Soutenue par une matrice désorption / ionisation laser temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse Analyse des protéines intactes de plus de 100 kDa

L’objectif global de cette procédure est d’analyser de manière sensible des protéines intactes de plus de 100 kilodaltons par spectrométrie de masse maldi. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les solutions matricielles. La deuxième étape consiste à déposer la solution en couche mince sur la cible.

Ensuite, l’échantillon et le mélange de matrices sont déposés sur la cible. La dernière étape consiste à observer les points de l’échantillon au microscope. En fin de compte, un spectromètre multi-masse est utilisé pour analyser les protéines intactes et enregistrer les spectres de masse.

Le principal avantage de la spectrométrie de masse maldi par rapport à d’autres approches analytiques, telles que l’ionisation par électronébulisation, est qu’elle est plus tolérante au sel, aux contaminants et aux détergents. Un autre avantage du maldi est qu’il génère des ions transportant moins de charges que l’électrospray. Par conséquent, l’acquisition et l’interprétation des données MDI sont assez simples.

Pour commencer la cristallisation du rech, versez 10 millilitres d’éthanol à 40 % dans un Pyrex que. Puis à 600 milligrammes d’une matrice à l’aide d’un bain-marie et d’un réchauffeur à résistance. Réchauffez la solution matricielle et remuez-la jusqu’à ce que la matrice soit complètement dissoute.

Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que la solution soit saturée. Laissez la solution refroidir lentement à température ambiante pendant plusieurs heures, puis conservez-la à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Si des cristaux ne sont pas formés, grattez l’intérieur du bécher juste sous la surface de la solution, à l’aide d’une tige de verre pour induire la cristallisation.

Enfin, collectez les cristaux de matrice par filtration. Rincez les cristaux résiduels dans le ballon avec un minimum de solvant glacé et filtrez-les. Une fois la filtration terminée, laissez sécher les cristaux pour nettoyer la plaque cible maldi.

Rincez-le au méthanol et essuyez-le doucement avec une lingette kim. Ensuite, rincez-le à l’eau et essuyez-le avec une lingette kim. Insérez la cible maldi dans un bécher de 600 millilitres et couvrez-la avec de l’éthanol à 50 %.

Ensuite, sonifiez la cible dans la solution d’éthanol pendant 10 minutes dans un bain à ultrasons. S’il reste des résidus sur la plaque, répétez les étapes précédentes. Rincez la cible avec du méthanol ou de l’eau le solvant utilisé, détermine la quantité d’étalement de l’échantillon.

Inclinez ensuite la cible de manière à ce que tout le liquide soit collecté sur une lingette Kim. Séchez la cible à l’aide d’un flux d’azote gazeux. À l’étape suivante, dissolvez l’alpha CHCA dans l’acétone.

Afin de préparer une solution saturée, trempez une pointe de pipette de 10 microlitres dans la solution saturée alpha CHCA de manière à ce qu’une petite quantité de la solution s’écoule dans la pointe. Touchez rapidement la cible maldi avec la pointe de la pipette pour déposer la solution alpha CHCA sur la cible maldi à l’aide d’un tube en plastique de 1,5 millilitre. Préparez une solution d’alpha CHCA de 20 milligrammes par millilitre en dissolvant l’alpha CHCA dans un rapport de sept à trois volumes d’acétonitrile et d’acide formique à 5 %, étiqueté la solution comme une solution d’alpha CHCA.

Ensuite, préparez une solution de DHB de 20 milligrammes par millilitre en dissolvant le DHB dans un rapport de sept à trois volumes d’acétylnitrile à 0,1 % d’acide trifluoroacétique, étiqueté la solution comme solution de DHB. Mélangez la solution alpha CHCA et la solution DHB dans un rapport de volume de un pour un. Pour obtenir la solution C-H-C-A-D-H-B avant de commencer cette procédure, une étape facultative consiste à purifier les échantillons de protéines par échange de tampon indiqué dans la référence indiquée.

Sinon, déposez un échantillon de protéine non purifiée sur la cible MALDI. Ensuite, déposez 0,5 microlitre de l’échantillon de protéines sur la fine couche préparée d’alpha CHCA. Immédiatement après cela, ajoutez 0,5 microlitre de la solution C-H-C-A-D-H-B.

Déposez 0,5 microlitre de l’étalon Caïn sur la plaque MALDI, puis ajoutez 0,5 microlitre de la solution matricielle. Une fois les échantillons et le cain séchés, vous pouvez observer les taches au microscope, insérer la cible dans l’instrument et choisir la configuration appropriée de l’instrument. Choisissez ensuite la plage de rapport masse/charge appropriée.

Acquérez les spectres de l’appareil et calibrez l’instrument à l’aide de l’intensité laser appropriée. Acquérir les spectres des échantillons de protéines. Analyse MALDI toff de la région chromosomique intacte Maintenance une protéine est montrée ici.

Le mélange C-H-C-A-D-H-B a donné des spectres de masse de meilleure qualité en termes de rapport signal/bruit et de sensibilité. En particulier, 0,5 picomoles de protéine déposée sur la cible MALDI a pu être détectée, alors que la même quantité de protéine était à peine détectable En utilisant l’acide SINO NIC utilisant le mélange C-H-C-A-D-H-B, des ions chargés multiples de la protéine ont été observés, permettant la détermination de la masse avec une plus grande précision car la résolution du pic est inversement proportionnelle au rapport de charge maître dans le cas d’un instrument axial multi toff. De plus, en utilisant le mélange C-H-C-A-D-H-B, notre méthode de choix pour le dépôt matriciel a été l’approche en couche mince.

En utilisant la méthode des gouttelettes séchées, aucune protéine d’une masse supérieure à 100 kilodaltons n’a été détectée. La protéine monomère bêta collectée aase a également été analysée par multi TOF. Les spectres C-H-C-A-D-H-B étaient meilleurs que les spectres d’acide SINO NIC en termes de sensibilité et de résolution.

De plus, la présence d’ions chargés à plusieurs reprises a permis de confirmer la masse de la protéine avec une plus grande précision. Le MALDI à l’analyse d’une immunoglobuline intacte est illustré ici. Les spectres obtenus à l’aide du mélange C-H-C-A-D-H-B étaient beaucoup plus intenses que les spectres SA et alpha CHCA.

Plus précisément, les signaux protéiques étaient plus élevés et avaient une meilleure résolution dans les spectres C-H-C-A-D-H-B. L’utilisation du mélange C-H-C-A-D-H-B et la méthode de dépôt en couche mince ont démontré des améliorations significatives de la qualité des grandes protéines intactes. Spectres de masse acquis à l’aide d’un MALDI pour instrumenter.

Le protocole présenté illustre comment acquérir des spectres de masse de haute qualité de protéines de haut poids moléculaire à l’aide d’une multitude d’instruments. Lorsque vous effectuez ce type d’analyse, trois choses sont importantes. Tout d’abord, utiliser une solution de métriques fraîchement préparée.

Deuxièmement, pour bien déposer votre échantillon sur la cible du Mali. Et troisièmement, d’utiliser le réglage instrumental approprié tel que l’intensité laser.