Mise en place d'un In vitro Système d'étudier le comportement intracellulaire de Candida glabrata En droits macrophages THP-1

L’objectif général de cette procédure est d’établir un système modèle de culture in vitro pour étudier le comportement intracellulaire d’un agent pathogène fongique opportuniste humain. Rotin de laboratoire Canida dans les macrophages dérivés de la lignée cellulaire monocytaire humaine TP one. Pour parvenir à ce THP, un monocyte est d’abord traité avec quatre esters pour les différencier en macrophages.

Ensuite, les macrophages THP 1 sont infectés par des cellules GTA canidés deux heures après l’infection. Les cellules GTA canida non phagocytaires sont éliminées par des laveurs de PBS et les cellules e intracellulaires sont récupérées pour des études ultérieures par osmos de macrophages infectés. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer à la fois les cellules GTA virales à canida dans les macrophages ainsi que la maturation de Faiz Ross et la réponse des cytokines dans la THP sur les macro FIDS lors d’une infection à candida GTA.

De plus, ce protocole peut être étendu pour cribler la banque de mutants collaborateurs de candida pour des profils de survie modifiés dans les macrophages TSP one de manière semi-haut débit. Le principal avantage de ce protocole est qu’il est relativement peu coûteux, hautement reproductible et facilement adaptable à différentes cellules immunitaires ainsi qu’à des agents pathogènes fongiques. Pour commencer la procédure deux jours avant l’infection, amenez le THP et les cellules monocytaires à 80 % de CO le premier jour, éliminez le risque de culture et lentement, doucement pour mettre toutes les cellules subtiles en suspension.

Transvasez la suspension de cellules monocytaires DHP dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifugeuse La suspension de la cellule à température ambiante pendant quatre minutes À 1000 tr/min Deccan le milieu dans un récipient à déchets à cinq ml de milieu pré API dans le tube et reus. Mettez en suspension la pastille d’une cellule THV en pipetant doucement le milieu trois quatre fois.

Prenez 10 microlitres de suspension cellulaire pour déterminer la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la densité cellulaire à 1 million de cellules par ml. Ajoutez un microlitre d’une solution mère de PMA de 60 micromolaires à la suspension cellulaire de sorte que la concentration finale soit de 16 anomolaires et mélangez bien. Versez une suspension cellulaire d’un ml correspondant à 1 million de cellules dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et transférez-la dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Après 12 heures d’incubation, jetez l’ancien milieu. Ajoutez un ml de milieu pré-RPI dans chaque puits et incubez la plaque pendant encore 12 heures. Ces cellules seront utilisées pour l’infection au Canada, qui sera illustrée plus loin.

En utilisant des pratiques microbiologiques appropriées, inoculez une seule colonie d’EA dans un milieu contenant ML YPD. Incuber le flass pendant 14 à 16 heures dans un incubateur réglé à 30 degrés Celsius après l’incubation centrifuge. Une culture ML à 4 000 tr/min pendant cinq minutes.

Jetez le supnatin et lavez les coquilles trois fois avec du PBS stérile. Après avoir jeté le tampon de lavage, suspendre la palette cellulaire dans un ml de PBS stérile par pipetage doux. Ensuite, mesurez l’absorbance de la suspension cellulaire dans un spectrophotomètre à 600 nanomètres et ajustez la densité cellulaire à 2 millions de cellules par ml avec du PBS.

Prendre 50 microlitres de suspension cellulaire et diluer cent fois dans une plaque d’épandage PBS une culture de cent microlitres sur milieu AGA YPD. Incuber la plaque à 30 degrés Celsius et compter le nombre de colonies qui sont apparues sur la plaque YPD après un ou deux jours, multipliez ce nombre par le facteur de dilution approprié pour calculer les unités de formation de colonies zéro heure. Ces nombreuses unités formant des colonies de Canada Reta seront utilisées pour infecter la DHE sur les macrophages.

À l’étape suivante, ajoutez 50 macrolitres de suspension de cellules de clater Canada à la monocouche de macrophages dans une plaque de culture de 24 baleines. Souillez la plaque pour répartir uniformément chaque cellule et incubez à 37 degrés Celsius après deux heures d’incubation. Jetez le milieu en inversant la plaque de culture dans un récipient à chaque puits de la plaque de culture à ml de PBS en série soigneusement le long du côté des puits de puits et jetez le tampon.

Répétez cette étape deux fois de plus. Ensuite, à l’exception du premier puits, ajoutez un milieu ML RPI à tous les autres puits, qui peut être utilisé pour surveiller la réplication intracellulaire des cellules candidatives à 4, 6, 12 et 24 heures après l’infection pour récupérer les cellules e intracellulaires après deux heures d’infection par les macrophages, ajoutez une eau de céréales ML au phos. Bien après deux minutes, raclez doucement le puits avec la pointe ML piper pour enlever les débris de macrophages du puits.

Rincez le puits et recueillez-le dans un tube à poisson macro centri. Préparez une dilution de cent fois de lysat cellulaire microFIT dans du PBS et plaquez cent microlitres sur un milieu AGA YPD. Incuber la plaque à 30 degrés Celsius pendant un à deux jours et compter le nombre d’unités formant colonie.

Multipliez ce nombre par le facteur de dilution approprié pour énumérer le nombre de cellules canidées phagocytaires par T deux et de macrophages après deux heures d’infection. De même, le nombre de cellules canidées intracellulaires peut être déterminé à différents points temporels. La post-infection et la réplication intracellulaire peuvent être représentées comme une augmentation de la à 24 heures par rapport aux UFC internalisées à deux heures montrées ici.

Autres résultats d’une expérience typique dans laquelle le nombre total de cellules d’alligator canida infectées à TV un macrophages est de six fois 10, deux pour quatre. Le nombre de cellules récupérées à deux heures est de 3,7, soit six fois 10,4. Illustrant ainsi que les cellules e sont phagocytées à un taux de 62,66 % pendant la période de co-incubation de 24 heures.

Les cellules autres qu’une réplication de 5,2 fois peuvent être multipliées par 5, le nombre de cellules E intracellulaires étant passé de 3,76 fois 10,4 à 1,96 fois 10,5. Dans cette expérience, la réplication intracellulaire des cellules TER canidées peut également être évaluée à l’aide de cellules E exprimant la GFP au microscope confocal. Préparez et infectez le THV et les macrophages dans une lame à quatre chambres en utilisant le protocole décrit précédemment pour la plaque de culture à 24 puits.

Deux heures après l’infection. Jetez le fluide en inversant la lame dans un récipient à déchets à 500 microlitres PBS dans chaque chambre de la lame. Rincez bien et jetez le PBS.

Répétez cette étape deux fois de plus à 500 microlitres de 3,7 % de hauteur formelle pour fixer les cellules. Incuber la lame à température ambiante pendant 20 minutes et jeter la lame formelle de Height. Lavez chaque prix de puits avec 500 microlitres de PBS pour perméer mobiliser les macrophages à 500 microlitres de triton X après cinq minutes d’incubation, retirez le triton X et lavez le puits avec du PBS.

Démontez soigneusement la glissière de la chambre à l’aide d’un retrait de la chambre et d’une glissière de cavalier d’air. Placez une goutte de support de montage Vector Shield contenant DPI sur chaque secteur de la diapositive, montez une lamelle et scellez les bords avec de la peinture à ongles, des cellules visualisées sous un microscope confocal. Voici les images confocales représentatives de TP un macrophages infectés par GFE exprimant des cellules de laboratoire canidés de type sauvage Environ une multiplication par six du nombre de cellules e intracellulaires de deux à 24 heures est indicative de la réplication en laboratoire de canidés dans l’approche de mutagenèse de signature de l’étiquette de TP un macrophages est largement utilisée pour identifier les facteurs ulentifs chez les agents pathogènes microbiens dans lesquels un grand nombre de mutants sont simultanément criblés pour les défauts de croissance via un oligonucléotide unique sequence.

Nous décrivons ici notre protocole pour l’écran STM de la Bibliothèque du Canada et de la bibliothèque mutante, qui consiste à suivre trois étapes. 96 premiers plasmides. Chacun d’entre eux hébergeant une séquence unique d’oligonucléotides, un empilement est immobilisé sur une membrane en nylon.

Dans un deuxième temps, un groupe de 96 mutants CANIDA ator est examiné pour des profils de survie modifiés dans les macrophages THV un, suivi de la récupération des cellules YPD, cultivées et des cellules e mutantes internalisées par les macrophages, qui seront appelées respectivement échantillons d’entrée et de sortie. Enfin, les étiquettes de signature ADN sont amplifiées PCI et radiomarquées à partir d’échantillons d’ADN génomique d’entrée et de sortie. Le produit PCR est hybridé à des marqueurs uniques et les signaux radioactifs sur la membrane sont quantifiés et analysés.

Pour assembler l’appareil de tableau 96 12 points, placez une membrane en nylon humide sur un papier d’arbre à vent humide et serrez les vis de l’appareil. Lavez la membrane avec de l’eau stérile, puis un lavage avec de l’hydroxyde de sodium 0,4 mu. Transfert de 200 nanogrammes de solution de PLA BDNA du bloc 96 12 vers les puits correspondants de l’apptus de sang de point Après un lavage à l’hydroxyde de sodium de 0,4 molaire.

Retirez la membrane de l’appareil sanguin après une conférence en deux XXSC croisant le plasma BDNA transféré à la membrane dans un réticulant UV. Incuber La membrane est en pré-hybridation antennaire, tampon et entrée et UNE bouteilles pendant deux heures à 42 degrés Celsius. Préparez des sondes de niveau radio par PCR à l’aide d’ADN génomique extrait de palettes de cellules d’entrée et de sortie et d’amorces contre la région flanquante inversée de marqueurs uniques.

Dénaturez les sondes de l’étiquette radio à 99 degrés Celsius pendant cinq minutes et faites claquer le gel sur la glace. Transférez les sondes dans les bouteilles d’entrée et de sortie et incubez pendant 14 à 16 heures à 42 degrés Celsius. Post-hybridation.

Lavez les membranes d’entrée et de sortie comme décrit dans le protocole. Sortez les membranes des flacons, faites-les sécher à l’air libre et exposez-les à un écran d’images phospho. Après deux à trois heures, balayez l’écran au phosphore et acquérez des images.

Dans cet exemple, deux filtres à membrane hybrides sont représentés, ce qui représente le criblage d’un groupe de 96 mutants canidés Gatory pour une survie altérée. Dans un macrophage, la quantification et la détermination du rapport entre l’intensité du signal de chaque point de sortie et la membrane d’entrée ont révélé que les numéros de balise 13, 26, 75 et 85 sont sous-représentés dans la sortie. Ces piles sont entourées de rouge et reflètent la croissance de quatre mutants différents.

En revanche, les mutants s’empilent avec des séquences uniques 11 et 81 surlignées en vert sont surreprésentées dans l’échantillon de sortie. En d’autres termes, à partir de cet écran, un pool de 96 mutants deux mutants devraient augmenter la survie tandis que quatre mutants se manifestent à la croissance dans les macrophages. Les phénotypes de survie modifiés identifiés dans un tel dépistage en pool devraient être vérifiés dans des tests d’infection uniques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’agir et d’étudier le profil intra-croissance du pathogène fongique qui vous intéresse. De plus, vous devriez être en mesure d’effectuer un criblage de pool de mutants à grande échelle en utilisant le système maintenant.