Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer le transport d’un système d’administration de médicament ou de l’agent thérapeutique. Il traverse une barrière cellulaire telle qu’un modèle de l’épithélium gastro-intestinal pertinent pour l’administration orale de médicaments. Ceci est accompli en cultivant d’abord deux cellules sur des inserts transwell pour permettre la différenciation cellulaire et la formation d’une monocouche cellulaire.

La deuxième étape consiste à valider que ce modèle représente une barrière de perméabilité en mesurant la résistance électrique trans-épithéliale, les jonctions cellulaires d’immunomarquage et en évaluant la perméabilité passive d’une molécule traceur détectable. L’étape suivante consiste à préparer le système d’administration de médicaments : les nano-supports polymères ciblés sont utilisés dans cet exemple. Les transporteurs peuvent contenir une cargaison de drogue ou non, et des contrôles tels que des transporteurs non ciblés ou une drogue gratuite doivent être inclus.

Ces éléments sont marqués avec des radio-isotopes pour permettre leur détection. Les porteurs sont ensuite ajoutés à la chambre apicale au-dessus de la monocouche cellulaire après l’incubation. Pendant des points temporels variables, les porteurs sont prélevés dans la chambre apicale, la chambre basolatérale et la monocouche cellulaire et testés pour la dégradation potentielle du composant marqué.

Le transport de la nanovoiture à travers la monocouche cellulaire est ensuite calculé, finalement, pour étudier le mécanisme de transport. Des expériences similaires doivent être menées en présence d’inhibiteurs pharmacologiques de la transcytose à travers les cellules ou avec des rapporteurs du transport paracellulaire entre les cellules. La technique que nous décrivons ici est une adaptation de méthodes bien établies utilisées pour évaluer le taux et le mécanisme de transport des médicaments et des nanotransporteurs de médicaments à travers les monocouches cellulaires en culture, qui représentent les barrières cellulaires dans le corps.

Bien que l’exemple sur lequel nous nous sommes concentrés ici valide le transport de nanoparticules de polymère ciblées à travers un modèle d’épithélium gastro-intestinal. Des méthodes similaires peuvent également être appliquées pour examiner le passage de différents systèmes d’administration de médicaments à travers ces monocouches cellulaires ou différentes couches cellulaires, telles que les cellules endothéliales qui forment généralement une barrière entre la circulation sanguine et les tissus et organes. Par exemple, dans le cas de la barrière hémato-encéphalique, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront généralement du mal à choisir des étiquettes pour tracer correctement les systèmes d’administration de médicaments à travers ces études, en particulier s’ils sont transportés à travers des cellules et de petites quantités.

Pour cet aspect, nous utiliserons des radio-isotopes pour marquer les systèmes d’administration de médicaments dans nos études, une autre préoccupation majeure est de valider l’intégrité de la barrière cellulaire modèle et d’utiliser les contrôles appropriés pour valider cela à travers les expériences. Cette procédure est effectuée dans une hotte de culture cellulaire stérile de niveau de biosécurité deux, et tous les matériaux entrant dans la hotte doivent être stérilisés à l’éthanol à l’aide d’une pince de 0,8 micromètre. Faible tarif en polyéthylène, le transwell de phtalate s’insère dans une plaque de 24 puits pour des résultats statistiquement significatifs.

Chaque condition expérimentale nécessite un minimum de quatre répétitions. Diluez l’adénocarcinome colorectal épithélial humain ou caco deux cellules dans un milieu cellulaire préalablement préparé. Placez 200 à 400 microlitres de la solution cellulaire dans la chambre supérieure ou apicale du puits de transpropriété.

Insérez à une densité de 1,5 fois 10 aux cinq cellules par centimètre carré. Remplissez la chambre inférieure ou basolatérale avec 700 à 900 microlitres de cellules de culture de milieu cellulaire à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité pendant 16 à 21 jours tous les trois à quatre jours. Remplacez le fluide dans les chambres supérieure et inférieure.

Replacez le fluide dans l’ordre suivant pour maintenir la pression au-dessus de la monocouche cellulaire, aspirez le fluide de la chambre inférieure, aspirez le fluide de la chambre supérieure. Remplissez la chambre supérieure avec 200 à 400 microlitres de milieu frais et remplissez la chambre inférieure avec 700 à 900 microlitres de milieu frais pour valider la barrière de perméabilité épithéliale par étage. Réglez le voltmètre sur le réglage de résistance et placez verticalement les électrodes dans un puits contenant l’insert de transpuits.

L’électrode courte doit se trouver dans la chambre supérieure et l’électrode longue dans la chambre inférieure en contact avec le fond du puits. Une fois que la lecture du voltmètre O se stabilise, notez la valeur de la résistance en ohms pour chacun. Eh bien, répétez les mesures tous les un à deux jours jusqu’à ce que les valeurs de larmes atteignent un maximum et un plateau indiquant la formation d’une barrière de perméabilité, ce qui prend généralement deux à trois semaines à partir du moment du placage cellulaire.

Pour vérifier la présence de jonctions serrées dans les monocouches cellulaires avec un niveau élevé, fixez d’abord les cellules, aspirez le milieu des deux chambres et lavez les cellules trois fois avec du DMEM chaud, incubez avec de l’aldéhyde paraforme à 2 % froid pendant 15 minutes. Après 15 minutes, retirez l’aldéhyde paraforme et lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez un microgramme par millilitre d’anti-occludine à chacun.

Bien utiliser des puits à faible déchirure comme contrôle négatif pour la formation de barrières. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante Après 30 minutes, lavez à nouveau les cellules avec du PBS, puis à 7,5 microgrammes par millilitre d’anticorps secondaires marqués pour chaque puits d’incubation pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Enfin, lavez les cellules avec du PBS et excisez soigneusement la membrane filtrante sur laquelle la monocouche fixe est fixée sur des lames pour l’imagerie à l’aide de l’épi, de la fluorescence ou de la microscopie confocale.

Cette procédure commence par le marquage de l’anticorps cible avec de l’iode 1 25 et le calcul de l’activité spécifique de l’anticorps marqué en nombre de fois par minute et par microgramme à l’aide des protocoles précédemment publiés. Dans cet exemple, l’anticorps cible est un anticorps monoclonal de souris contre une molécule d’adhésion intercellulaire humaine, un ou un anti ICAM pour contrôler la spécificité. Des IgG de souris marquées à l’iode 1 25 seront utilisées pour préparer des nano-transporteurs enrobés non ciblés afin d’étudier le transport d’une cargaison thérapeutique.

La cargaison est également étiquetée avec de l’iode 1 25. Dans cet exemple, la cargaison est de l’alpha galacto SASE ou Alpha G, une enzyme thérapeutique utilisée pour le traitement de la maladie de Fabry, un trouble génétique de surcharge lysosomale. L’un des aspects les plus difficiles de cette procédure est d’assurer une détection adéquate des matériaux transportés.

Pour garantir le succès, les composants des nanovoitures doivent être marqués avec une quantité suffisante d’isotopes à haute activité spécifique. L’étape suivante consiste à coupler l’anti ICAM étiqueté à la surface des nano-porteurs. Dans ce cas, nous mélangeons simplement l’iode 1 25 marqué anti ICAM avec des nanobilles de polystyrène de 100 nanomètres de diamètre comme modèle pour le contrôle non spécifique.

Utilisez de l’iode 1 25 marqué IgG et pour suivre le transport d’une cargaison, utilisez une combinaison d’anti ICAM et d’iode 1 25 étiqueté Alpha G. Incuber les mélanges pendant une heure à température ambiante pour permettre l’absorption superficielle après une heure centrifuger à 13 000 GS pendant trois minutes, puis prélever les équivalents non enrobés dans le surnageant à l’aide d’une pipette d’aspiration pour suspendre la pastille contenant des nano-supports enrobés dans 1 % de sérum bovin l’albumine dans le PBS sonicate à faible puissance pour perturber les agrégats de particules potentiels. Ajouter de l’iode 1 25 nano-porteurs anti ICAM dans la chambre supérieure au-dessus du confluent caco deux monocouches à haut niveau. Répétez la procédure pour les homologues non spécifiques et thérapeutiques après avoir mesuré la déchirure.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant un ou plusieurs intervalles de temps souhaités. Mesurez à nouveau la larme après l’incubation. Les mesures de déchirure permettent d’évaluer les effets des nano-porteurs sur la barrière de perméabilité.

Prélever le milieu dans les chambres supérieure et inférieure. Lavez la chambre supérieure avec 0,5 millilitre de DMEM à 37 degrés Celsius et la chambre inférieure avec un millilitre d’eau déminéralisée. Collecter les lavages pour mesurer la teneur totale en radio-isotopes à l’aide d’un compteur gamma pour la mesure de la fraction cellulaire.

Excise le filtre perméable à l’aide d’une lame de rasoir pour couper les bords. Incuber dans un tube compteur gamma avec 1 % de Triton X 100 pendant 10 minutes pour libérer le contenu de la cellule avant de mesurer la radioactivité totale associée à la cellule pour mesurer l’iode 1 à 25 libéré par les nanoporteurs pendant le transport ou en raison d’une dégradation potentielle. Mélangez d’abord 300 microlitres de chaque échantillon avec 700 microlitres de BSA à 3 % dans du PBS et 200 microlitres d’acide trichloracétique ou de TCA à incuber à température ambiante pendant 15 minutes.

Au cours de cette incubation de 15 minutes, mesurer la radioactivité totale des échantillons dans des échantillons de TCA à 3000 GS pendant cinq minutes pour séparer la protéine intacte de la protéine dégradée ou de la fraction d’iode 1 25. Quantifier la radioactivité de la fraction d’iode libre 1 25 et soustraire cette valeur de la radioactivité totale mesurée avant centrifugation. Cela permettra d’évaluer la quantité de protéine marquée par rapport à la fraction de radiotraceur qui s’en est détachée pour évaluer le transport paracellulaire à l’aide de l’albumine, de la culture de fuite paracellulaire, de KCO, de deux monocouches sur des inserts de transwell, comme démontré précédemment, au milieu de la chambre supérieure au-dessus de la monocouche cellulaire à l’iode 1 25, de l’albumine marquée seule en tant que contrôle négatif montrant le niveau basal de fuite ou de l’iode.

1 25 albumine marquée et anticorps non radiomarqués. Les nano-transporteurs ciblés incubent à 37 degrés Celsius pendant les intervalles de temps sélectionnés, ce qui devrait correspondre à ceux examinés lors des tests nz. Transport. Mesurez la larme comme démontré précédemment avant, pendant et après l’incubation.

Prélever toutes les fractions après l’incubation pour mesurer l’iode total 1 25 et l’iode libre 1 25 comme témoin positif pour l’ouverture des jonctions intercellulaires. Ajoutez des milieux cellulaires contenant cinq millimolaires de peroxyde d’hydrogène dans les chambres supérieure et inférieure du puits de transfusion. Insérez-les et incuberez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Mesurez la déchirure et ajoutez de l’iode 1 25 albumine dans la chambre supérieure pendant les intervalles de temps sélectionnés. Mesurez la déchirure à différents moments de l’incubation pour identifier la décroissance de la valeur lacrymale causée par l’ouverture des jonctions cellulaires induite par le peroxyde d’hydrogène. Dans des expériences parallèles, évaluer le transport transcellulaire ou la transcytose de nano-transporteurs ciblés de l’iode 1 25 en incubant deux monocouches confluentes de Caco avec chacun de ces inhibiteurs.

50 MDC micromolaire un inhibiteur de l’endocytose médiée par la clathrine. Un microgramme par millilitre de filipine, un inhibiteur de l’endocytose médiée par le clar. 0,5 micromolaire WT manin un inhibiteur de la phosphatidylinositol trois kinase, qui est impliquée dans la macropinocytose et 20 micromolaires, EIPA.

Un inhibiteur de la macropinocytose et une endocytose médiée par des produits chimiques mesurent la déchirure avant, pendant et après l’incubation de cellules avec des inhibiteurs et des matériaux radiomarqués comme contrôle supplémentaire de l’effet des inhibiteurs sur la perméabilité de la monocouche pour valider les deux monocouches de CACO En tant que modèle de transport transépithélial de nano-transporteurs ciblés, les cellules de caco deux ont été cultivées sur des inserts de transwell à 1,5 fois 10 des cinq cellules par centimètre carré et trans épithéliale La résistance électrique ou la déchirure a été mesurée pour évaluer l’intégrité de la monocouche Comme le montre ce graphique, la monocouche a atteint la confluence au jour 12 et a maintenu l’intégrité de la monocouche jusqu’au jour 18. Ce résultat a été validé par la présence de jonctions serrées positives à l’occludine dans les monocouches avec un niveau élevé de 380 ohms par centimètre carré au jour 14 par rapport à l’étiquetage des jonctions serrées à un niveau bas de 17 ohms par centimètre carré. Le cinquième jour, pour évaluer le transport des nano-porteurs anti-ICAM à travers le caco, deux monocouches cellulaires confluentes Caco, deux monocouches cultivées sur des inserts transpuits ont été incubées avec de l’iode 1 25 nano-transporteurs anti-ICAM ajoutés à la chambre apicale.

teneur en iode 1 25 dans la chambre basale latérale a été mesurée aux points temporels indiqués pour calculer la quantité de nanoporteurs transportés par cellule, comme indiqué dans le panneau supérieur dans le panneau inférieur, le pourcentage de nano-transporteurs transportés a été calculé comme le rapport entre les porteurs trouvés dans la fraction basolatérale et celle dans les fractions basolatérales et cellulaires combinées. Ces paramètres estimés dans cet exemple pour les nano porteurs d’iode 1 25 anti ICAM ont également été comparés à ceux de contrôle. Iode 1 25 IgG nano porteurs pour démontrer l’efficacité de transport par rapport à une contrepartie non ciblée et les résultats sont présentés dans le panneau supérieur.

Des coefficients de perméabilité apparente ont également été calculés pour refléter les taux de transport des nano-transporteurs d’iode 1 25 anti-ICAM ou des nano-transporteurs d’iode 1 25 IgG, comme le montre le panneau inférieur lorsque le marqueur radioactif est incorporé sur la cargaison de nanovoitures. Les paramètres décrits reflètent le transport de la cargaison, qui dans cet exemple est l’enzyme alpha GA utilisée pour le traitement d’un trouble génétique de surcharge lysosomale connu sous le nom de maladie de Fabry. La teneur en radio-isotopes des fractions apicales, basolatérales et cellulaires a été mesurée à trois heures et à 24 heures, puis convertie en diverses valeurs pertinentes pour le transport, comme le montre ce tableau.

En plus de calculer le transport des nanocars en traçant la cargaison, l’administration transépithéliale de cette enzyme thérapeutique peut être estimée en l’exprimant sous forme de molécules ou de picogrammes d’Alpha-gal transportés par cellule. Le mécanisme de transport des nano-transporteurs anti ICAM à travers les monocouches de Caco a également été étudié Le transport transcellulaire de l’iode 1 25 nano-transporteurs anti ICAM à travers les deux monocouches confluentes de Caco a été évalué à 24 heures en l’absence ou en présence des inhibiteurs suivants, EIPA, Philippine MDC ou Wirt manin, EIPA est un inhibiteur de la macropinocytose et peut médier l’endocytose. La ménine philippine, MDC et WT sont des inhibiteurs de l’endocytose médiée par le clar, de l’endocytose médiée par la clathrine et de la macropinocytose respectivement.

Comme l’indique ce graphique, l’EIPA a réduit le transport de l’iode 1 25 nano-transporteurs anti IAM à travers les monocouches de deux cellules CACO. Alors que Philippine MDC et Wirt Menin n’ont pas réduit les niveaux de transport en ce qui concerne la condition de contrôle. Cela suggère que les nano-transporteurs anti-ICAM utilisent l’endocytose médiée par les produits chimiques pour le transport transcellulaire, mais pas la transcytose liée à la clar, à la clathrine ou à la macropinocytose.

Pour évaluer le transport paracellulaire, la déchirure a été mesurée pendant le transport de l’iode 1 25 nano porteurs anti ICAM à travers le caco. Deux valeurs de déchirure monocouches en l’absence de nano-porteurs sont indiquées comme contrôles et l’intervalle pointillé marque le MEB de l’incubation moyenne avec cinq millimolaires. Le peroxyde d’hydrogène était un contrôle positif pour l’ouverture des jonctions intercellulaires, comme en témoigne la diminution des niveaux de larme à la base.

De plus, la fuite de protéines paracellulaires mesurée par le coefficient de perméabilité apparent de l’iode 1 25, l’albumine traversant la monocouche cellulaire en l’absence ou la présence de peroxyde d’hydrogène cinq millimolaires, de nano-porteurs d’IgG ou de nano-porteurs anti-ICAM a été mesurée et calculée : le peroxyde d’hydrogène a considérablement augmenté la fuite d’albumine d’iode 1 25 vers la chambre latérale basale et a servi de contrôle positif, comme le montrent ces graphiques. L’incubation avec des nano-porteurs anti-ICAM n’a pas altéré les larmes ou l’iode. 1 25 fuite paracellulaire d’albumine sur une période de 48 heures, similaire à celle des nanoporteurs d’IgG témoins qui ne sont pas transportés.

Ces résultats excluent le transport paracellulaire et sont cohérents avec les résultats précédents suggérant que les nanoporteurs anti-ICAM utilisent l’endocytose médiée par cam pour le transport transcellulaire. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de sélectionner un ou plusieurs types de cellules appropriés et un filtre perméable avec une taille de pore appropriée, un diamètre de matériau, etc. pour le modèle Transwell, et des techniques de marquage pour une quantification efficace de votre système d’administration de médicament à la suite de cette procédure. D’autres méthodes telles que la fluorescence ou la microscopie électronique à transmission peuvent être utilisées pour déterminer l’emplacement des matériaux transportés et en plus pour vérifier l’état des matériaux transportés.

Le Western blot peut être utilisé pour mesurer la dégradation des protéines. L’EISA peut être utilisée pour déterminer la capacité de ciblage des transporteurs transportés, et l’activité de la cargaison de drogue peut être mesurée à l’aide de tests spectrophotométriques ou d’autres techniques appropriées.