Mise en place d'un

L'objectif général de cette procédure est d'établir un système de modèle de culture in vitro afin d'étudier le comportement intracellulaire d'un agent pathogène fongique humain opportuniste. Candida albicans dans des macrophages dérivés d'une lignée cellulaire monocytique humaine, THP-1. Pour ce faire, les monocytes THP-1 sont d'abord traités avec du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) afin de les différencier en macrophages.

Ensuite, les macrophages THP-1 sont infectés par des cellules Candida GTA deux heures après l'infection. Les cellules Candida GTA non phagocytées sont éliminées par des lavages au PBS, et les cellules intracellulaires sont récupérées pour des études ultérieures par osmolyse des macrophages infectés. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer à la fois l'internalisation virale des cellules Candida GTA par les macrophages ainsi que la maturation du phagosome et la réponse en cytokines dans les macrophages THP-1 suite à une infection par Candida GTA.

En outre, ce protocole peut être agrandi pour analyser la bibliothèque de mutants du collaborateur candida afin de détecter des profils de survie modifiés dans les macrophages TSP1 selon une méthode semi-haute performance. Le principal avantage de ce protocole est qu'il est relativement peu coûteux, hautement reproductible et facilement adaptable à différents types de cellules immunitaires ainsi qu'aux agents pathogènes fongiques. Pour commencer la procédure, deux jours avant l'infection, amenez les cellules THP-1 monocytaires à 80 % de confluence le jour un, retirez le milieu de culture et ajoutez lentement et délicatement du milieu pour remettre toutes les cellules adhérentes en suspension.

Transférez la suspension de cellules monocytes DHP dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Centrifugez la suspension cellulaire à température ambiante pendant quatre minutes à 1000 tr/min. Jetez le milieu dans un récipient pour déchets, puis ajoutez cinq ml de milieu pré-API dans le tube et remettez en suspension. Suspendez le culot de cellules THV en pipetant doucement le milieu trois à quatre fois.

Prélevez 10 microlitres de la suspension cellulaire pour déterminer la densité cellulaire à l’aide d’un cytomètre hématique, puis ajustez la densité cellulaire à 1 million de cellules par ml. Ajoutez un microlitre d’une solution mère de PMA à 60 micromolaire à la suspension cellulaire afin d’obtenir une concentration finale de 16 nanomolaire, puis mélangez soigneusement. Distribuez un ml de suspension cellulaire, correspondant à 1 million de cellules, dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 24 puits, puis transférez-la dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 % CO2.

Après 12 heures d'incubation, éliminez le vieux milieu. Ajoutez 1 ml de milieu pré-RPI dans chaque puits et incubez la plaque pendant encore 12 heures. Ces cellules seront utilisées pour l'infection Canada atory, qui sera présentée ultérieurement.

En utilisant des pratiques microbiologiques appropriées, inoculer une colonie unique d'EA dans un flacon contenant du milieu YPD ML. Incuber le flacon pendant 14 à 16 heures dans un incubateur réglé à 30 °C, puis centrifuger une culture de 1 mL à 4 000 tr/min pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et lavez les coquilles trois fois avec du PBS stérile. Après avoir éliminé le tampon de lavage, suspendez le pellet cellulaire dans 1 ml de PBS stérile par pipetage doux. Ensuite, mesurez l'absorbance de la suspension cellulaire dans un spectrophotomètre à 600 nanomètres et ajustez la densité cellulaire à 2 millions de cellules par ml avec du PBS.

Prenez 50 microlitres de la suspension cellulaire et diluez-la cent fois dans du PBS. Étalez 100 microlitres de la culture sur un milieu YPD AGA. Incubez la boîte à 30 degrés Celsius et comptez le nombre de colonies apparues sur la boîte YPD après un ou deux jours. Multipliez ce nombre par le facteur de dilution approprié pour calculer le nombre d'unités formant des colonies à l'heure zéro. Ce nombre d'unités formant des colonies de Canada Reta sera utilisé pour infecter les macrophages DHE.

Au prochain étape, ajoutez 50 µL de suspension de cellules Canada clater à la monocouche de macrophages dans une plaque de culture 24 puits. Agitez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules et incubez à 37 °C pendant deux heures. Éliminez le milieu en inversant la plaque de culture au-dessus d'un récipient, puis ajoutez soigneusement 1 ml de PBS tampon sériel le long de la paroi de chaque puits pour les rincer complètement, et éliminez ensuite le tampon.

Répétez cette étape deux fois supplémentaires. Ensuite, à l'exception du premier puits, ajoutez un mL de milieu RPI dans tous les autres puits, ce qui permettra de surveiller la réplication intracellulaire des cellules de candida à 4, 6, 12 et 24 heures post-infection. Pour récupérer les cellules intracellulaires après deux heures d'infection des macrophages, ajoutez un mL d'eau céréaleuse dans le puits phos. Après deux minutes, grattez délicatement le puits à l’aide de la pipette d’un mL afin d’éliminer les débris de macrophages présents dans le puits.

Rincez la cavité et recueillez le ly en un tube à centrifugation macro. Préparez une dilution au centième du lysat de cellules microFIT dans du PBS et déposez cent microlitres sur un milieu YPD AGA. Incubez la boîte à 30 degrés Celsius pendant un à deux jours et comptez le nombre d'unités formant colonies.

Multiplier ce nombre par le facteur de dilution approprié afin de dénombrer le nombre de cellules de canida ator phagocytées par les T deux et les macrophages après deux heures d'infection. De même, le nombre de cellules de canida ator intracellulaires peut être déterminé à différents points temporels. La post-infection et la réplication intracellulaire peuvent être représentées par une augmentation à 24 heures par rapport aux UFC internalisées après deux heures, comme indiqué ici.

Autres résultats d'une expérience typique dans laquelle le nombre total de cellules canida gator infectées par un macrophage est de six fois 10, deux par quatre. Le nombre de cellules récupérées après deux heures est de 3,7, six fois 10,4. Cela illustre ainsi que les cellules e sont phagocytées à un taux de 62,66 % au cours de la période de co-incubation de 24 heures.

Toutes les cellules, à l'exception des cellules E, ont montré une réplication de 5,2 fois lorsque le nombre de cellules E intracellulaires est passé de 3,76 × 10⁴ à 1,96 × 10⁵. Dans cette expérience, la réplication intracellulaire des cellules TER canides peut également être évaluée à l'aide de cellules E exprimant la GFP, en utilisant un microscope confocal pour cela. Préparez et infectez les cellules THV et les macrophages dans une lame à quatre chambres en suivant le protocole décrit précédemment pour la plaque de culture à 24 puits.

Deux heures après l'infection. Éliminer le milieu en retournant la lame dans un récipient à déchets, en ajoutant 500 microlitres de PBS dans chaque chambre de la lame. Rincer soigneusement et éliminer le PBS.

Répétez cette étape deux fois supplémentaires avec 500 microlitres de formaldéhyde à 3,7 % pour fixer les cellules. Incubez la lame à température ambiante pendant 20 minutes, puis éliminez le formaldéhyde. Lavez chaque puits avec 500 microlitres de PBS pour perméabiliser les macrophages, puis ajoutez 500 microlitres de Triton X ; après une incubation de cinq minutes, retirez le Triton X et lavez à nouveau le puits avec du PBS.

Démontez soigneusement la lame à chambre à l’aide d’un outil de retrait de chambre et d’une lame porte-échantillon. Déposez une goutte de milieu de montage Vector Shield contenant du DPI sur chaque secteur de la lame, posez une lamelle et scellez les bords avec du vernis à ongles. Observez les cellules au microscope confocal. Les images confocales représentatives présentées ici montrent des macrophages TP1 infectés par Canida exprimant le type sauvage, des cellules laborantines, avec une augmentation d’environ six fois du nombre de cellules intracellulaires entre deux et 24 heures, ce qui indique une réplication de Canida laborantin dans les macrophages TP1. L’approche de mutagenèse par balise spécifique est largement utilisée pour identifier les facteurs de virulence chez les agents pathogènes microbiens, où un grand nombre de mutants sont simultanément criblés pour détecter des défauts de croissance à l’aide d’une séquence oligonucléotidique unique servant de balise.

Ici, nous décrivons notre protocole de criblage STM de la bibliothèque Canada et de la bibliothèque de mutants, qui comprend les trois étapes suivantes. Premièrement, 96 plasmides, chacun portant une pile de séquences d'oligonucléotides unique, sont immobilisés sur une membrane en nylon.

Dans la deuxième étape, un ensemble de 96 mutants d'activateur CANIDA est analysé pour détecter des profils de survie modifiés dans les macrophages THP-1, suivie de la récupération des cellules mutantes internalisées par les macrophages et cultivées dans du YPD, qui seront respectivement désignées comme échantillons d'entrée et de sortie. Enfin, les marqueurs d'ADN spécifiques sont amplifiés par PCR et marqués radioactivement à partir des échantillons d'ADN génomique d'entrée et de sortie. Le produit de PCR est hybridé avec des marqueurs uniques et les signaux radioactifs sur la membrane sont quantifiés et analysés.

Pour assembler l'appareil à plaque 96 puits de 12 points, placez une membrane en nylon humide sur du papier absorbant humide et serrez les vis de l'unité. Lavez la membrane avec de l'eau stérile, puis effectuez un lavage avec de l'hydroxyde de sodium 0,4 µ. Transférez 200 nanogrammes de solution d'ADNc de PLA du bloc 96 × 12 vers les puits correspondants du dispositif à points après un lavage à l'hydroxyde de sodium 0,4 molaire.

Retirer la membrane de l'appareil à taches sanguines après une différence dans deux XXSC faisant passer l'ADNb plasmatique transféré sur la membrane dans un appareil de réticulation UV. Incuber les membranes dans un tampon de pré-hybridation anténal et dans des flacons UNE pendant deux heures à 42 degrés Celsius. Préparer des sondes radioactives par PCR en utilisant l'ADN génomique extrait des palettes cellulaires d'entrée et de sortie ainsi que des amorces dirigées contre la région flanquante inversée des marqueurs uniques.

Dénaturez les sondes marquées au radioactif à 99 degrés Celsius pendant cinq minutes et refroidissez rapidement en les plaçant sur de la glace. Transférez les sondes dénaturées dans les flacons d'entrée et de sortie et incubez de 14 à 16 heures à 42 degrés Celsius. Après hybridation.

Lavez les membranes d'entrée et de sortie comme décrit dans le protocole. Retirez les membranes des bouteilles, laissez-les sécher à l'air, puis exposez-les à un écran de détection de phosphore. Après deux à trois heures, numérisez l'écran de phosphore et acquérez les images.

Dans cet exemple, deux filtres membranaires hybridés sont présentés, ce qui correspond au criblage d'un pool de 96 mutants de Canida Gatory pour détecter une survie modifiée. Dans ce cas, la quantification dans les macrophages et la détermination du rapport de l'intensité du signal de chaque point sur la membrane de sortie par rapport à celle d'entrée ont révélé que les numéros de marqueurs 13, 26, 75 et 85 sont sous-représentés en sortie. Ces taches sont entourées en rouge et reflètent la croissance de quatre mutants différents.

En revanche, les mutants portant les séquences uniques 11 et 81, mises en évidence en vert, sont surreprésentés dans l'échantillon de sortie. Autrement dit, à partir de cet écran, parmi un pool de 96 mutants, deux mutants devraient augmenter la survie, tandis que quatre mutants présentent une croissance dans les macrophages. Les phénotypes de survie modifiés identifiés lors d’un tel écran en pool doivent être confirmés par des tests d’infection individuelle.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en œuvre d'un système oral in vitro pour étudier le profil de croissance intra du champignon pathogène de votre choix. De plus, vous devriez être en mesure d'effectuer un criblage à grande échelle de pools de mutants en utilisant désormais ce système.