Approches avant génétiques dans

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer une analyse génétique de Chlamydia trachomatis en réalisant une mutagénèse chimique et en déterminant les associations génotype-phénotype. Ceci est réalisé en premier lieu en générant des souches mutantes de Chlamydia trachomatis par mutagénèse chimique. Ensuite, l'ensemble des mutations induites chimiquement est identifié par séquençage complet du génome, suivi d'un assemblage du génome guidé par un génome de référence.

Ensuite, les associations entre phénotype et génotype dans les souches mutantes sont identifiées. Enfin, ces associations entre phénotype et génotype sont confirmées par la génération de souches recombinantes et leur analyse. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant qu'une mutation dans un gène particulier de Chlamydia conduit à un phénotype d'intérêt grâce à une combinaison d'approches classiques de mutagenèse chimique et de séquençage de nouvelle génération Singh.

Il n'existe actuellement aucune méthode disponible pour le remplacement de gènes chez Chlamydia, et les outils génétiques moléculaires destinés à son étude en sont encore à leurs débuts. Cette méthode ne nécessite pas de transformation par de l'ADN recombinant ni le développement d'outils génétiques moléculaires, tout en atteignant le même objectif, à savoir l'attribution d'une fonction à des produits géniques individuels.

Pour préparer les cellules cultivées, ensemencez environ un fois dix puissance six cellules par vingt-cinq centimètres carrés dans trois millilitres de DMEM complété avec 10 % de FBS, puis incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules atteignent la confluence, soit environ 24 heures plus tard, aspirez le milieu et infectez les cellules avec Chlamydia à une multiplicité d'infection de cinq. Dans un volume total de trois millilitres de DMEM-FBS contenant 200 nanogrammes par millilitre de cycloheximide, commencez la mutagenèse 18 heures après l'infection. Sous une hotte chimique, préparez 20 milligrammes par millilitre d'ethyl méthane sulfonate (EMS) dans du PBS contenant du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium.

Le EMS est un mutagène et un carcinogène puissant. Par conséquent, reportez-vous au protocole écrit pour son élimination. Aspirez le milieu des cellules Vero et rincez-les une fois avec trois millilitres de PBS contenant du chlorure de magnésium et du chlorure de calcium.

Ensuite, ajoutez trois millilitres de solution de CEM et incubez pendant une heure dans la hotte sous la fumée à température ambiante. Après l'incubation, retirez le CEM et placez-le dans un récipient contenant une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire afin d'inactiver le mutagène, puis lavez les cellules trois fois pour éliminer tout résidu de CEM. Ensuite, ajoutez six millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS, 200 nanogrammes par millilitre de cycloheximide et 25 microgrammes par millilitre de gentamicine, puis incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures.

Les inclusions apparaissent dépourvues de bactéries environ 36 heures après la mutagénèse à 72 heures. Environ 10 % des inclusions sont remplies de bactéries, tandis que les autres restent vides ; pour extraire les corps élémentaires ou EBS par lyse hypotonique, aspirez complètement le milieu. Ajoutez un millilitre d'eau et agitez pendant 10 minutes afin de détacher les cellules, puis lysez les cellules en pipetant vers le haut et vers le bas au moins 10 fois.

Après avoir collecté le lysat dans un tube microfuge, ajouter 0,25 millilitre de cinq x SPG (tampon sucrose-phosphate-glutamate) pour obtenir une concentration finale de un x, puis conserver à moins 80 degrés Celsius. Préparer des monocouches confluentes de cellules Vero dans des plaques à six puits en semant environ 0,4 fois 10 puissance six cellules dans trois millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS par puits, et laisser les cellules former une monocouche homogène au cours des 24 heures suivantes. Ensuite, placer sur de la glace une solution mère de Chlamydia mutagène.

Préparez ensuite six tubes d'une dilution sérielle dix fois dans un volume total de 200 microlitres par dilution en DMEM 10 % FBS, puis placez-les sur de la glace. Utilisez trois millilitres par puits de PBS pour laver les cellules Vero deux fois. Ajoutez ensuite trois millilitres de DMEM dans chaque puits pour les plaques à six puits et 100 microlitres de la dilution bactérienne en double.

Agiter la plaque pour assurer un mélange homogène. Faire centrifuger les plaques infectées à 2 700 ×g pendant 30 minutes à 15 °C. Puis les incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une à deux heures.

Entre-temps, préparez 0,54 % d'AROS dans du DMEM en mélangeant d'abord les ingrédients suivants. Ensuite, incorporez 18,9 millilitres de solution stérile chaude à 1,2 % d'aros dans l'eau, en remuant pour éviter les grumeaux. Maintenez le mélange au chaud dans un bain-marie à 55 degrés Celsius.

Aspirez la suspension bactérienne des boîtes et ajoutez six millilitres de la solution chaude de aro. Laissez durcir complètement à température ambiante à l'extérieur de la hotte. Ensuite, dans la hotte de sécurité biologique avec les couvercles retirés, faites sécher les boîtes pendant 15 minutes supplémentaires. Une fois les boîtes sèches, incubez-les à 37 degrés Celsius dans une incubateur à dioxyde de carbone pendant sept à dix jours.

Les plaques doivent être visibles à l’aide d’un microscope stéréoscopique un jour avant l’isolement des mutants. Voir une fois dix puissance quatre zéro cellules dans 100 microlitres par puits. Dans une plaque de 96 puits, les cellules seront confluentes en moins de 24 heures.

Sous un microscope stéréo, marquer les plaques à prélever, puis utiliser une pipette stérile de un millilitre avec embout-barrière pour prélever des prélèvements de plaques. Resuspendre les plaques dans 100 microlitres de DMEM supplémenté avec 10 % de FBS, 400 nanogrammes par millilitre de cyclo, heide, et 50 microgrammes par millilitre de gentamicine afin d'agrandir les souches mutantes. Recouvrir la suspension sur des monocouches confluentes de cellules Vero.

Faire tourner les plaques à 2 700 GS et à 15 degrés Celsius pendant 30 minutes avant d'incuber les DB de récolte lorsque plus de 50 % des cellules sont infectées, ce qui peut survenir aussi tôt que 48 heures après l'infection et jusqu'à 14 jours. Cette quantité de cellules infectées permet de conserver suffisamment de bactéries viables pour extraire les VEs par lyse hypotonique des cellules infectées. Après avoir aspiré le milieu, ajouter 160 microlitres d'eau stérile et incuber à température ambiante pendant 10 minutes.

Utilisez des embouts barrières pour lyser les cellules en aspirant et en expulsant plusieurs fois afin d'assurer une lyse complète. Finalement, transférez 160 microlitres de chaque lysat dans des tubes microfuge. Ajoutez 40 microlitres de SPG 5X et conservez à moins 80 degrés Celsius jusqu'au moment de réaliser le dosage et de cribler les mutants pour les phénotypes d'intérêt.

L'exposition à un mutagène conduit à la formation d'inclusions qui semblent dépourvues de bactéries, probablement en raison de la mort cellulaire bactérienne. En général, le sérovar LGVL deux élimine complètement les cellules infectées dans les 48 heures suivant l'infection, mais le traitement avec des mutagènes peut prolonger ce cycle à plus de 90 heures, et environ 10 % des inclusions devraient récupérer dans nos expériences. Des cellules Vero infectées traitées avec 20 milligrammes par millilitre d'EMS ont montré une diminution de 99 % du taux de récupération des progénitures infectieuses par rapport aux témoins non traités, comme illustré sur cette figure.

Le traitement mutagène a également conduit à l’apparition de plaques présentant des morphologies modifiées, notamment des plaques de petite taille. D'autres morphologies comprennent des plaques ayant un aspect granuleux, grumeleux ou en forme de nid d'abeille, comme illustré ici. Les doses de EMS utilisées dans ces études peuvent induire de trois à 30 mutations par génome de KCL, comme évalué expérimentalement par séquençage à haut débit (NGS).

Bien que les EBS purifiés par gradient soient largement débarrassés des matériaux des cellules hôtes, l'ADN hôte est également détecté et représente environ 10 à 15 % des préparations génomiques après cette procédure. Des criblages pour des phénotypes tels que la réplication altérée dans des cellules en culture tissulaire, la perte d'activités biochimiques ou des modifications de la morphologie bactérienne peuvent être réalisés afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les facteurs bactériens requis pour la formation et le maintien des chlamydiae, ainsi que les facteurs de pathogénicité.