Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer le transport d'un système de délivrance de médicament ou de l'agent thérapeutique qu'il transporte à travers une barrière cellulaire, telle qu'un modèle de l'épithélium gastro-intestinal pertinent pour la délivrance orale de médicaments. Ceci est réalisé en cultivant d'abord des cellules Caco-2 sur des inserts Transwell afin de permettre la différenciation cellulaire et la formation d'une monocouche cellulaire.

La deuxième étape consiste à valider que ce modèle représente une barrière de perméabilité en mesurant la résistance électrique transépithéliale, en réalisant une immunomarquage des jonctions cellulaires et en évaluant la perméabilité passive d'une molécule traceuse détectable. L'étape suivante consiste à préparer le système de délivrance de médicament ; des nanocarriers polymériques ciblés sont utilisés dans cet exemple. Les nanocarriers peuvent contenir ou non une charge médicamenteuse, et des contrôles tels que des nanocarriers non ciblés ou un médicament libre doivent être inclus.

Ces éléments sont marqués avec des radioisotopes afin de permettre leur détection. Les transporteurs sont ensuite ajoutés dans la chambre apicale située au-dessus de la monocouche cellulaire après incubation. À différents temps d'incubation, les transporteurs sont prélevés de la chambre apicale, de la chambre basolatérale et de la monocouche cellulaire, puis analysés afin de détecter une éventuelle dégradation du composant marqué.

Le transport de nanocarriers à travers la monocouche cellulaire est ensuite calculé enfin, afin d'étudier le mécanisme de transport. Des expériences similaires doivent être menées en présence d'inhibiteurs pharmacologiques de la transcytose à travers les cellules ou avec des traceurs de transport paracellulaire entre les cellules. La technique que nous décrivons ici est une adaptation de méthodes bien établies utilisées pour évaluer la vitesse et le mécanisme de transport de médicaments et de nanocarriers médicamenteux à travers des monocouches cellulaires en culture, qui représentent des barrières cellulaires dans l'organisme.

Bien que l'exemple sur lequel nous nous sommes concentrés ici valide le transport de nanoparticules polymériques ciblées à travers un modèle d'épithélium gastro-intestinal, des méthodes similaires peuvent également être appliquées pour examiner le passage de différents systèmes de délivrance de médicaments à travers ces monocouches cellulaires ou d'autres, comme les cellules endothéliales qui forment généralement une barrière entre la circulation sanguine et les tissus ou organes. Par exemple, dans le cas de la barrière hémato-encéphalique, les personnes novices dans cette méthode éprouvent généralement des difficultés en raison de la complexité du choix des marqueurs permettant de tracer correctement les systèmes de délivrance de médicaments au cours de ces études, particulièrement lorsque ceux-ci sont transportés à travers les cellules et en faibles quantités.

Pour cet aspect, nous utiliserons des radioisotopes afin de marquer les systèmes de délivrance de médicaments dans nos études. Une autre préoccupation majeure consiste à valider l'intégrité de la barrière cellulaire modélisée et à utiliser des contrôles appropriés pour valider celle-ci au cours des expériences. Cette procédure est réalisée dans une hotte de culture cellulaire stérile de niveau de biosécurité 2, et tous les matériaux entrant dans la hotte doivent être stérilisés à l'aide d'éthanol à l'aide de pinces, en plaçant des inserts Transwell en polyéthylène de 0,8 micromètre dans une plaque de 24 puits pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Chaque condition expérimentale nécessite un minimum de quatre répétitions. Diluez des cellules humaines d'adénocarcinome colorectal épithélial ou des cellules Caco-2 dans le milieu cellulaire préparé au préalable. Ajoutez de 200 à 400 microlitres de la solution cellulaire dans la chambre supérieure ou apicale du transwell.

Ensemencer à une densité de 1,5 × 10⁵ cellules par centimètre carré. Remplir la chambre inférieure ou basolatérale avec 700 à 900 µL de milieu de culture cellulaire et cultiver les cellules à 37 °C, 5 % CO₂ et 95 % d'humidité pendant 16 à 21 jours, en remplaçant le milieu dans les chambres supérieure et inférieure tous les trois à quatre jours.

Remplacer le milieu dans l'ordre suivant afin de maintenir la pression au-dessus de la monocouche cellulaire : aspirer le milieu de la chambre inférieure, puis aspirer le milieu de la chambre supérieure. Remplir la chambre supérieure avec 200 à 400 microlitres de milieu frais et la chambre inférieure avec 700 à 900 microlitres de milieu frais pour valider la barrière de perméabilité épithéliale par palier. Régler le voltohmètre sur le mode résistance et placer verticalement les électrodes dans un puits contenant l'insert transwell.

L'électrode courte doit se trouver dans la chambre supérieure et l'électrode longue dans la chambre inférieure, en contact avec le fond du puits. Une fois que la lecture du voltmètre se stabilise, enregistrez la valeur de la résistance en ohms pour chaque puits. Répétez les mesures tous les un à deux jours jusqu'à ce que les valeurs augmentent puis atteignent un plateau maximal, indiquant la formation d'une barrière de perméabilité, ce qui prend généralement deux à trois semaines à compter du moment du semis des cellules.

Pour vérifier la présence de jonctions serrées dans les monocouches cellulaires de haut niveau, commencez par fixer les cellules, aspirez le milieu des deux chambres et rincez les cellules trois fois avec du DMEM chaud. Incubez ensuite avec du paraformaldéhyde à 2 % froid pendant 15 minutes. Après 15 minutes, retirez le paraformaldéhyde et lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez un microgramme par millilitre d'anticorps anti-occludine à chacune.

On utilisera des puits présentant une faible perméabilité comme contrôle négatif pour la formation de la barrière. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après 30 minutes, laver à nouveau les cellules avec du PBS, puis ajouter 7,5 microgrammes par millilitre d'anticorps secondaires marqués dans chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. Enfin, laver les cellules avec du PBS et exciser soigneusement la membrane filtrante sur laquelle est fixée la monocouche, puis la monter sur des lames pour l'imagerie à l'aide d'une microscopie épifluorescente, en fluorescence ou confocale.

Cette procédure commence par la marquage de l'anticorps ciblé avec de l'iode 125 et le calcul de l'activité spécifique de l'anticorps marqué en comptages par minute par microgramme, selon des protocoles publiés précédemment. Dans cet exemple, l'anticorps ciblé est un anticorps monoclonal murin dirigé contre la molécule d'adhésion intercellulaire humaine, un ou anti-ICAM-1, afin de contrôler la spécificité. Une IgG murine marquée avec de l'iode 125 sera utilisée pour préparer des nanocarriers non ciblés recouverts, afin d'étudier le transport d'une charge thérapeutique.

La cargaison est également marquée à l’iode 125. Dans cet exemple, la cargaison est l’alpha-galactosidase ou Alpha G, une enzyme thérapeutique utilisée pour le traitement de la maladie de Fabry, une affection génétique de stockage lysosomal. L’un des aspects les plus difficiles de cette procédure consiste à assurer une détection adéquate des matériaux transportés.

Pour assurer le succès, les composants des nanocarriers doivent être marqués avec une quantité suffisante d'isotopes à haute activité spécifique. L'étape suivante consiste à coupler l'anticorps anti-ICAM marqué à la surface des nanocarriers. Dans ce cas, nous mélangeons simplement l'anticorps anti-ICAM marqué à l'iode 125 avec des nano-billes en polystyrène de 100 nanomètres de diamètre, utilisées comme modèle de contrôle non spécifique.

Utilisez une IgG marquée à l'iode 125 pour suivre le transport d'une cargaison, et employez une combinaison d'anticorps anti-ICAM et d'alpha G marqué à l'iode 125. Incubez les mélanges pendant une heure à température ambiante pour permettre l'absorption à la surface ; après une heure, centrifugez à 13 000 ×g pendant trois minutes, puis retirez les homologues non revêtus présents dans le surnageant à l'aide d'une pipette aspirante. Suspendez le culot contenant les nanotransporteurs revêtus dans une solution d'albumine sérique bovine à 1 % dans le PBS, puis soumettez à une sonication à faible puissance afin de rompre les éventuels agrégats de particules. Ajoutez les nanotransporteurs anti-ICAM marqués à l'iode 125 dans la chambre supérieure au-dessus des monocouches confluentes de Caco-2 avec un haut degré. Répétez la procédure pour les homologues non spécifiques et thérapeutiques après mesure de l'écoulement.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant un ou plusieurs intervalles de temps souhaités. Mesurer à nouveau la rupture après l'incubation. Les mesures de rupture servent à évaluer les effets des nanotransporteurs sur la barrière de perméabilité.

Prélèvez le milieu des chambres supérieure et inférieure. Lavez la chambre supérieure avec 0,5 millilitre de DMEM à 37 degrés Celsius et la chambre inférieure avec un millilitre d'eau déionisée. Collectez les lavages pour la mesure de la teneur totale en radioisotope à l'aide d'un compteur gamma afin d'évaluer la fraction cellulaire.

Excisez le filtre perméable en utilisant une lame de rasoir pour découper autour des bords. Incubez-le dans un tube de compteur gamma avec du Triton X-100 à 1 % pendant 10 minutes afin de libérer le contenu cellulaire avant de mesurer la radioactivité totale associée aux cellules, permettant ainsi de quantifier l'iode 125 libéré des nanovecteurs pendant le transport ou en raison d'une dégradation potentielle. Mélangez d'abord 300 microlitres de chaque échantillon avec 700 microlitres de BSA à 3 % dans le PBS et 200 microlitres d'acide trichloracétique (TCA), puis incubez à température ambiante pendant 15 minutes.

Au cours de cette incubation de 15 minutes, mesurez la radioactivité totale des échantillons dans un compteur à scintillation gamma. Centrifugez les échantillons de TCA à 3000 ×g pendant cinq minutes afin de séparer la protéine intacte de la protéine dégradée ou de la fraction d'iode 125. Quantifiez la radioactivité de la fraction d'iode libre 125 et soustrayez cette valeur de la radioactivité totale mesurée avant la centrifugation. Cela permettra d'obtenir la quantité de protéine marquée par rapport à la fraction de radiotraceur qui s'est détachée, afin d'évaluer le transport paracellulaire. Utilisez une culture de monochouches de KCO deux avec de l'albumine comme modèle de fuite paracellulaire, en ajoutant dans la chambre supérieure, au-dessus de la monocouche cellulaire, soit de l'albumine marquée à l'iode 125 seule (témoin négatif illustrant le niveau basal de fuite), soit de l'iode.

1 25 albumine marquée et anticorps non marqué radioactivement. Incuber les nanotransporteurs ciblés à 37 degrés Celsius pendant les intervalles de temps sélectionnés, qui doivent correspondre à ceux étudiés lors du test de nz.Transport. Mesurer les larmes comme démontré précédemment avant, pendant et après l'incubation.

Recueillir toutes les fractions après l'incubation pour effectuer des mesures de l'iode total 1 25 et de l'iode libre 1 25, servant de contrôle positif pour l'ouverture des jonctions intercellulaires. Ajouter le milieu cellulaire contenant du peroxyde d'hydrogène à cinq millimolaire dans les chambres supérieure et inférieure du transwell. Insérer et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Prélevez le liquide lacrymal et ajoutez de l'albumine marquée à l'iodé 125 dans la chambre supérieure pour des intervalles de temps sélectionnés. Mesurez le liquide lacrymal à différents points temporels pendant l'incubation afin de déterminer la décroissance de la valeur du liquide provoquée par l'ouverture des jonctions cellulaires induite par le peroxyde d'hydrogène. Dans des expériences parallèles, évaluez le transport transcellulaire ou la transcytose de nanovecteurs ciblés marqués à l'iodé 125 en incubant des monocouches confluentes de Caco-2 avec chacun de ces inhibiteurs.

50 micromolaire de MDC, un inhibiteur de l’endocytose médiée par la clathrine. Un microgramme par millilitre de filipine, un inhibiteur de l’endocytose médiée par les cavéoles. 0,5 micromolaire de wortmannine, un inhibiteur de la phosphatidylinositol trois kinase, impliquée dans la macropinocytose, et 20 micromolaire d’EIPA.

Un inhibiteur de la macropinocytose et de l'endocytose médiée par chimiotactisme permet de mesurer la résistance épithéliale transcellulaire (TEER) avant, pendant et après l'incubation des cellules avec les inhibiteurs et des matériaux marqués au radiolabel, en tant que contrôle supplémentaire de l'effet des inhibiteurs sur la perméabilité de la monocouche, afin de valider les monocouches CACO-2 comme modèle de transport transépithélial de nanotransporteurs ciblés. Les cellules CACO-2 ont été cultivées sur des inserts Transwell à raison de 1,5 × 10⁵ cellules par cm² et la résistance électrique épithéliale transcellulaire (TEER) a été mesurée pour évaluer l'intégrité de la monocouche. Comme indiqué sur ce graphique, la monocouche a atteint la confluence au jour 12 et a conservé son intégrité jusqu'au jour 18. Ce résultat a été confirmé par la présence de jonctions serrées positives pour l'occludine dans les monocouches présentant une valeur élevée de 380 ohms·cm⁻² au jour 14, comparée à une étiquetage des jonctions serrées au niveau bas de 17 ohms·cm⁻² au jour 5. Pour évaluer le transport de nanotransporteurs anti-ICAM à travers les monocouches de cellules CACO-2, des monocouches confluentes de CACO-2 cultivées sur des inserts Transwell ont été incubées avec des nanotransporteurs anti-ICAM marqués à l'iode 125 ajoutés dans la chambre apicale.

La teneur en iode 125 dans la chambre basolatérale a été mesurée aux temps indiqués afin de calculer la quantité de nanotransporteurs transportée par cellule, comme indiqué dans le panneau supérieur. Dans le panneau inférieur, le pourcentage de nanotransporteurs transportés a été calculé comme le rapport entre les transporteurs présents dans la fraction basolatérale et ceux présents dans les fractions combinées basolatérale et cellulaire. Ces paramètres, estimés dans cet exemple pour les nanotransporteurs anti-ICAM marqués à l'iode 125, ont également été comparés à ceux d'un témoin, les nanotransporteurs IgG marqués à l'iode 125, afin de démontrer l'efficacité de transport par rapport à un nanotransporteur non ciblé. Les résultats sont présentés dans le panneau supérieur.

Les coefficients de perméabilité apparente ont également été calculés, reflétant les taux de transport des nanotransporteurs d'anti-ICAM marqués à l'iode 125 ou des nanotransporteurs d'IgG marqués à l'iode 125, comme indiqué dans le panneau inférieur, lorsque la marque radioactive est incorporée au cargo du nanotransporteur. Les paramètres décrits reflètent le transport du cargo, qui, dans cet exemple, est l'enzyme alpha-GA utilisée pour le traitement d'une maladie lysosomale héréditaire connue sous le nom de maladie de Fabry. La teneur en radioisotope des fractions apicale, basolatérale et cellulaire a été mesurée après trois heures et 24 heures, puis convertie en différentes valeurs pertinentes pour le transport, comme indiqué dans ce tableau.

Outre le calcul du transport de nanocarriers par le traçage de la cargaison, la délivrance transépithéliale de cette enzyme thérapeutique peut être estimée en l'exprimant en nombre de molécules ou en picogrammes d'Alpha-gal transportés par cellule. Le mécanisme de transport des nanocarriers anti-ICAM à travers les monocouches de Caco a également été étudié. Le transport transcellulaire de nanocarriers anti-ICAM marqués à l’iode 125 à travers des monocouches confluentes de Caco-2 a été évalué après 24 heures, en l'absence ou en présence des inhibiteurs suivants : EIPA, Philippine MDC ou Wirt manin. L’EIPA est un inhibiteur de la macropinocytose et de l’endocytose médiée par des canaux. Philippine, MDC et WT menin sont respectivement des inhibiteurs de l’endocytose médiée par la clathrine, de l’endocytose dépendante de la clathrine et de la macropinocytose.

Comme indiqué sur ce graphique, l'EIPA a réduit le transport des nanocarriers anti-IAM marqués à l'iode 125 à travers les monocouches de cellules CACO-2, tandis que le MDC philippin et la Wirt Menin n'ont pas réduit les niveaux de transport par rapport à la condition témoin. Cela suggère que les nanocarriers anti-ICAM utilisent l'endocytose médiée par récepteurs chimiques pour le transport transcellulaire, mais pas la transcytose associée à la claire, à la clathrine ou à la macropinocytose.

Pour évaluer le transport paracellulaire, la résistance transepithéliale (TEER) a été mesurée pendant le transport de nanotransporteurs anti-ICAM marqués à l'iode 125 à travers des monouches de Caco-2. Deux valeurs de TEER de monouches, en l'absence de nanotransporteurs, sont indiquées comme témoins, et l'intervalle en pointillés indique l'erreur type de la moyenne (ETM). L'incubation avec du peroxyde d'hydrogène à cinq millimolaire a servi de contrôle positif pour l'ouverture des jonctions intercellulaires, comme en témoigne la diminution de la TEER jusqu'aux niveaux basaux.

En outre, les fuites protéiques paracellulaires, mesurées sous forme du coefficient de perméabilité apparent de l'albumine marquée à l'iode 125 traversant la monocouche cellulaire en l'absence ou en présence de cinq millimolaire de peroxyde d'hydrogène, de nanotransporteurs d'IgG ou de nanotransporteurs anti-ICAM, ont été mesurées et calculées. Le peroxyde d'hydrogène a nettement augmenté la fuite d'albumine marquée à l'iode 125 vers la chambre basolatérale et a servi de contrôle positif, comme illustré sur ces graphiques. L'incubation avec les nanotransporteurs anti-ICAM n'a pas modifié la fuite lacrymale ou paracellulaire de l'albumine marquée à l'iode 125 au cours d'une période de 48 heures, de façon similaire aux nanotransporteurs IgG de contrôle qui ne sont pas transportés.

Ces résultats écartent le transport paracellulaire et sont compatibles avec les résultats antérieurs suggérant que les nanocarriers anti-ICAM utilisent l'endocytose médiée par CAM pour le transport transcellulaire. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de choisir un ou plusieurs types cellulaires appropriés ainsi qu'un filtre perméable avec une taille de pore, un matériau, un diamètre, entre autres, adaptés au modèle Transwell, ainsi que des techniques de marquage permettant une quantification efficace de votre système de délivrance de médicaments après cette procédure. D'autres méthodes, telles que la microscopie à fluorescence ou la microscopie électronique en transmission, peuvent être utilisées pour déterminer la localisation des matériaux transportés et, en complément, vérifier l'état des matériaux transportés.

Le transfert Western peut être utilisé pour mesurer la dégradation des protéines. L'EISA peut être utilisée pour déterminer la capacité ciblante des transporteurs acheminés, et l'activité de la charge thérapeutique peut être mesurée à l'aide de dosages spectrophoto­métriques ou d'autres techniques appropriées.