Un protocole d'induction génétique et visualisation des tumeurs bénignes et envahissantes dans céphalique Complexes de Drosophila melanogaster

L’objectif global de cette procédure est d’induire des tumeurs bénignes et invasives chez la drosophile, puis de les visualiser en disséquant le complexe céphalique larvaire. Cela commence par la mise en place d’un croisement entre les souches souhaitées et l’isolement de la progéniture larvaire, porteuse des tumeurs invasives ou bénignes. L’étape suivante consiste à disséquer les larves sélectionnées.

Exposer le complexe céphalique en les coupant d’abord aux deux tiers de la profondeur, en les fixant, puis en les retournant. Ensuite, les tissus adipeux du corps et de l’intestin sont nettoyés, puis tous les nerfs encore attachés au cordon nerveux ventral et à l’épiderme larvaire sont également cassés. La dernière étape consiste à imager le complexe céphalique ou à le fixer pour des applications en aval.

En fin de compte, les résultats peuvent montrer des tumeurs invasives ou bénignes marquées à la GFP grâce à l’utilisation de la microscopie à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à certaines des questions clés de la biologie du cancer. Par exemple, vous voudrez peut-être comprendre quels gènes pourraient inhiber la progression des tumeurs dans un organisme intact.

Une fois que les stocks génétiques requis ont été obtenus, préparez une culture de démarrage de la souche testeuse. Préparez également une culture de démarrage pour le stock testé. Croisez 10 femelles vierges du stock testeur avec 10 mâles du stock testé.

Laissez les mouches s’accoupler et pondre des œufs pendant 24 à 48 heures à 25 degrés Celsius, puis transférez-les dans un flacon frais pour produire plus de progéniture. Surveillez les flacons croisés à la recherche d’œufs et de larves du premier stade. Installez une nouvelle croix.

Si les flacons collectés présentent une mauvaise ponte des œufs. Si les flacons collectés commencent à sécher, ajoutez seulement trois à quatre gouttes d’eau distillée en autoclave pour garder la culture humide. Continuez à surveiller les flacons jusqu’à ce qu’ils se promènent.

Les larves du troisième stade sont présentes. Ensuite, procédez à leur surveillance au stéréomicroscope à fluorescence. En utilisant la même procédure, collectez les mouches porteuses de tumeurs invasives en utilisant les stocks répertoriés au cinquième ou sixième jour de culture, les larves errantes du troisième stade seront disponibles à partir des cultures de tumeurs bénignes.

Cependant, ils ne seront pas disponibles avant le 10e jour des cultures tumorales invasives. Pour recueillir les larves du troisième stade, mouillez un pinceau fin avec de l’eau distillée et grattez-les de la paroi de la fiole. Placez les larves dans une lame de dépression avec une XPBS froide, puis à l’aide d’un pinceau humide.

Grattez toute matière alimentaire de leur épiderme. Pour quelques minutes d’immobilisation, placez la larve sur la plaque à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour un temps d’immobilisation plus long, placez les larves dans un flacon de culture avec seulement une sieste sur une baguette.

Branchez le flacon de culture et laissez-le reposer pendant 40 minutes. Ensuite, transférez les larves immobilisées sur une lame de verre. Ajoutez une goutte d’huile de carburateur léger et couvrez les larves avec un verre de protection.

Maintenant, observez les larves sous un stéréomicroscope fluorescent. Pour l’expression de la GFP, sélectionnez les larves fluorescentes vertes et procédez à la dissection. Les larves porteuses de tumeurs bénignes deviendront vertes fluorescentes dans la région antérieure où le complexe céphalique est présent.

Les tumeurs invasives deviendront également fluorescentes en vert dans la région antérieure des larves au niveau du complexe céphalique. Si possible, assurez-vous de documenter les tumeurs fluorescentes. Ainsi, l’épiderme translucide de la larve rend difficile l’observation de l’étendue de la migration des tumeurs, et c’est pourquoi nous devons disséquer les tumeurs.

Commencez par utiliser des pinces pour transférer une larve fraîche avec l’une ou l’autre tumeur. Tapez à un puits d’une boîte de dissection contenant un millilitre de froid un XPBS. Maintenez les larves au sol à l’aide d’une paire de pinces à environ les deux tiers de la distance de l’extrémité antérieure.

À l’aide d’une autre paire de pinces, séparez intelligemment le tiers postérieur des larves et jetez-le. Il a ensuite lâché les deux tiers antérieurs. Au fur et à mesure que la pression à l’intérieur des larves est relâchée, son contenu suinte de la cavité corporelle.

À l’aide d’une pince, retirez les tissus qui ont suinté de la cavité corporelle. Ensuite, tenez le crochet buccal de la larve et enfoncez-le dans l’épiderme de la larve. À l’aide de l’autre paire de pinces, inversez complètement les larves.

Maintenant, avec la pince, doucement et soigneusement, retirez les glandes salivaires du corps adipeux, l’intestin, le complexe de disques alaires et tous les tubes trachéaux. Le complexe céphalique est maintenant visible attaché au crochet buccal. Les hémisphères cérébraux et le VNC sont toujours connectés à l’épiderme larvaire via les nerfs émanant du VNC.

À l’aide d’une pince, rompez doucement ces connexions. Ensuite, retirez tout excès de graisse corporelle ou d’autres tissus afin que le complexe céphalique devienne clairement visible. Attaché à l’épiderme larvaire au niveau des crochets buccaux.

Laissez le complexe céphalique tel quel pour un traitement ultérieur avant la visualisation. Sinon, pour visualiser directement le complexe céphalique, détachez-le de l’épiderme et placez-le dans une goutte de milieu de montage à base de glycérol tel qu’un bouclier vectoriel. En utilisant le protocole décrit, des tumeurs ont été induites dans l’œil.

Disque anin, les tumeurs bénignes sont restées localisées dans l’œil disque anin où elles sont induites. Notez que le tissu marqué à la GFP n’a pas migré vers des organes contigus comme le cordon nerveux ventral dans le complexe céphalique portant des tumeurs invasives à partir d’un jour 10 larve de tissu tumoral a été noté. De plus, comme le souligne la flèche rouge, les tumeurs ont envahi des organes contigus comme le VNC et les crochets buccaux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire génétiquement des tumeurs bénignes et invasives, puis de les visualiser en disséquant le complexe céphalique intra ano gastro.