse par DUV n'étant pas encore commercialisée. En outre, cette méthode utilise un laser intégré à un spectromètre de masse grâce à une modification personnalisée effectuée avant le début de cette procédure.

Récupérez les cellules à partir d'une culture bactérienne de 250 ml ; centrifugez les cellules à 10 000 ×g pendant 10 minutes à 4 °C. Versez ensuite le surnageant du milieu, lavez le culot cellulaire avec 50 ml de 1× PBS. Après une nouvelle centrifugation pour reconstituer le culot, retirez le surnageant.

Ensuite, resuspendez les cellules dans 40 ml d’un PBS 1× et répartissez-les entre 2 tubes de centrifugation en téflon de 250 ml. Ajoutez 25 ml de chloroforme et 50 ml de méthanol à chaque tube pour obtenir un mélange monophasique. Mélangez par retournement et incubez à température ambiante pendant au moins 20 minutes.

Pour assurer une lyse cellulaire complète, centrifuger le mélange à 2000 ×g pendant 20 minutes à température ambiante et éliminer le surnageant. Laver le culot de LPS avec environ 100 mil d'un mélange monophasique de Bly dire. Centrifuger à 2000 ×g pendant 20 minutes et éliminer le surnageant.

Ajoutez 27 ml de tampon d'hydrolyse acide douce au culot de LPS et mélangez en pipetant de haut en bas jusqu'à ce qu'il ne reste que de petites particules. Soniquez à l'aide d'une sonde à ultrasons pour resuspendre de manière homogène. Suspendez le culot de LPS en solution à un cycle de travail constant pendant 20 secondes à 50 % de puissance. Répétez la sonication de l'échantillon deux fois, avec 20 secondes par impulsion et environ cinq secondes entre chaque impulsion.

Ensuite, faire bouillir les échantillons dans un bain-marie pendant 30 minutes. Retirer les tubes du bain-marie et laisser refroidir les échantillons à température ambiante. Avant de procéder à l'extraction de la lipidie A après hydrolyse, convertir la solution de SDS en un mélange biphasé BLY dire en ajoutant 30 mil de chloroforme et 30 mil de méthanol pour obtenir un mélange tampon d'hydrolyse acide douce au chloroforme-méthanol, puis mélanger par inversion et centrifuger.

Échantillon S pendant 10 minutes à 2000 fois G. À l’aide d’une pipette en verre, extraire la phase inférieure dans un tube à centrifuger en téflon propre. Ensuite, effectuer une deuxième extraction en ajoutant 30 ml de la phase inférieure provenant d’un mélange binaire biphasé préalablement équilibré à la phase supérieure dans le tube d’échantillon, mélanger par retournements et centrifuger à 2000 fois G pendant 10 minutes. Extraire la phase inférieure à l’aide d’une pipette en verre et rassembler avec la phase inférieure extraite précédemment.

Laver les phases inférieures regroupées en ajoutant 114 mL de la phase supérieure de bly dire pré-équilibrée pour créer un mélange biphasique de bly dire, mélanger par inversion et centrifuger à 2000 × g pendant 10 minutes à l’aide d’une pipette à transfert en verre. Transférer la phase inférieure dans un ballon propre d’évaporateur rotatif en verre et sécher l’échantillon par évaporation rotative.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres d'un mélange chloroforme-méthanol au ballon rotatif et soumettez à une sonication par bain pendant au moins 30 secondes afin de faciliter la mise en suspension du lipid A provenant des parois du ballon. Utilisez une pipette de transfert en verre pour transférer le lipide dans un tube en verre propre muni d'un bouchon vissable phénolique doublé de PTFE.

Séchez l'échantillon sous un courant d'azote à l'aide d'un appareil de séchage à l'azote. Resuspendez le lipide séché dans un millilitre d'un mélange chloroforme-méthanol. Après l'ajout du solvant, vortexez le mélange pour assurer une resuspension complète.

Transférez dans un petit flacon en verre et séchez à l’aide d’un appareil de séchage à l’azote. Conservez l’échantillon séché à moins 20 degrés Celsius jusqu’à une analyse ultérieure par CCM ou spectrométrie de masse. L’échantillon peut être conservé à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse ultérieure.

Une fois l'échantillon préparé, mélanger 200 microlitres de méthanol de qualité HPLC avec 200 microlitres de chloroforme de qualité HPLC dans un petit flacon en verre vide, puis transférer 200 microlitres du mélange solvant chloroforme-méthanol dans le flacon contenant la lipid A et sonifier le contenu du flacon pendant cinq minutes ou jusqu'à dissolution complète de la matière. Ensuite, préparer le spectromètre de masse pour l'ionisation par électrospray en mode négatif et remplir une seringue de 250 microlitres avec la solution de lipid A.

Insérez la seringue dans une pompe à seringue et administrez directement le lipide dilué. Un échantillon à un débit de 2,0 à 3,5 microlitres par minute. Optimisez et améliorez le signal ionique des lipides en ajustant l'optique ionique.

Recueillir le spectre de masse du lipide. Une espèce isole et active le lipide A cible en sélectionnant la fragmentation par collision induite par collision (CID) comme méthode MSM. Ensuite, augmenter la tension CID ou l'énergie de collision normalisée jusqu'au lipide précurseur.

Une espèce présente une abondance relative d'environ 10 % par rapport à l'ion produit le plus intense ; acquérez et moyennez les spectres jusqu'à ce qu'un rapport signal sur bruit suffisant soit atteint. Pour les ions produits, préparez l'échantillon et le spectromètre de masse comme décrit dans la section précédente. Activez le laser relié au spectromètre de masse.

Voir le protocole écrit pour les détails de spectrométrie de masse : configurez le logiciel de l'appareil de sorte que le laser déclenche le laser à excimères lorsque les ions pénètrent dans la cellule HCD ; ensuite, allumez le générateur d'impulsions de manière à ce que le laser émette une impulsion toutes les deux millisecondes. Isolez l'ion précurseur du lipide A en sélectionnant la fragmentation par collision dans la cellule HCD (HCD) comme méthode MS/MS, puis réglez l'énergie de collision à 1 % d'énergie de collision normalisée. Activez l'ion de lipide isolé en augmentant l'énergie du laser et en ajustant le nombre d'impulsions laser, généralement dix impulsions de six millijoules. Enfin, acquérez et moyennez les spectres jusqu'à obtention d'un rapport signal sur bruit suffisant.

Pour les ions produits UVPD. Le spectre de masse négatif en MALDI-TOF du lipid A provenant de la souche E. coli K-12 W3110 révèle l'espèce unique déprotonée à un rapport masse/charge de 1796,2 comme espèce majoritairement observée. Les détails de l'analyse par MALDI-TOF sont abordés dans le protocole du texte.

Alternativement, le même échantillon de lipides soumis à une ionisation ESI en mode négatif produit principalement des ions lipidiques doublement déprotonés à un rapport masse/charge principal de 898,1 ; des ions lipidiques déprotonés simples à un rapport masse/charge de 1796,20 sont également observables, mais avec une abondance relative plus faible par rapport aux espèces doublement déprotonées. La fragmentation par CID ou par UVPD à 193 nanomètres a été réalisée sur l'ion lipidique simplement déprotoné. Ces techniques permettent d'attribuer plus précisément les structures chimiques, en particulier celles des lipides.

Une espèce contenant des combinaisons complexes de modifications ou des modifications chimiques auparavant non caractérisées. Les profils de fragmentation sont indiqués par des lignes en pointillés représentant les sites de clivage et sont appariés aux valeurs du rapport de charge principal indiquées sous chaque structure fournie. Les valeurs du rapport de charge principal et les sites de clivage mis en évidence en rouge représentent des ions produits uniques associés au lipide marqué par l'UVPD 32 P.

Un A isolé à partir de deux souches différentes d'E. coli K-12 a été analysé par chromatographie sur couche mince (CCM). Le protocole de cette procédure est décrit en détail dans le protocole écrit. La souche K-12 W 3110 contient principalement du lipid A bis- et tris-phosphorylé, ou bien un profil CCM plus complexe est observé avec le lipid A marqué au 32P.

A isolée de la souche d’E. coli, WD 1 0 1. WD 1 0 1 produit un lipide. A fortement modifiée avec du rabino et de la phosphoéthanolamine.

Étant donné que les phosphates en position un et quatre primes sont tous deux accessibles à la modification, le lipid A de WD 1 0 1 peut être décrit comme étant simplement modifié, ne contenant qu'un seul résidu d'acide aminoarabinose ou de phosphoéthanolamine sur l'un des deux phosphates, ou doublement modifié, les deux phosphates étant alors modifiés de manière combinatoire. En plus des modifications des phosphates en position un et quatre primes, une addition de palmitate est également observée et augmente la valeur RF des espèces de lipid A dans ce système de solvant. Ce protocole a ouvert de façon unique la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer davantage les relations structure-fonction concernant l'impact des modifications du lipid A sur la biologie des bactéries à gram négatif.

Nous nous intéressons également de très près et avons démontré l'efficacité de la spectrométrie de masse fondée sur la photodissociation ultraviolette (UVPD) pour caractériser la structure de molécules biologiquement importantes, telles que les glycanes, les protéines, les acides nucléiques et d'autres lipides complexes. N'oubliez pas que manipuler des solvants organiques, des matériaux biologiquement dangereux et des lasers peut présenter des risques extrêmement élevés. Il est essentiel de souligner que les solvants doivent être manipulés sous hotte chimique ventilée.

Des équipements de protection appropriés, tels que des gants et des lunettes de protection, doivent toujours être portés, et le laser utilisé pour la DVPD doit être correctement blindé.