2.10: Purification sur gel

La purification sur gel est une procédure standard effectuée pour récupérer les fragments d’ADN souhaités à partir de gels d’agarose après séparation électrophorétique. Après avoir dissous le fragment de gel et l’avoir passé à travers un filtre spécialisé, cette procédure permet d’obtenir de l’ADN exempt d’impuretés telles que les sels, les nucléotides libres et les enzymes, adapté aux applications en aval.

Le principe de base de la récupération de l’ADN à partir d’un gel d’agarose implique une séquence d’étapes de liaison, de lavage et d’éluation. Une fois que le gel est dans le tampon solubilisant, il est appliqué sur une « colonne de spin ». qui, lors de la centrifugation, permet aux molécules d’ADN de se lier sélectivement à un filtre en silice tandis que les impuretés s’écoulent dans un tube de collecte.

L’ADN est capable de se lier à la silice grâce à une forte concentration en sel dans le tampon de solubilisation du gel. On pense que ce tampon perturbe la structure d’hydratation autour du filtre et crée un pont salin cationique entre les fortes charges négatives sur le filtre et les charges négatives sur l’ADN. Les impuretés résiduelles sont éliminées par lavage à l’éthanol.

De l’eau ou un tampon à faible teneur en sel est ajouté à la colonne et éluera ? ou libérer, l’ADN de celui-ci, probablement en perturbant le pont cationique. L’ADN est maintenant purifié du gel.

La première étape de la procédure de purification du gel consiste à couler le gel d’agarose et à effectuer une électrophorèse des échantillons d’ADN. Une fois l’analyse du gel terminée, les fragments d’ADN souhaités sont visualisés à la lumière UV et les fragments sont sélectionnés après comparaison avec un étalon de poids moléculaire.

Si le gel n’est pas coloré, l’emplacement de la bande peut être déterminé approximativement sur la base d’une comparaison avec l’échelle d’ADN. Lors de la découpe du gel avec une lame de rasoir, il faut veiller à récupérer le plus d’ADN possible avec le moins d’agarose possible.

Lors de la manipulation de gels tachés de bromure d’éthidium et du travail devant la lumière UV, des gants et des lunettes de protection doivent être utilisés. Après avoir coupé l’ADN souhaité du gel, éliminez le gel et le tampon de fonctionnement correctement, conformément aux protocoles de sécurité de l’établissement.

Une fois isolé, le morceau de gel est placé dans un tube de microfuge et pesé sur une balance. En utilisant l’approximation que 100 mg de gel occupent 100 l, un volume de tampon de solblilisation égal à 4 fois le poids du gel est ajouté à la pièce de gel. Après avoir été placé dans un tampon, le morceau de gel est incubé à environ 50 °C pour faire fondre l’agarose.

Une fois fondu, le gel solubilisé est ajouté sur une colonne de centrifugation et la solution est centrifugée, ce qui fera adhérer tout l’ADN et les autres particules au filtre.

Ensuite, l’ADN lié est lavé en ajoutant 70 % d’éthanol dans le filtre, suivi d’une centrifugation, qui éliminera les impuretés résiduelles du filtre. Le flux est jeté et cette étape de lavage est ensuite généralement répétée jusqu’à trois fois. Le filtre vide est à nouveau tourné pour éliminer l’éthanol résiduel, et le filtre à silice est laissé sécher à température ambiante. De l’eau ou un tampon d’élution est ajouté au filtre, et avec un autre cycle de centrifugation, l’ADN purifié est collecté au fond du tube.

La méthode que vous venez de voir s’applique à la purification de gel avec des filtres à colonne de spin de silice. Il existe d’autres méthodes qui utilisent les mêmes principes de base de la liaison de l’ADN à la silice suivie d’étapes de lavage et d’élution. Par exemple, la silice peut être mélangée à de l’ADN dans une suspension appelée « lait de verre », qui peuvent être granulés et lavés, puis élués. De plus, l’aspiration peut être utilisée pour tirer l’ADN à travers des filtres de silice et, plus tard, l’éluer. Assurez-vous de comprendre les procédures de purification de gel de votre laboratoire.

Maintenant que vous avez appris comment récupérer l’ADN des gels d’agarose, examinons quelques applications en aval qui utilisent l’ADN obtenu par purification de gel.

Par exemple, la purification sur gel est une étape intermédiaire de l’immunoprécipitation de la chromatine, une technique qui vise à isoler les protéines régulatrices qui regroupent l’ADN génomique, afin d’identifier les séquences qui sont régulées. Les fragments isolés sont purifiés sur gel et séquencés, afin d’être cartographiés sur les différentes régions chromosomiques.

Le sous-clonage - le processus de déplacement d’un gène d’un vecteur à un autre - peut impliquer la purification du gel. Par exemple, les séquences de gènes d’un vecteur peuvent être digérées à partir d’une construction et assemblées en séquences chimériques par PCR, après quoi elles sont purifiées sur gel et placées dans d’autres constructions.

Peut-être que l’application la plus simple de la purification par gel est son utilisation après un stockage à long terme à -80 ? C des bandes d’ADN excisées après électrophorèse.

Vous avez maintenant appris comment extraire des fragments d’ADN d’un gel d’agarose, les variations des procédures de liaison, de lavage et d’élution suivies selon les préférences individuelles de l’utilisateur, et enfin certaines des applications possibles en aval de cette méthode. Comme toujours, merci d’avoir regardé.