Analyse de la teneur en acide gras et de la composition en microalgues

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la teneur totale et la composition en acides gras chez les microalgues. Cela est réalisé en préparant d'abord un échantillon contenant une quantité connue de biomasse algale lyophilisée. La deuxième étape consiste à rompre la biomasse microalguée.

Ensuite, les composants lipophiles sont extraits et isolés. La dernière étape consiste en la transestérification des lipides d'ACell en esters méthyliques d'acides gras. Enfin, la chromatographie en phase gazeuse est utilisée pour quantifier les acides gras.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les dosages de tric, est qu'elle est très précise et mesure spécifiquement tous les acides gras ainsi que tous les autres composants lipophiles. La procédure sera démontrée par NDI Afer, un technicien de notre laboratoire. Avant de commencer cette procédure, déterminez la concentration en poids sec d'algues, en grammes par litre, dans le bouillon de culture, comme indiqué dans la référence mentionnée. Transférez un volume de bouillon de culture contenant cinq à 10 milligrammes de poids sec d'algues dans un tube à centrifuger en verre.

Calculez la quantité exacte de biomasse transférée en utilisant la concentration de biomasse déterminée précédemment, puis centrifugez l'échantillon pendant cinq minutes à 1200 G. Jetez une partie du surnageant, en laissant environ 0,25 millilitre dans le tube. Ensuite, resuspendez les algues dans le surnageant restant en pipetant doucement le culot de haut en bas, puis transférez le mélange cellulaire dans un tube de broyeur à billes.

À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, rincez le tube de centrifugation et la pointe de pipette avec environ 0,15 millilitre d’eau milliQ et transférez le liquide dans le tube du broyeur à billes. Centrifugez le tube du broyeur à billes pendant une minute à vitesse maximale afin de vous assurer qu’aucune bulle d’air ne subsiste au fond du tube. Une fois terminé, lyophilisez le matériau contenu dans le tube selon ce qui suit.

Préparez une solution de 50 milligrammes par litre de tripenta déano dans un rapport volumétrique enrichi de chloroforme sur méthanol. À l’aide d’une pipette à déplacement positif, ajoutez un millilitre de la solution de tripoda à aucun dans le tube à billes. Vérifiez qu’il ne reste aucune bille à l’intérieur du bouchon du tube du batteur à billes, car cela entraînerait une fuite de la bille du tube.

Frapper le tube du batteur huit fois à 2 500 tr/min pendant 60 secondes chaque fois, avec un intervalle de 122e entre chaque battement. Ensuite, transférer la solution contenant les billes du tube du batteur vers un tube propre en verre de centrifugation de 15 millilitres résistant à la chaleur, muni d’un bouchon vissable à insert en téflon. Rincer le tube du batteur avec un millilitre de la solution de tripod, puis transférer le rinçage dans le tube en verre pour centrifugation.

Répétez deux fois supplémentaires. Vortexez l'échantillon pendant cinq secondes, puis soumettez-le à une sonication pendant 10 minutes. Après la sonication, ajoutez 2,5 millilitres d'une solution aqueuse de pH 7 contenant 50 millimolaire de triss et un molaire de chlorure de sodium dans le tube de centrifugation.

Une fois l'échantillon vortexé et soniqué une deuxième fois, centrifuger pendant cinq minutes à 1200 ×g. Une fois terminé, transférer soigneusement la phase inférieure de chloroforme dans un tube en verre propre à l’aide d’une pipette en verre, puis répéter l’extraction avec un millilitre de chloroforme. À la fin, recueillir la phase de chloroforme à l’aide d’une pipette en verre et rassembler avec la première fraction de chloroforme.

Évaporer le chloroforme à l’aide d’un courant de gaz azote afin d’obtenir les lipides extraits séchés. Ensuite, ajouter trois millilitres de méthanol contenant 5 % d’acide sulfurique dans le tube contenant les lipides extraits séchés et le fermer hermétiquement. Vortexer l’échantillon pendant cinq secondes.

Incuber les échantillons pendant trois heures à 70 degrés Celsius dans un bloc chauffant. Vérifier périodiquement que les échantillons ne bouillent pas et vortexer le tube après chaque vérification. Une fois l'échantillon refroidi à température ambiante, ajouter trois millilitres d'eau milli-Q et trois millilitres de n-héxane au tube, puis mélanger au vortex.

Agiter l'échantillon pendant 15 minutes à l'aide d'un agitateur rotatif pour tubes à essai. Après avoir retiré les échantillons de l'agitateur rotatif, les centrifuger pendant cinq minutes à 1200 G. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélever deux millilitres de la phase supérieure d’hexane et la transférer dans un tube en verre propre. Pour laver la phase d’hexane recueillie, ajouter deux millilitres d’eau Milli-Q dans le tube en verre.

Ensuite, vortexer l'échantillon pendant cinq secondes et centrifuger pendant cinq minutes. À 1200 G, transférer la phase hexane du tube en verre dans un flacon GC à l'aide d'une pipette Pasteur en verre. Puis placer un bouchon sur le flacon GC et le serrer pour éviter l'évaporation du solvant.

Placer le flacon d'échantillon dans le carrousel automatique de l'instrument de chromatographie en phase gazeuse. Enfin, analyser l'échantillon sur l'instrument avec une colonne neuve en utilisant un débit total de 20 millilitres par minute et un volume d'injection d'un microlitre. Consulter le protocole écrit pour les spécifications de la colonne et les conditions chromatographiques.

Un chromatogramme typique obtenu par ce procédé est montré ici. Les esters méthyliques d'acides gras sont séparés par taille et degré de saturation par la colonne de chromatographie en phase gazeuse, et selon le protocole utilisé, les acides gras à chaîne plus courte et plus saturés présentent des temps de rétention plus courts. La colonne GC et le protocole utilisés ne visent pas à séparer les isomères d'acides gras, mais cela pourrait être réalisé en utilisant une colonne GC et un protocole différents.

La teneur et la composition en acides gras de C Desus UEX 3 93 dans des conditions suffisantes et déficientes en azote sont présentées ici. Les teneurs totales en acides gras étaient de 8,6 ± 0,5 % et de 44,7 ± 1,7 % respectivement dans des conditions de culture avec suffisance azotée et en carence azotée. Ces valeurs montrent que la composition et la teneur en acides gras sont fortement influencées par la privation d'azote.

Dans les SLB, l'acide palmitique et l'acide oléique sont les deux acides gras les plus abondants. Voir le protocole écrit pour plus de détails sur le calcul de la teneur et de la composition en acides gras. La teneur et la composition en acides gras d'Odum Trico UEX 6 4 0, en présence ou en absence d'azote, sont indiquées ici.

Comme pour les UU obliques, la teneur et la composition en acides gras sont fortement influencées par la privation d'azote. En conditions d'azote suffisant et en conditions de carence, les teneurs totales en acides gras étaient respectivement de 11,7 ± 0,9 % et de 30,5 ± 1,1 %. P. trium produit également des quantités importantes d'acides gras fortement insaturés, tels que l'I csap et l'acide Penta IC.

En outre, des acides gras à très longue chaîne, tels que l'acide lignocérique, peuvent également être détectés par cette méthode. Cette procédure peut être étendue en incluant une étape de séparation du caillot lipidique entre l'extraction des lipides et l'étape de transestérification afin d'obtenir des informations supplémentaires sur la composition en classes de lipides des micro-LG, comme décrit dans les références du texte du protocole.