Name: Biosensors Ratiométrique qui mesurent létat redox mitochondrial et de lATP dans les cellules vivantes de levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Découvrez l'utilisation de biosensors ratiométriques basés sur GFP pour mesurer l'état redox mitochondrial et les niveaux d'ATP dans les cellules vivantes de levure. Cette méthode offre une résolution subcellulaire pour l'analyse fonctionnelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des prix de HHMI 56006760 à JDV, les National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) pour DMAW, et de la Fondation Médicale Ellison (AG-SS-2465) et le NIH (GM45735, GM45735S1 et GM096445) à LP. GM45735S1 a été émis par le NIH dans le cadre du Reinvestment Act de 2009 American Recovery and. Les microscopes utilisés pour ces études ont été soutenues en partie par une subvention du NIH / NCI (5 P30 CA13696).

1. Transformation des cellules de levure avec les biocapteurs <ol><li> Transformer la souche de levure désirée avec plasmide portant mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 selon la méthode de l&#39;acétate de lithium 27. </li><li> Pour confirmer transformation avec le biocapteur plasmidique et pour éviter la perte du plasmide, sélectionner et maintenir transformants sur milieu complet synthétique sélectif approprié (SC-Ura pour mito-roGFP, ou SC-Leu pour mitGo-ATeam2). Si la sonde fluorescente a été sous-cloné dans un plasmide différent de ceux décrits ici, utiliser le milieu sélectif approprié. Visualisez transformants par microscopie à fluorescence pour confirmer qu&#39;ils expriment le biocapteur fluorescent et de morphologie mitochondrial normal. </li></ol> 2. La croissance des cellules et la préparation pour l&#39;imagerie fonction cellulaire et la réponse au traitement de la toxicomanie sont fortement tributaires de la densité cellulaire et l&#39;activité métabolique. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les cellulessont en division active (phase mid-log, ~ 0.5 - 1 x 10 7 cellules / ml). Le moyen le plus fiable pour produire des cultures en phase mi-log de densité uniforme est d&#39;inoculer à partir d&#39;une pré-culture en phase stationnaire. <ol><li> Préparer une pré-culture en phase stationnaire: choisir une seule colonie de cellules transformées à partir d&#39;une plaque et inoculer des milieux liquides sélectifs (5 ml dans un tube conique à fond 50 ml). Croître à 30 ° C sous agitation à 225 rpm jusqu&#39;à ce que la densité optique de la culture à 600 nm (DO600) a atteint un plateau (24-48 h). </li><li> Préparer une culture en phase semi-logarithmique pour l&#39;observation: utiliser le volume approprié de pré-culture pour inoculer 5 ml de milieux sélectifs dans un tube conique à fond 50 ml. Médias YPD est autofluorescente et ne doit pas être utilisé pour ces études. Utilisez, glucose, sur la base abandon des supports synthétiques complètes (SC-Ura). Cultiver des cellules à 30 ° C, en agitant à 225 rpm, pendant 4-16 heures, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la phase semi-log (~ 0.5 - 1 x 10 7 cellules / ml). La densité cellulaire peut être déterminéepar mesure de la DO 600; calibrer le spectrophotomètre pour déterminer la bonne DO600 lecture. Sur notre Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), la phase semi-logarithmique correspond à une DO600 de 0,1-0,3. </li></ol> Mito-roGFP1 détecte les fluctuations de l&#39;organite en réponse à des changements métaboliques. Par exemple, dans cet essai mitochondriales changements d&#39;état redox lorsque la levure pousse pas sur les sources de carbone fermentescibles (par exemple le glucose, comme dans les médias SC) et de sources de carbone non fermentescibles (par exemple le glycérol, comme dans les médias SGlyc), et même dans les différents lots de la même médias. Par conséquent, utiliser le même lot de médias pour toutes les expériences. <ol start="3"><li> Les cellules sont prêtes pour la concentration (voir l&#39;étape 2.4) et l&#39;imagerie si aucun traitement n&#39;est effectué. Si les cellules sont traitées, incuber les cellules avec le traitement approprié et passez à l&#39;étape suivante. </li><li> Concentrez 1 ml de culture par centrifugation à 6000 g pendant 15 sec etremise en suspension du culot cellulaire dans 20 ul de médias. Ces conditions de maximiser le nombre de cellules distincts dans le champ de vision. </li><li> Appliquer 2 pl des cellules remises en suspension à une diapositive. Couvrir avec une lamelle (n ° 1,5, de préférence à haute performance 170 ± 5 um d&#39;épaisseur), et sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles ou valap (voir réactifs). Pour sceller avec valap, faire fondre une petite quantité sur une spatule métallique en le tenant sur une flamme du bec Bunsen, puis étaler une petite quantité sur les bords de la lamelle. </li><li> Maintenir les cellules à 30 ° C pendant l&#39;imagerie. Un chauffe-objectif sur l&#39;objectif à immersion d&#39;huile 100x utilisés pour l&#39;imagerie fonctionne bien pour cette application. Dans ces conditions, la morphologie mitochondriale, état redox et les niveaux d&#39;ATP restent inchangés lors de l&#39;imagerie pendant 10-15 min. </li></ol> 3. Configuration Imaging <ol><li> Configuration pour l&#39;imagerie mito-roGFP1 sur un microscope de fluorescence à champ large Les étapes sont ici adaptées à la AxioObserver.Z1 microscope équipé d&#39;une source Colibri LED d&#39;excitation, un grand champ Orca caméra ER et le logiciel d&#39;acquisition Axiovision. Photoblanchiment des deux canaux et photoconversion de oxydés mito-roGFP1 est considérablement réduite en utilisant un éclairage à LED par rapport au mercure arc lampe d&#39;éclairage (voir ci-dessous). Pour maximiser signal et résolution, utilisez l&#39;ouverture numérique plus possible de l&#39;objectif, et le plus faible grossissement qui offre une résolution spatiale suffisante. En outre, pour l&#39;imagerie mito-roGFP, vérifiez que l&#39;objectif transmet ainsi à 365 nm. Le 100x/1.3NA CE PlanNeofluar objectif (Zeiss) fonctionne bien pour cette application. Configurez le logiciel d&#39;acquisition pour capturer les espèces mito-roGFP1 oxydé et réduit. Nous utilisons les conditions suivantes. <ol><li> Configurez le canal pour oxydé mito-roGFP à utiliser excitation à 365 nm (100% LED de puissance) et un filtre d&#39;émission approprié pour la GFP, comme le 38 HE set (Zeiss), avec la excitatio inclusFiltre n retiré du cube. L&#39;élimination du filtre à l&#39;excitation permet l&#39;excitation à la fois 365 nm et 470 nm, sans avoir à changer les filtres, augmentant ainsi la résolution de temps réalisables. </li><li> Configurer le canal pour réduire mito-roGFP utiliser excitation à 470 nm (100% LED de puissance) et, comme mentionné ci-dessus, le même cube filtre d&#39;émission utilisé pour la oxydé mito-roGFP. Réglez l&#39;appareil photo 1x1 binning pour optimiser la résolution spatiale. </li><li> Réglez le logiciel à acquérir az pile constituée de 11 tranches avec un espacement de 0,5 um, la collecte de deux canaux à chaque position z. Ce mode d&#39;acquisition est plus lente que l&#39;acquisition de chaque pile z, à son tour, mais il empêche les artefacts provenant de mouvement mitochondrial entre l&#39;acquisition des chaînes oxydées et réduites. </li><li> plusieurs cellules d&#39;image pour déterminer un temps d&#39;exposition approprié, produire un signal de saturation forte mais pas. Il est important de maintenir le ratio de temps d&#39;exposition pour oxydé et réduit mito-roGFP1 pour tout expérimenters. Par exemple, si les temps d&#39;exposition pour oxydé et réduit mito-roGFP1 sont 300 et 100 msec, respectivement, le temps d&#39;exposition pour oxydé mito-roGFP1 devrait être 3 fois plus que pour réduire mito-roGFP pour toutes les expériences. </li></ol></li><li> Configuration pour l&#39;imagerie mitGO-ATeam2 sur un microscope confocal spectral Pour quantifier les niveaux d&#39;ATP en utilisant mitGO-ATeam2, la fluorescence de la GFP (émission maximale 510 nm) doit être distinguée de celle de OFP (maximum d&#39;émission 560 nm). Il ya des jeux de filtres de fluorescence qui résolvent la fluorescence émise par ces fluorophores. Cependant, nous constatons qu&#39;un détecteur spectral, disponible sur de nombreux balayage laser microscopie confocale, qui fonctionne le mieux pour cette application. Un détecteur spectral sépare l&#39;émission de fluorescence en plusieurs composantes (généralement 32 ou plus) selon la longueur d&#39;onde. Plusieurs bandes de longueurs d&#39;onde adjacents peuvent être combinés en une voie d&#39;image. Les longueurs d&#39;onde à combiner sont choisis de manière empirique afin de maximiser signal GFP et OFP tout en évitant croisement de signal qui serait confondre la mesure de FRET. Utilisez l&#39;objectif d&#39;ouverture numérique élevée disponible. Nous utilisons un 100x/1.49 ou 60x/1.49 objectif Apo-FRBR. Nous utilisons le Nikon A1R microscope confocal exécutant le logiciel NIS Elements. Configurez le logiciel d&#39;acquisition pour capturer les espèces mitGO-ATeam2 liée à l&#39;ATP et ATP-lié. Nous utilisons les conditions suivantes. <ol><li> Set sténopé à 1,0 unités Airy (UA), qui sur notre système correspond à la résolution az d&#39;environ 0,42 um. </li><li> Réglez le zoom de numérisation d&#39;approcher la limite de Nyquist, ce qui permettra de maximiser l&#39;information spatiale dans l&#39;image. Sur notre système, la taille du pixel est de 0,12 um. </li><li> Parce que les mitochondries peuvent se déplacer lors de l&#39;imagerie, il peut être utile d&#39;augmenter la vitesse d&#39;imagerie en recadrant le champ à 512 x 256 pixels. Le temps total nécessaire à l&#39;image d&#39;une image dans notre système est de 1,0 sec, y compris un moyen de balayage de 2 fois. Selon la résolution spatiale souhaitée, le domaine peut encore être recadrée pour de pluse de résolution temporelle. </li><li> Excite à 488 nm, et de recueillir des émissions de 500 à 520 nm pour la GFP, et de 550 à 580 nm pour OFP. Valeurs optimales réels peuvent varier selon les caractéristiques du système d&#39;imagerie. </li><li> La puissance du laser optimale pour notre système est compris entre 6,0 et 6,4%. La puissance du laser optimale variera pour chaque système de microscope, mais idéalement être aussi bas que possible tout en produisant une image interprétable. Utilisez un mesureur de puissance interne ou externe à suivre l&#39;évolution de la puissance du laser, qui se produisent normalement au fil du temps dans tout système optique. </li><li> Régler le gain du détecteur et l&#39;intensité de la lumière d&#39;éclairage afin de maximiser l&#39;intervalle de valeurs de pixel détecté mais ne pas saturer le signal, pour autant de cellules que possible. Ne pas analyser toutes les cellules contenant plus de 1% pixels saturés. Image Tous les échantillons en utilisant le même objectif, la puissance du laser, balayage zoom, la taille des pixels, le gain et offset. </li></ol></li></ol> 4. Image Acquisition <ol><li> Localisez le pla focal<html> n des cellules d&#39;intérêt à l&#39;aide de la lumière transmise afin de minimiser le blanchiment de la sonde fluorescente. </li><li> Après localiser une ou plusieurs cellules d&#39;intérêt, de recueillir une série Z à travers toute la profondeur d&#39;une cellule typique (à 7 um) en utilisant une taille de pas de 0,5 pm. </li><li> Image d&#39;autres cellules d&#39;intérêt sur la diapositive, mais ne pas l&#39;image d&#39;une diapositive pendant plus de 15 min. Après 15 minutes, sur la diapositive, les cellules perdent leur viabilité. </li></ol> 5. Analyse Taux d&#39;ATP mitochondriale est déterminée en mesurant le rapport de l&#39;émission mitGO-ATeam2 à 560 nm à celle à 510 nm 27 l&#39;état redox de l&#39;organelle est mesurée par la diminution de oxydée (R / S) Rapport de mito-roGFP;. Soit émission à 510 nm après excitation à 470 nm divisée par une émission à 510 nm après excitation à 365 nm. Avant de calculer le rapport, nous soustrayons fond et déterminer une valeur seuil pour les pixels appartenant aux mitochondries fluorescent. tente &quot;&gt; Domaine public (par exemple ImageJ 30) ou disponibles dans le commerce (par exemple Volocity, Perkin-Elmer) logiciel peut être utilisé pour l&#39;analyse des mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam2. Selon le logiciel utilisé pour l&#39;acquisition d&#39;images et d&#39;analyse, les images peut d&#39;abord être converti en un autre format, tel que TIFF, avant de les ouvrir dans le logiciel d&#39;analyse. Si les images sont converties, il est essentiel de vérifier que les valeurs de pixels ne sont pas modifiés au cours de la conversion. L&#39;analyse des données mito-roGFP1, à l&#39;aide deux programmes sont décrits ci-dessous. menus du programme et des options à choisir au sein de chaque menu sont marquées en italique gras. 5.1 analyse ImageJ <ol><li> Ouvrir les images et le type de changement à 32 bits: image → → type 32 bits. </li><li> Dessiner une région d&#39;intérêt (ROI) dans une zone où il n&#39;y a pas de cellules. Calculer l&#39;intensité moyenne dans ce ROI: Analyser → Mesure. </li><li> Soustraire le fond de la moyenne calculée à partir de la pile: Processus → Math → Soustraire. </li><li> En utilisant le z-stack soustrait, trouver la tranche moyenne et le seuil sur les mitochondries: image → Ajuster → Seuil et cliquez sur Appliquer dans la fenêtre de seuil. Appliquer à toutes les tranches de la pile. Cochez la case Définir des pixels de fond à NaN. </li><li> Créer le rapport z pile: Processus → Calculatrice de l&#39;image Diviser la pile réduite par le z pile oxydé pour l&#39;analyse mito-roGFP1. Diviser la nm image de 560 (ATP bound) par les 510 nm d&#39;image (ATP non liée) pour l&#39;analyse mitGO-ATeam2. </li><li> Dessinez un retour sur investissement autour de la zone d&#39;intérêt. Choisissez Analyser → Outils → ROI Manager et cliquez sur Ajouter pour enregistrer le retour sur investissement. Plusieurs régions peuvent être stockés dans le gestionnaire. Dans ROI gestionnaire, sélectionnez toutes les ROI, puis choisissez Mminerai → Multi-mesures pour mesurer toutes les tranches de la pile. Exporter des données vers un tableur pour analyse. </li></ol> 5.2 Analyse des Volocity <ol><li> Importer des images dans une bibliothèque de Volocity et créer une séquence d&#39;images avec deux canaux. </li><li> Dessiner une région d&#39;intérêt (ROI) dans une zone où il n&#39;y a pas de cellules. Choisissez Outils → Ratio. </li><li> Utilisez Volocity pour calculer le fond: Recevez De retour sur investissement. </li><li> Réglez le seuil d&#39;inclure structures mitochondriales. </li><li> Cochez l&#39;option d&#39;appliquer une LUT arc en ciel sur le canal de ratio. Le canal à modulation d&#39;intensité peut produire une image moins bruyant pour présentation, mais il ne doit pas être utilisé pour la quantification de ratio moyen. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet mesure, sélectionnez le canal de rapport et d&#39;en tirer un retour sur investissement autour de la zone d&#39;intérêt. Mesurer le canal de rapport, à l&#39;exception des valeurs nulles. Plusieurs régions peuvent être choisies et doséesdans le même temps. Exporter des données vers un tableur pour analyse. </li></ol>

<ol><li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li>
<li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li>
<li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+radical+generation%2C+oxidative+stress%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222(2000).</li>
<li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+next+%28neurode%29generation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li>
<li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li>
<li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins%3A+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li>
<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide%3A+A+key+role+of+%5Balpha%5D-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li>
<li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li>
<li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li>
<li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li>
<li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide%2Fglutathione+couple%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li>
<li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li>
<li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells%3A+Assessment+of+the+ATP%2FO+values+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li>
<li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li>
<li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+triphosphate%3A+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li>
<li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li>
<li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManfredi%2C+G+%22Methods+in+Cell+Biology%2C+Mitochondria%22">Methods in Cell Biology, Mitochondria</a>. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).</li>
<li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Areas+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li>
<li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li>
<li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li>
<li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li>
<li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li>
<li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP%3AADP+Ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ici, nous décrivons les méthodes à utiliser mito-roGFP1 et mitGO-ATeam2 comme biocapteurs pour évaluer l&#39;état redox mitochondrial et les niveaux d&#39;ATP dans les cellules de levure vivante. Nous constatons que l&#39;expression du plasmide d&#39;origine mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam résultats dans le ciblage quantitatif aux mitochondries, sans aucun effet évident sur ​​la morphologie ou la distribution mitochondrial ou sur les taux de croissance cellulaire. 3 Mito-roGFP1 peut détecter des changements dans l...

Les mitochondries sont des organites essentiels pour la production d&#39;ATP, la biosynthèse des acides aminés, des acides gras, l&#39;hème, clusters fer-soufre et pyrimidines. Les mitochondries jouent également un rôle essentiel dans l&#39;homéostasie du calcium, et dans la régulation de l&#39;apoptose. 1 en plus de preuves des liens mitochondries au vieillissement et aux maladies liées au vieillissement, y compris la maladie de Parkinson, la maladie d&#39;Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique et la maladie de Huntington. 2 Bien que les individus vivent leur vie entière avec des mutations dans des protéines mitochondriales qui sont associés à des maladies neurodégénératives, les symptômes de la maladie se produisent seulement plus tard dans la vie. Cela indique que les changements se produisent dans les mitochondries avec l&#39;âge qui permet maladie pathologie à émerger. En effet, fitness mitochondrial est corrélée à la santé globale de la cellule et la durée de vie de la levure et des cellules de mammifères 3,4 Ici., Nous décrivons comment utiliser biocapteurs fluorescents génétiquement codés, ratiométriques d&#39;évaluer deux caractéristiques essentielles de Mitochondria dans les cellules de levure vivantes: état redox et les niveaux d&#39;ATP. La fonction mitochondriale dans la mobilisation de l&#39;énergie aérobie est bien établie. L&#39;état d&#39;oxydo-réduction des mitochondries est un produit de réduction et d&#39;oxydation des espèces dans l&#39;organite, comprenant du NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, le glutathion / glutathion disulfure (GSH / GSSG) et les espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS). Découplage mitochondries ou hypoxie affecte l&#39;activité respiratoire mitochondriale et modifie le rapport de NAD + en NADH dans l&#39;organite. ROS, qui sont produits à partir de transfert d&#39;électrons inefficace entre les complexes de la chaîne de transport des électrons dans la membrane mitochondriale interne, ainsi que de la désamination des amines par la monoamine oxydase dans la membrane mitochondriale externe 5, les lipides des dommages, des protéines et des acides nucléiques et avoir été lié au vieillissement et les maladies neurodégénératives liées à l&#39;âge 6,7,8. ROS jouent également un rôle dans la transduction du signal en mitochondria, par oxydation du GSH. Par exemple, le NADH déshydrogénase contribue non seulement à la production de ROS, mais aussi est régulée par des interactions avec la piscine glutathion 9,10. déshydrogénase α-cétoglutarate et aconitase, les composantes du cycle de Krebs, présentent une activité réduite en environnements oxydants 11,12. En effet, la régulation redox dépendant de l&#39;activité aconitase est conservée, des bactéries aux mammifères 13,14. Ainsi, la surveillance de l&#39;état redox et les niveaux d&#39;ATP des mitochondries est cruciale pour comprendre leur fonction et leur rôle dans la pathologie de la maladie. Méthodes biochimiques ont été utilisés pour évaluer l&#39;état d&#39;oxydoréduction ou les niveaux d&#39;ATP des cellules entières ou des mitochondries isolées. Méthodes largement utilisée pour évaluer l&#39;état redox des cellules entières ou des mitochondries isolées sont basés sur la mesure des niveaux de la paire redox GSH / GSSG 15. Le système luciférine-luciférase est couramment utilisé pour mesurer mitochondrialLes niveaux d&#39;ATP dans les deux cellules entières perméabilisées ou les mitochondries isolées. 16,17,18,19,20 Dans cet essai, la luciférase se lie à l&#39;ATP et catalyse l&#39;oxydation de chimiluminescence et de luciférine. 21 L&#39;intensité de la lumière émise est proportionnelle à la quantité de l&#39;ATP dans le milieu réactionnel. 22 Ces méthodes ont révélé des informations fondamentales sur la fonction mitochondriale, y compris la constatation que les patients atteints de maladies neurodégénératives telles que la maladie d&#39;Alzheimer, ont des niveaux anormalement bas d&#39;ATP. 23 Toutefois, ils ne peuvent être utilisés à l&#39;image vivants, des cellules intactes. En outre, les méthodes basées sur l&#39;analyse de cellules entières fournissent une moyenne de l&#39;état d&#39;oxydoréduction ou les niveaux d&#39;ATP dans tous les compartiments de la cellule. Mesures en organites isolés sont potentiellement problématique car l&#39;état redox mitochondrial ou les niveaux d&#39;ATP peuvent changer au cours du fractionnement subcellulaire. Enfin, des études récentes de notre laboratoire et d&#39;autres indiquent quemitochondries dans les cellules individuelles sont hétérogènes en fonction, ce qui influe sur la durée de vie des cellules de la mère et la fille. 3 Ainsi, il est nécessaire de mesurer les niveaux d&#39;ATP mitochondriale et de l&#39;état d&#39;oxydo-réduction dans les cellules vivantes avec une résolution subcellulaire. Les biocapteurs pour la fonction mitochondriale décrites ici sont toutes deux basées sur la GFP. GFP redox sensible (roGFP) 24,25 est un variant de la GFP dans lequel cystéines exposées à la surface sont ajoutés à la molécule. roGFP, comme GFP de type sauvage, présente deux pics d&#39;excitation (à ~ 400 nm et ~ 480 nm) et une pointe d&#39;émission à ~ 510 nm. L&#39;oxydation des résidus cystéine dans les résultats roGFP par une augmentation de l&#39;excitation à ~ 400 nm. La réduction de ces cystéines favorise excitation à ~ 480 nm. Ainsi, le rapport entre l&#39;émission de 510 nm lors d&#39;une excitation de roGFP à 480 nm et 400 nm révèle la quantité relative de roGFP réduite et oxydée, qui reflète l&#39;état d&#39;oxydo-réduction de l&#39;environnement du fluorophore. Deux versions de roGFP sont largement utilisés: roGFP1 et roGFP2. Les deux contiennent les mêmes insertions de cystéine. roGFP1 sont basées sur le GFP de type sauvage et roGFP2 est basée sur S65T GFP, qui a une excitation efficace à 480 nm et inférieure d&#39;excitation efficace à 400 nm par rapport à wtGFP 24. roGFP1 est moins sensible au pH que roGFP2 et sa gamme dynamique s&#39;étend plus loin dans la plage réduite. Ainsi, roGFP1 peut être plus utile pour surveiller les compartiments plus réducteurs tels que les mitochondries ou le cytosol, et des compartiments dont le pH est variable, comme les endosomes. roGFP2 propose signaux lumineux et, dans certaines études, une gamme dynamique supérieure à roGFP1 24,26. Des études chez Arabidopsis thaliana indiquent que le temps nécessaire pour une réponse à des changements dans l&#39;état d&#39;oxydo-réduction est similaire pour les deux capteurs (t ½ pour l&#39;oxydation, 65 et 95 secondes et t ½ de la réduction, 272 et 206 secondes, par roGFP1 et roGFP2, respectivement) 26. MitGO-ATeam2 est un mini-invasive, fiablecapteur qui mesure ATP mitochondrial chez la levure Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam est un transfert d&#39;énergie par résonance de Förster (FRET) de la sonde qui se compose de la sous-unité ε du F o F 1-ATP synthase en sandwich entre donneur de FRET et protéines fluorescentes accepteurs (GFP et orange fluorescent protein (OFP), respectivement). 27 La liaison de l&#39;ATP de la ε résultats des sous-unités dans des changements conformationnels de la protéine qui apportent le FRET donneur à proximité immédiate de l&#39;accepteur et pour permettre un transfert d&#39;énergie du donneur à l&#39;accepteur. Il existe deux variantes de GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 et ATeam2. GO-ATeam2 a une plus grande affinité pour MgATP que GO-ATeam1, le rendant plus adapté pour mesurer le typiquement inférieure [ATP] dans les mitochondries par rapport au cytosol. 27 Afin de sonder l&#39;état redox mitochondrial, nous avons construit une protéine de fusion (mito-roGFP1) composé de roGFP1 fusionnée à la séquence leader ATP9 unend exprimé à partir d&#39;une expression de levure centromere basé (faible nombre de copies) plasmide sous le contrôle de la forte glycéraldéhyde-3-phosphate (GPD) promoteur (p416GPD, Addgene). Nous avons utilisé roGFP1 pour sonder l&#39;état d&#39;oxydo-réduction des mitochondries dans le contexte de vieillissement du modèle champignon Saccharomyces cerevisiae. Nous constatons que roGFP1 peut détecter des changements dans l&#39;état redox mitochondrial qui se produisent au cours du vieillissement et en réponse à la disponibilité des nutriments mais n&#39;a aucun effet néfaste apparent sur des cellules de levure. Nous voyons aussi une variabilité dans l&#39;état redox des mitochondries dans les cellules de levure de vie individuels, une constatation qui souligne l&#39;importance d&#39;un biocapteur avec une résolution spatiale subcellulaire. MitGO-ATeam2 est une variante du GO-ATeam2, qui a la séquence signal mitochondrial du cytochrome c oxydase sous-unité VIII inséré à l&#39;extrémité amino-terminale de GO-ATeam2 27. Nous avons modifié la sonde mitGO-ATeam2 (aimablement fourni par le laboratoire de H. Noji, Institut of recherche scientifique et industrielle, Université d&#39;Osaka, Japon) pour une utilisation dans la levure par sous-clonage, via les sites HindIII Xba1 et, dans le vecteur d&#39;expression de levure pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), qui est un faible nombre de copies de plasmide contenant le promoteur constitutif fort GPD. Nous avons exprimé mitGO-ATeam2 dans la levure bourgeonnante, et de trouver, par la contre avec la liaison à l&#39;ADN colorant DAPI, qu&#39;il localise exclusivement vers les mitochondries, où il sert comme une sonde efficace pour mesurer les changements physiologiques dans les niveaux d&#39;ATP mitochondrial. roGFP et GO-ATeam sont à la fois codées génétiquement. En conséquence, ils peuvent être introduits et maintenus de façon stable dans des cellules intactes, et fournissent des informations sur l&#39;état d&#39;oxydoréduction ou ATP dans les cellules vivantes, individuels. En outre, les deux biocapteurs surveiller les changements dans l&#39;état d&#39;oxydoréduction ou les niveaux d&#39;ATP qui se produisent dans des conditions physiologiques. 28 Les deux sondes sont également quotientométrique. En conséquence, les mesures faites avec ces sondes ne sont pas affectés par changes de concentration biocapteur ou un éclairage ou une épaisseur échantillon. Enfin, les deux biocapteurs offrent une résolution spatiale subcellulaire. En effet, roGFP a été ciblé à la mitochondrie, ER, les endosomes et les peroxysomes 24, et peut détecter des changements dans l&#39;état redox de chacun de ces organites, largement indépendantes du pH.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td><Réactifs fort>s</forts></td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>1397-94-0</td><td>Dissous dans de l’éthanol dans une solution mère de 2 mg/ml.</td></tr><tr><td>Milieu de croissance de levure SGlyc (à base de glycérol synthétique) *omettre pour SGlyc-Ura **omettre pour SGlyc-Leu</td><td></td><td></td><td>Dissoudre dans H2O. Ajuster le pH à 5,5 avec NaHCO3. Autoclave. Ingrédients : 0,67 % Base azotée de levure sans acides aminés 3 % Glycérol 0,05 % Glucose 2 mg/ml adénine 2 mg/ml uracile* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-méthionine 4 mg/ml L-phénylalanine 2 mg/ml L-tryptophane 3 mg/ml L-tyrosine</td></tr><tr><td>SC (synthétique complet, à base de glucose) milieu de croissance de levure *omettre pour SGlyc-Ura **omettre pour SGlyc-Leu</td><td></td><td></td><td>Dissoudre dans H2O. Ajuster le pH à 5,5 avec NaHCO3. Autoclave. Ingrédients : 0,67 % Base azotée de levure sans acides aminés 3 % Glucose 2 mg/ml adénine 2 mg/ml uracile* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-méthionine 4 mg/ml L-phénylalanine 2 mg/ml L-tryptophane 3 mg/ml L-tyrosine</td></tr><tr><td>Valap</td><td></td><td></td><td>Combiner les ingrédients dans un rapport de 1:1:1 (p :p :p). Fondre en s’immergeant dans une température de 70 &deg ; C Bain H2O. Aliquote dans des boîtes de Pétri en verre. Conserver à température ambiante. Ingrédients : Vaseline vaseline, paraffine dure, lanoline</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Equipment and Software</td></tr><tr><td>Preclean Gold Seal Rite-on Micro Slides</td><td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td><td>3050</td><td>Taille : 25 x 75 mm ; Epaisseur : 0,93 à 1,05 mm</td></tr><tr><td>Lamelles hautes performances, n° 1,5, 18 x 18 mm</td><td>Zeiss (Thornwood, NY)</td><td>474030-9000-000 Celles-ci</td><td>ont une épaisseur moins variable (170&plusmn ; 5 &mu ; m) que les lamelles standard, réduisant l’aberration sphérique et améliorant les performances d’imagerie 3D</td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope Fisherbrand, n° 1.5</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td><td>12-545E</td><td>Taille : 22 x 22 mm, n° 1,5 d’épaisseur (170 &mu ; m)</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser A1 avec détecteur spectral et objectif Apo-TIRF 100x/1,49 NA</td><td>Nikon (Melville, NY)</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope AxioObserver.Z1 équipé d’un objectif 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar (Zeiss) et d’une caméra CCD refroidie Orca ER (Hamamatsu) et contrôlé par le logiciel Axiovision</td><td>Zeiss (Thornwood, NY) ; Hamamatsu (Ville de Hamamatsu, Japon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity Logiciel d’analyse d’images 3D</td><td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td><td></td><td>Module de restauration pour la déconvolution ; Module de quantification pour le calcul et la mesure des ratios</td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/ » target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr></tbody></table>

biosensors ratiométrique qui mesurent l&#39;état redox mitochondrial et de l&#39;atp dans les cellules vivantes de levure

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Les mitochondries jouent un rôle dans de nombreux processus cellulaires, du métabolisme énergétique et l&#39;homéostasie du calcium au contrôle de la durée de vie cellulaire et la mort cellulaire programmée. Ces processus affectent et sont affectés par l&#39;état redox et la production d&#39;ATP par les mitochondries. Ici, nous décrivons l&#39;utilisation de deux ratiométriques, biocapteurs génétiquement codés qui peuvent détecter l&#39;état redox mitochondrial et les niveaux d&#39;ATP à une résolution subcellulaire dans les cellules de levure vivante. État redox mitochondrial est mesurée à l&#39;aide Green Fluorescent Protein redox-sensibles (roGFP) qui est destiné à la matrice mitochondriale. Mito-roGFP contient résidus cystéine en positions 147 et 204 de la GFP, qui subissent une oxydation et une réduction réversible et dépendant de l&#39;environnement, qui à son tour modifie le spectre d&#39;excitation de la protéine. MitGO-ATeam est un transfert d&#39;énergie par résonance de Förster (FRET) de la sonde, dans lequel la sous-unité de l&#39;ε o F F 1-ATP synthase est prise en sandwich entre donneur et l&#39;accepteur FRET fluoprotéines centes. La liaison de l&#39;ATP de la ε résultats des sous-unités dans des changements de conformation de la protéine qui apportent le donneur et l&#39;accepteur de FRET à proximité immédiate et de permettre un transfert d&#39;énergie de fluorescence par résonance à partir du donneur à l&#39;accepteur.

Mesurer l&#39;état redox mitochondrial avec mito-roGFP Ici, nous montrons que mito-roGFP1 a la plage dynamique pour détecter des changements dans l&#39;état redox mitochondrial totalement oxydé à réduit dans les cellules de levure vivante, sans affecter la croissance des cellules de levure ou de la morphologie mitochondriale. Tout d&#39;abord, nous trouvons les cellules exprimant la GFP mitochondries ciblée et roGFP1 croître à des taux normaux (figure 1A). Le taux de croissance...

Nous décrivons l&#39;utilisation de deux ratiométriques, biocapteurs génétiquement codés, qui sont fondés sur la GFP, pour surveiller l&#39;état redox mitochondrial et les niveaux d&#39;ATP à une résolution subcellulaire dans les cellules de levure vivantes.

Biosensors Ratiométrique qui mesurent l&#39;état redox mitochondrial et de l&#39;ATP dans les cellules vivantes de levure

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la fonction mitochondriale dans des cellules de levure vivantes à l’aide de deux variantes de protéine fluorescente verte ou GFP. La GFP à détection redox contient des cystines exposées en surface, qui subissent une oxydation et une réduction réversibles et dépendantes de l’environnement, modifiant le spectre d’excitation de la rangée réduite en protéines. La GFP a un maximum d’excitation à 470 nanomètres, tandis que la GFP en rangée oxydée a un déficit d’excitation accru à 365 nanomètres.L’état redoc est mesuré comme l’émission RO GFP à 470 nanomètres d’excitation sur l’émission RO GFP à 365 nanomètres d’excitation go Une équipe est une sonde de frette dans laquelle la sous-unité epsilon de la FN zéro F1 A TP synthase est prise en sandwich entre une GFP donneuse de frette et une protéine fluorescente orange accepteur de frette ou la liaison OFP d’un TP à la sous-unité epsilon entraîne des changements de confirmation dans la protéine qui apportent Le donneur et l’accepteur de frettes sont très proches, ce qui permet le transfert d’énergie du donneur à l’accepteur. Les niveaux de TP A sont ensuite mesurés comme l’émission OFP lors de l’excitation à 488 nanomètres par rapport à l’émission GFP lors de l’excitation à 488 nanomètres. On obtient des résultats qui surveillent les changements dans l’état redox ou les niveaux de TP qui se produisent dans des conditions physiologiques.Le principal avantage de ces méthodes par rapport aux méthodes existantes est que la route GFP et go. Une équipe est génétiquement codée et peut être introduite et maintenue de manière stable dans des cellules vivantes. Par conséquent, ils peuvent être utilisés pour mesurer l’état redox mitochondrial et un TP dans les cellules vivantes sans affecter la valeur adaptative des cellules ou des organites.Les deux sondes surveillent les changements d’état redox ou les niveaux de TP dans des conditions physiologiques. Les deux sondes sont également métriques. Les mesures effectuées avec ces sondes ne sont pas affectées par les changements de concentration des biocapteurs, d’éclairage ou d’épaisseur de l’échantillon.Les deux biocapteurs fournissent une résolution au niveau des organites individuels. En fait, les variantes de la GFP RO ont été ciblées sur les mitochondries, les euh, les endosomes et les peroxysomes où elles ont détecté des changements dans l’état redox, largement indépendants du pH. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans les domaines concernant le contrôle de la qualité des mitochondries et la façon dont les mitochondries changent avec l’âge.La démonstration visuelle de cette méthode est utile car les étapes de seuillage et de rapport lors de l’analyse d’image sont difficiles et doivent être effectuées à l’aide de directives définies cohérentes pour commencer cette procédure. Effectuer la transformation de la levure à l’aide de biocapteurs comme décrit dans le protocole textuel. Cultivez des cellules jusqu’à la phase mi-logarithmique dans cinq millilitres de milieu de chute complet sélectif dans un tube à fond conique de 15 millilitres.Utilisez le même lot de supports pour toutes les expériences. Après avoir concentré un millilitre de culture à 20 microlitres, appliquez deux microlitres de cellules remises en suspension sur une lame et couvrez les cellules avec une lamelle. Faites ensuite fondre une petite quantité de VAP sur une spatule métallique et étalez-la le long des bords de la housse pour sceller.Alternativement, le vernis à ongles transparent peut être utilisé pour l’imagerie mito RO GFP one sur un microscope fluorescent à grand champ. Utilisez un objectif avec l’ouverture numérique la plus élevée possible qui transmet la lumière à 365 nanomètres, tel que le plan EEC 100 x 1,3 NA. Objectif Neo Fluor.Configurez le microscope pour qu’il excite à 365 et 470 nanomètres afin de détecter respectivement la GFP oxydée et la GFP réduite de la rangée d’onglets. Utilisez des LED pour modifier la longueur d’onde d’excitation et un cube de filtre d’émission adapté à la GFP. Une fois le filtre d’excitation retiré, réglez la caméra sur un pliage pour une résolution spatiale optimale.Ensuite, réglez le logiciel pour qu’il acquière un Zack composé de 11 tranches avec un espacement de 0,5 micromètre, en collectant les deux canaux à chaque position Z. Localisez le plan focal des cellules à l’aide de la lumière transmise pour minimiser le blanchiment de la sonde fluorescente. Ensuite, collectez une série Z sur toute la profondeur d’une cellule typique en utilisant une taille de pas de 0,5 micromètre pour la configuration de l’imagerie.Pourrait faire une équipe deux sur un microscope confocal spectral. Utilisez l’objectif à ouverture numérique la plus élevée disponible ici. Une lentille de gazon 100 x 1,49 APO est utilisée.Configurer le microscope pour exciter migo une équipe deux à 488 nanomètres et collecter des émissions de 500 à 520 nanomètres pour une borne TP et de 550 à 580 nanomètres. Pour un TP formulaires non liés. Les valeurs optimales réelles peuvent varier en fonction des caractéristiques du système d’imagerie.Réglez le sténopé sur 1,0 unité de surface, puis réglez. Balayez le zoom pour vous approcher de la limite d’échantillonnage de Nyquist. Pour augmenter la vitesse d’imagerie, recadrez le champ à 512 x 256 pixels.Utilisez la moyenne de balayage si nécessaire pour réduire le bruit. Utilisez le moins de puissance laser possible tout en produisant une image interprétable. Utilisez un wattmètre interne ou externe pour surveiller les changements de puissance laser qui se produisent normalement au fil du temps dans n’importe quel système optique.Ajustez le gain du détecteur et l’intensité de l’éclairage pour maximiser la plage dynamique. Mais évitez la saturation. N’analysez pas les cellules contenant plus de 1 % de pixels saturés.Localisez le plan focal des cellules à l’aide de la lumière transmise avant de collecter une série Z à travers la profondeur de maintien d’une cellule typique à l’aide d’une taille de pas de 0,5 micromètre, imagez tous les échantillons à l’aide du même objectif, laser, puissance, balayage, zoom, taille de pixel, gain et décalage. Ouvrez les images acquises et changez le type en 32 bits pour déterminer l’arrière-plan. Dessinez une région d’intérêt ou un retour d’intérêt dans une zone où il n’y a pas de cellules.Choisissez, analysez, mesurez pour ajouter l’intensité moyenne de ce ROI à la fenêtre des résultats. Pour soustraire cette valeur de la pile, choisissez Mathématiques de processus et Soustraire. Entrez ensuite l’intensité moyenne de l’arrière-plan et choisissez l’aperçu.D’accord et oui, le seuillage est l’aspect le plus difficile de la procédure. Pour garantir le succès, définissez des paramètres de seuillage de sorte que l’image résultante conserve la taille réelle de l’objet fluorescent dans l’image d’origine. L’utilisation d’exactement les mêmes conditions d’exposition pour chaque expérience permettra d’obtenir un seuillage cohérent tout au long du traitement de l’image.Un seuil trop bas inclura les pixels d’arrière-plan. Un seuil trop élevé éliminera des parties des mitochondries de l’analyse à l’aide de la soustraction de Zack, trouvera la tranche centrale et sélectionnera l’ajustement de l’image et le seuil, puis seuilra les mitochondries après avoir trouvé une valeur de seuil appropriée. Cliquez sur Appliquer pour appliquer ce seuil à toutes les tranches de la pile.Cochez ensuite définir les pixels d’arrière-plan sur NAN ou non un nombre et cliquez sur OK et oui, répétez ce processus pour l’autre image. Créez le rapport Z en cliquant sur le processus puis sur le calculateur d’image. Divisez l’empilement réduit par l’empilement C oxydé pour l’analyse MIT O-R-G-F-P un.Le même protocole est utilisé pour l’analyse migo AAM two. Dans ce cas, divisez l’image de 560 nanomètres liée à A TP par l’image de 510 nanomètres liée à A TP. Dessinez un retour sur investissement autour de la zone d’intérêt.Choisissez Outils d’analyse. ROI manager et cliquez sur ajouter pour enregistrer le ROI, puis choisissez plus multi-mesures et OK. Enfin, copiez la section du nombre de tranches et la moyenne et exportez les données vers une feuille de calcul pour analyse, utilisez la feuille de calcul pour calculer la surface multipliée par la moyenne, la somme pondérée et la moyenne pondérée des cellules exprimant la GFP ciblée des mitochondries et la GFP de ligne une croissance à des taux normaux.Le taux de croissance maximal est similaire dans les cellules exprimant mito GFP et MIT row GFP one. De plus, les mitochondries et les levures exprimant MIT RO GF P one sont alignées tubulaires le long de l’axe du bourgeon mère et s’accumulent aux extrémités des cellules mères et filles. Cette morphologie normale indique que MIT RO GF P one ne perturbe pas la fonction mitochondriale.Pour évaluer la plage dynamique de mitg FP, des cellules de levure de type sauvage à une phase intermédiaire ont été traitées avec du peroxyde d’hydrogène et du dihi trois etol et le rapport mitochondrial moyen réduit à oxydé a été mesuré pour évaluer le titrage de l’état redox mitochondrial avec du peroxyde d’hydrogène ou DTT de zéro à 10 millimolaires entraîne un changement dépendant de la dose. En moyenne, le rapport mitochondrial réduit/oxydé avec une plage mesurée de 0,6 dans des conditions oxydantes à 1,23 dans des conditions réductrices. Ainsi, mitg FP one est un biocapteur efficace pour l’analyse de la redate mitochondriale dans les cellules vivantes.Mito RO GFP one offre également une résolution subcellulaire de l’état redox mitochondrial. Cette résolution subcellulaire révèle que les mitochondries au sein des cellules de levure individuelles diffèrent dans l’état redox relatif : la lumière peut induire des changements dans le chromo quatre de la GFP lors de l’exposition à une rangée de lumière de haute intensité de 400 nanomètres, la GFP un subit une photoconversion en une espèce avec un spectre d’émission différent en utilisant une excitation de faible intensité. Il n’y a pas de conversion significative de photos au cours de la période analysée.La méthode préférée pour réduire la photoconversion est d’exciter la forme oxydée de la GFP en rangée à 365 nanomètres. MIGO AAM deux colocalise avec l’ADN mitochondrial coloré au DAPI dans la levure et se trouve dans les structures tubulaires typiques des mitochondries de levure de type sauvage. De plus, le taux de croissance des cellules exprimant MIGO AAM two est similaire à celui des cellules exprimant la GFP ciblée par les mitochondries dans les milieux de glucose et de glycérol. Ainsi, l’expression de migo A two ne semble pas délétère pour la cellule ou les mitochondries afin de tester si migo A répond aux changements dans les niveaux de TP mitochondriale A Les cellules ont été traitées avec de l’antimycine A, un agent qui inhibe la production de TP mitochondriale A.Le rapport de frette médian diminue dans les cellules traitées avec de l’antimycine. Fait intéressant, les données préliminaires indiquent qu’il peut y avoir des différences dans les niveaux de TP dans différentes mitochondries au sein d’une même cellule. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en plusieurs heures.De plus, lors de la tentative de cette procédure, il est important de maintenir les paramètres d’imagerie constants tout en surveillant les cellules pour la fragmentation mitochondriale et d’autres signes de phototoxicité. Évitez le photoblanchiment et élaborez des critères cohérents pour le seuillage. Ces biocapteurs peuvent être utilisés pour surveiller les changements mitochondriaux dans les champignons végétaux vivants et les cellules de mammifères.Ils peuvent également être utilisés pour surveiller les changements mitochondriaux dans la neurodégénérescence, les maladies métaboliques et d’autres maladies associées à des défauts dans les fonctions mitochondriales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’utiliser des colorants fluorescents métriques à rapport ciblé pour surveiller l’état redox mitochondrial et un TP dans les cellules vivantes.

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

PH vacuolaire et cytosolique peut être mesurée en levures vivantes...

Mesure du pH vacuolaire et cytosolique<em&gt; In Vivo</em&gt; En cellule de levure Suspensions

Le peroxyde d’hydrogène (H2,O2) est à la fois une source de dommages oxydatifs et une molécule de signalisation. Ce protocole décrit comment mesurer le H 2 O2mitochondrial à l’aide de HyPer7 (mtHyPer7) ciblant les mitochondries, un biocapteur ratiométrique génétiquement codé, chez la levure vivante. Il détaille comment optimiser les conditions d’imagerie et effectuer des analyses cellulaires et subcellulaires quantitatives à l’aide d’un logiciel disponible gratuitement.

Imagerie de mtHyPer7, un biocapteur ratiométrique pour le peroxyde mitochondrial, dans des cellules de levure vivantes

La respiration mitochondriale dans les cellules entières de levure est un indicateur précieux de la bioénergétique cellulaire. Nous présentons ici un protocole pour quantifier ce phénotype applicable à différentes espèces de levures.

Quantification de la respiration mitochondriale dans des cellules entières de levure

«E-DNA» de capteurs, sans réactif, les biocapteurs électrochimiques qui se comportent bien, même si contesté directement dans le sang et d'autres matrices complexes, ont été adaptés à la détection d'une large gamme d'acides nucléiques, de protéines et de petites molécules d'analytes. Nous présentons ici une procédure générale pour la fabrication et l'utilisation de tels capteurs.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

Imagerie de vie de fluorescence (FLIM) a émergé comme une technique essentielle pour l'image de l'environnement et l'interaction des protéines spécifiques et des colorants dans les cellules vivantes. FLIM des rotors moléculaires fluorescents permet de cartographier de la viscosité dans les cellules vivantes.

Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Procédé pour spatio-temporel de commande de l'activité GTPase de petite par la lumière est décrite. Cette méthode est basée sur la rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et photo-cages systèmes. Optimisation de la lumière-l'irradiation permet l'activation spatio-temporellement contrôlée de petites GTPases au niveau subcellulaire.

Spatio-temporelle de manipulation de l&#39;activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Cet article décrit la construction d'un multiplex microaiguilles capteur à base de. Le dispositif est en cours d'élaboration pour l'échantillonnage in situ et d'analyse électrochimique des analytes multiples, d'une manière rapide et sélective. Nous envisageons la médecine clinique et la recherche biomédicale utilise pour ces capteurs à base de micro-aiguille.

MICRO-creux à base de capteur pour multiplexée transdermique Sensing électrochimique

Une méthode de stimulation de cultures cellulaires in vitro avec l’activité électrique avec la lumière visible, basée sur l’utilisation de polymères semi-conducteurs organiques, est décrite.

Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Un certain nombre de biocapteurs de force basés sur FRET ont récemment été développés, permettant la résolution spécifique des protéines de la force intracellulaire. Dans ce protocole, nous démontrons comment l’un de ces capteurs, conçu pour l’agent de liaison de la protéine du complexe nucléosquelette-cytosquelette (LINC) Nesprin-2G, peut être utilisé pour mesurer les forces de l’actomyosine sur le complexe nucléaire LINC.

Un protocole pour l&#39;utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

Ce document présente une série de protocoles pour le développement de cellules modifiées et des surfaces fonctionnalisés qui permettent synthétiquement par génie E. coli pour contrôler et manipuler les surfaces des matériaux programmables.

Utilisation de la biologie synthétique à l&#39;ingénieur cellules vivantes Interface avec les matériaux programmables

Découvrez l'utilisation de biosensors ratiométriques basés sur GFP pour mesurer l'état redox mitochondrial et les niveaux d'ATP dans les cellules vivantes de levure. Cette méthode offre une résolution subcellulaire pour l'analyse fonctionnelle.

Biosensors Ratiométrique qui mesurent l'état redox mitochondrial et de l'ATP dans les cellules vivantes de levure

Explorer plus de vidéos