Génération et quantification 3-Dimensional des lésions artérielles chez la souris utilisant la tomographie optique de projection

L’objectif global de cette procédure est de démontrer comment la tomographie par projection optique peut être utilisée pour la visualisation et la quantification tridimensionnelle des lésions athéroscléreuses et néointimales chez la souris. Ceci est accompli en générant d’abord des lésions artérielles chez les souris, soit chirurgicalement, soit en donnant un régime riche en cholestérol à des souris prédisposées à développer de l’athérosclérose. L’étape suivante consiste à isoler l’artère cible et à la scanner à l’aide d’une tomographie par projection optique.

Les dernières étapes consistent à effectuer une reconstruction de l’image, à identifier la lésion et à mesurer le volume de la lésion. En fin de compte, les résultats peuvent montrer des reconstructions anatomiques de la lésion et quantifier le volume de la lésion et le rétrécissement artériel par l’analyse d’images. Notre groupe s’intéresse à la compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation de lésions qui causent un rétrécissement artériel entraînant des complications potentiellement mortelles telles que la crise cardiaque et l’accident vasculaire cérébral.

Cette application de la tomographie par projection optique a été développée dans notre groupe par le Dr Nicholas Kirkby, en collaboration avec le Dr Lucy Lowe, et elle sera démontrée par le Dr Jung Shi Wu, qui est un scientifique postdoctoral travaillant dans nos laboratoires. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’histologie et l’immunohistochimie, est qu’elle demande moins de main-d’œuvre et qu’elle permet une analyse tridimensionnelle plutôt que bidimensionnelle. Cette technique pour induire des lésions de l’artère fémorale est modifiée par rapport à celles de R et compagnie et de Sada et compagnie.

Le protocole textuel explique comment induire des lésions athéroscléreuses par manipulation alimentaire. Commençons avec une souris C 57 black six de 10 à 12 semaines pesant entre 25 et 30 grammes. Une fois anesthésiée, placez la souris sur un coussin chaud pour maintenir sa température corporelle et fournir une quantité de fluor à deux à 3 % via un cône nasal.

Lorsque la souris ne répond pas à un pincement de l’orteil, administrez de la buprénorphine à raison de 0,1 milligramme par kilogramme. Ensuite, placez la souris sur son dos et rasez la surface ventrale du membre postérieur gauche. Faites ensuite une incision pour exposer les muscles du membre postérieur supérieur entre la bifurcation de l’artère poplitée et la paroi abdominale.

Faites une dissection contondante pour isoler le nerf fémoral de l’artère et de la veine fémorales tout au long de la procédure. Gardez les tissus humides avec 1 % en poids par volume li canine. Ensuite, placez des ligatures temporaires en soie 6.0 Mers autour de l’artère fémorale et de la veine près de la paroi abdominale et immédiatement en dessous de la branche avec l’artère poplitée.

Il s’agit de contrôler la circulation sanguine. Ensuite, isolez l’artère poplitée, distale de deux à cinq millimètres par rapport à la branche avec l’artère fémorale, et ligaturez l’artère poplitée sous l’artère poplitée. Placez une deuxième ligature.

Maintenant, faites une petite incision pour l’insertion du fil dans l’artère poplitée immédiatement distale de la branche avec l’artère fémorale. Appliquez une pression sur la ligature temporaire proximale pour éviter les saignements à travers l’incision et dans l’artère fémorale vers la paroi abdominale. Insérez un fil G de 0,014 pouce d’environ un à 1,5 centimètre.

Laissez-le en place pendant 30 secondes, puis retirez-le. Puis, à l’aide des ligatures, l’artère poplitée au-dessus de l’incision. Veillez à ne pas obstruer l’artère fémorale.

Retirez maintenant les ligatures temporaires. Fermez la plaie avec des sutures discontinues à l’aide de mercal 5.0. Appliquez ensuite la crème EMLA.

Laissez l’animal reprendre conscience et bouger dans la cage de récupération avant de le ramener dans la cage d’origine. On s’attend à ce que la patte soit boiteuse pendant deux ou trois jours, mais cela ne signifie pas que la souris doit être isolée. Pour l’OPT, la souris doit être euthanasiée, induire une anesthésie terminale à partir du pentobarbital.

Faites ensuite une fixation de perfusion trans cardiaque avec exsanguination. Isolez maintenant les artères fémorales ou l’arc aortique et ses branches. Retirez tout matériau périal étranger au cours du processus.

Ensuite, postfixez le tissu dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant la nuit. Le lendemain, soit stocker le tissu dans de l’éthanol à 70 %, soit procéder à l’intégration des artères dans des aéros filtrés à 1,5 % LMP. Abaissez doucement le tissu dans l’aéros fondu à environ 40 degrés Celsius.

Coupez les aéros pour leur donner une forme conique. Maintenant, déshydratez cette préparation dans du méthanol à 100 % pendant au moins 12 heures. Une fois déshydratés, nettoyez les vaisseaux dans un mélange d’alcool benzo et de benzoate de benzo.

Laissez les vaisseaux incuber dans cette solution pendant 12 à 24 heures. Le lendemain, chargez l’échantillon nettoyé dans le tomographe, qui doit être pré-étalonné. La résolution est fixée à 1024.

Par 1024 pixels. Réglez l’agrandissement de la zone d’intérêt. L’axe Z sera automatiquement réglé sur la même résolution.

La taille du voxel sera d’environ 200 microns. Ensuite, à l’aide du canal Brightfield, positionnez l’échantillon de manière à ce qu’il tourne autour de son propre axe au centre du champ de vision. À l’aide du canal d’émission GFP à un filtre, réglez la mise au point et ajustez l’exposition pour maximiser la plage dynamique de l’image.

Évitez la sursaturation. Maintenant, balayez le récipient dans le GFP un seul canal d’émission avec des pas de 0,9 degré. Les échantillons doivent ensuite être renvoyés à 100 % de méthanol pendant au moins 24 heures avant d’être enrobés dans la cire.

Pour l’analyse histologique, ouvrez les images acquises dans un logiciel de reconnaissance ou un logiciel similaire à l’aide d’un logiciel de visualisation de données. Vérifiez la qualité de la reconstruction de l’image, améliorez la qualité de l’image, ajustez l’intensité de l’image et demandez au logiciel de compenser tout désalignement de l’échantillon par rapport à son axe de rotation idéal. Pour chaque balayage, définissez la région verticale d’intérêt contenant la lésion.

Toutes les 50 lignes de balayage, tracez la frontière entre le support et la position de la lame élastique interne. Le logiciel peut ensuite interpoler la bordure dans tous les autres scans, vérifier manuellement ces interpolations et les corriger si nécessaire. Produisez maintenant un ensemble d’images binaires avec les pixels blancs représentant neointima et les pixels noirs représentant le lumen breveté.

Pour ce faire, il définit les seuils d’intensité. Une fois cela accompli, le volume de l’objet est le volume total de la lésion et le volume luminal est le volume total, moins le volume de l’objet. Ainsi, la distribution de la lésion et de la lumière le long de la longueur axiale est évaluée.

Des artères fémorales murines ont été prélevées 28 jours après une lésion induite par un fil ou une ligature. L’épaississement néointimal était évident dans les projections d’émission dans les lames bidimensionnelles reconstruites. Des lésions néointimales concentriques ont pu être distinguées.

Des images d’émission de tomographie par projection optique de l’ensemble de l’arc aortique d’une souris déficiente en APOE ont permis d’identifier les lésions attendues dans la moindre courbure de l’arc aortique, l’artère brachiocéphalique et les origines des artères carotide gauche et sous-clavière. La même lésion a été segmentée et rendue en rouge. Pour souligner la distribution des plaques lorsqu’elles sont superposées à l’image originale, les supports et la lumière ont pu être distingués dans des images en coupe transversale montrant qu’il s’agissait de lésions excentriques.

Ici, au fur et à mesure que le balayage se déplace distalement le long de ces branches, les lésions diminuent progressivement et disparaissent d’abord dans l’artère sous-clavière, puis dans la carotide et enfin dans l’artère brachiocéphale. Fait intéressant, cette lésion de l’artère brachiocéphale se déplace vers le diviseur de flux lorsque ce vaisseau se divise en artères carotide droite et sous-clavière droite. Après la procédure OPT, d’autres méthodes telles que l’histologie et l’immunohistochimie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la composition de la lésion ?

Ainsi, après son développement, cette technique a ouvert la voie aux scientifiques travaillant dans le domaine de la recherche vasculaire pour étudier le rôle des récepteurs endothéliaux, des lectines et des enzymes métabolisant les stéroïdes dans le développement des lésions néo-intimales et athérosclérotiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir et d’analyser les lésions des artères rine à l’aide de la tomographie par projection optique.