Name: Quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire Composants des biofilms (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez une méthode de quantification simultanée des composants cellulaires et extracellulaires des biofilms par microscopie confocale. Cette approche permet d'évaluer les effets des agents antibactériens sur la structure tridimensionnelle des biofilms.

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Le financement de cette étude a été fourni par la subvention 1R15DE019566-01A1 des National Institutes of Health/NIDCR. Jim Henthorn (Laboratoire de cytométrie en flux et d’image de l’OUHSC) est reconnu pour son assistance technique en matière de microscopie confocale à balayage laser. Le Dr Fernando Esteban Florez (Département des matériaux dentaires) est remercié pour son assistance technique pendant le tournage de cette vidéo.

1. Préparation des milieux et des réactifs
<ol>
	<li>Préparer 300 ml de milieu de culture de nuit (THY ; 3 % de bouillon Todd Hewitt préparé selon les instructions du fabricant, supplémenté avec 0,3 % d'extrait de levure dans de l'eau ultrapure) et stériliser à l'autoclave. Conserver à température ambiante jusqu'à 2 mois.</li>
	<li>Préparer 1 L de gélose THY (3 % de bouillon Todd Hewitt, 0,3 % d'extrait de levure et 1,5 % d'agar dans de l'eau ultrapure), stériliser à l'autoclave, puis refroidir à 60 °C avant de verser dans les boîtes de Pétri. Conserver à 4 °C jusqu'à 3 mois.</li>
	<li>Préparer 150 ml de milieu de croissance de biofilm (TY 0,5X supplémenté avec 10 mM de saccharose ; 1,5 % de tryptone, 0,5 % d'extrait de levure et 10 mM de saccharose dans de l'eau ultrapure) et stériliser par filtration. Conserver à température ambiante jusqu'à 1 mois.</li>
	<li>Préparer 1 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 et 0,24 g de KH2PO4 dans de l'eau ultrapure) et stériliser à l'autoclave. Conserver à température ambiante plusieurs mois.</li>
	<li>Préparer 600 ml de tampon Tris HCl 10 mM supplémenté avec 10 mM de CaCl2 dans de l'eau ultrapure (tampon TC ; pH 7,2) et stériliser à l'autoclave. Conserver à température ambiante plusieurs mois.</li>
	<li>Stériliser à l'autoclave 1 L d'eau ultrapure. Conserver à température ambiante plusieurs mois.</li>
</ol>
2. Fabrication de l'échantillon
<ol>
	<li>Fabriquez des échantillons en forme de disque en composites résineux dentaires Point 4 (PF) et TPH3 (TP) dans un moule en acier inoxydable sur mesure, en deux couches. Chaque couche est polymérisée par lumière pendant 40 secondes à l’aide d’un appareil de polymérisation à LED. Les deux produits ont des compositions et des teneurs en charge légèrement différentes, produisant ainsi des topographies de surface distinctes sur lesquelles les biofilms seront cultivés.
	<ol>
		<li>Des échantillons de substrats pertinents pourraient être fabriqués en utilisant des protocoles établis provenant d'autres disciplines à la place de l'étape 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Effectuez la finition et la polissage des échantillons jusqu’à obtenir une finition de surface finale acceptable, par exemple à l’aide d’un politailleur-grindeur semi-automatique. Rincez les échantillons polis à l’eau ultrapure et séchez-les à l’air comprimé.</li>
	<li>Stérilisez les échantillons à l’aide de gaz d’oxyde d’éthylène ou d’une méthode de stérilisation alternative.</li>
</ol>
3. Croissance du biofilm
<ol>
	<li>Inoculer une colonie unique de S. mutans dans 4 ml de milieu de culture de nuit (étape 1.1). Incuber toute la nuit à 37 °C pendant 16-18 heures. La densité optique (OD600) de la culture doit être ≥0,9.
	<ol>
		<li>Il est préférable d'utiliser une colonie provenant de cultures sur boîte ayant été repiquées deux fois à partir d'un stock initial, car cela donne une croissance de biofilm plus reproductible.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparer une dilution au 1/100 en utilisant la culture de nuit (étape 1.1) dans 10 ml de milieu de croissance de biofilm (étape 1.3).</li>
	<li>Transférer des échantillons stériles de composite résineux (par exemple PF, TP) dans des plaques stériles à 12 puits.</li>
	<li>Ajouter 2,5 ml de milieu de culture dilué (étape 3.2) dans les puits destinés aux groupes traités (bain de bouche) et témoins. Ajouter 2,5 ml de milieu de croissance de biofilm stérile non inoculé dans les puits de contrôle de stérilité.</li>
	<li>Faire croître les biofilms en conditions microaérophiles. Placer les plaques sur un agitateur à 100 tr/min à l'intérieur d'un incubateur à 37 °C pendant 24 heures.</li>
	<li>Après 24 heures, aspirer aseptiquement le milieu de tous les puits, puis rincer deux fois avec du PBS stérile (étape 1.4 ; 2,5 ml/puits), en aspirant le PBS après chaque rinçage. Remplacer par 2,5 ml de milieu frais de croissance de biofilm dans chaque puits et incuber pendant 24 heures supplémentaires dans des conditions identiques à celles de l'étape précédente, pour un temps total de croissance du biofilm de 48 heures.</li>
	<li>À la place des étapes ci-dessus, des biofilms d'autres espèces pourraient être cultivés sur des substrats en suivant des protocoles établis.</li>
</ol>
4. Traitements antibactériens / bains de bouche
<ol>
	<li>Aspirez le milieu après la fin de la croissance du biofilm.</li>
	<li>Ajoutez 2,5 ml de bain de bouche Biotène PBF (BIO) ou Listerine Total Care (LTO), ou tout autre agent thérapeutique, dans les puits des groupes traités, et ajoutez 2,5 ml d'eau stérile ultrapure dans le puits du groupe témoin. Immergez les échantillons pendant 60 secondes, conformément aux instructions du fabricant, tout en agitant les plaques sur un agitateur orbital à 150 tr/min. Aspirez immédiatement le bain de bouche et l'eau ultrapure des puits.</li>
	<li>Lavez les échantillons 5 fois pendant 15 secondes par rinçage avec de l'eau stérile ultrapure sur l'agitateur orbital à 150 tr/min, en aspirant l'eau après chaque étape de lavage.</li>
	<li>À la place des étapes ci-dessus, d'autres agents antibactériens pourraient être testés en utilisant des protocoles établis.</li>
</ol>
5. Coloration
<ol>
	<li>Préparer les dilutions de colorants pour l'analyse des biofilms.
	<ol>
		<li>Préparer une solution mère de Concanavaline A conjuguée à l'Alexa Fluor 647 (AF) à 5 mg/ml dans du tampon de bicarbonate de sodium 0,1 M à pH 8,3. Conserver à -20 °C en aliquots à usage unique pendant plusieurs mois, car les cycles de congélation-décongélation sont déconseillés. À partir de cette solution mère AF, préparer une dilution à 250 μg/ml dans du tampon TC.</li>
		<li>Préparer une dilution à 10 μM à partir de la solution mère de Syto 9 à 5 mM (SY), telle que fournie par le fabricant, dans du tampon TC. Conserver le reste de la solution mère SY à -20 °C pendant plusieurs mois.</li>
		<li>Préparer une dilution 10x à partir de la solution mère de Sypro Rouge à 5 000x (SR), telle que fournie par le fabricant, dans de l'eau stérile ultrapure. Conserver le reste de la solution mère SR à -20 °C pendant plusieurs mois.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laver tous les biofilms deux fois avec du tampon TC (2,5 ml/puits) en effectuant un mouvement de rotation manuel, en laissant le deuxième lavage dans la plaque pendant 30 min à température ambiante. Aspirer.</li>
	<li>Déposer une goutte de 50 μl de colorant AF sur chaque échantillon de biofilm. Colorer pendant 30 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Laver deux fois avec du tampon TC (2,5 ml/puits), en aspirant après chaque lavage.</li>
	<li>Appliquer ensuite une goutte de 50 μl de colorant SY sur chaque échantillon de biofilm. Colorer pendant 30 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Laver deux fois avec de l'eau stérile ultrapure (2,5 ml/puits), en aspirant après chaque lavage.</li>
	<li>Enfin, déposer une goutte de 50 μl de colorant SR sur chaque échantillon de biofilm. Colorer pendant 30 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Laver trois fois avec de l'eau stérile ultrapure (2,5 ml/puits), en aspirant après chaque lavage.</li>
	<li>Transférer les échantillons dans une plaque de 6 puits, en plaçant un échantillon par puits dans 6 ml d'eau stérile ultrapure afin de faciliter la microscopie confocale.</li>
</ol>
6. Imagerie par microscopie à balayage laser confocal
<ol>
	<li>Acquérir des images de chaque composant (coloration) au sein des biofilms des groupes traité et témoin à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal avec les paramètres indiqués dans le Tableau 1. Une lentille à immersion 63X avec une ouverture numérique de 0,9 et une distance de travail de 2,2 mm a été utilisée dans cette étude. 
	<img alt="Tableau de coloration des biofilms ; longueurs d'onde des lasers (nm) et bandes d'émission (nm) pour les EPS, les acides nucléiques, les protéines." fo:content-width="4.75in" src="/files/ftp_upload/50639/50639table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tableau 1"> 
	Tableau 1. Paramètres du microscope à balayage laser confocal.</li>
</ol>

<ol start="2">
	<li>Régler la taille de balayage à 250 μm x 250 μm et une résolution minimale de 512 x 512 pixels pour acquérir des images de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) avec une résolution suffisante pour une analyse quantitative.</li>
	<li>Utiliser la coloration SY pour définir les points supérieur et inférieur de la pile d'images du biofilm, puis régler le pas en z de manière adéquate pour l'analyse quantitative (0,6 μm pour cette étude). Avant de procéder au balayage, optimiser les paramètres d'image et de coloration (i.e. tension et décalage du PMT) à l'aide de l'option QLUT. Une table de correspondance de couleurs a été utilisée pour attribuer des fausses couleurs à chaque colorant (vert pour SY, rouge pour SR et bleu pour AF), afin de mieux distinguer chaque composant du biofilm dans la reconstruction 3D.</li>
	<li>Acquérir les images CLSM à 400 Hz en utilisant un balayage séquentiel en mode « entre les piles » pour optimiser la capture d'images de plusieurs colorants au sein du même biofilm.</li>
</ol>
7. Analyse structurale des biofilms
<ol>
	<li>Analyser les images de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) recueillies à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images pour les biofilms. Les étapes suivantes décrivent l’utilisation du logiciel ISA3D12 pour calculer les paramètres structuraux des images de biofilm recueillies.
	<ol>
		<li>Copier les fichiers d’images CLSM de chaque biofilm dans le dossier Images, comme indiqué dans le manuel du logiciel. Veiller à respecter la convention de dénomination des fichiers CLSM exigée par le logiciel. Le logiciel permet d’analyser les fichiers situés dans des sous-dossiers en mode par lots, ce qui facilite l’analyse des biofilms des groupes traités et témoins lors d’une même exécution.</li>
		<li>Saisir les dimensions des images CLSM selon les axes x, y et z dans les champs dxy et dz de la boîte de dialogue principale. Sélectionner les paramètres de seuil et de cartographie des distances, comme décrit dans le manuel du logiciel (Otsu et quasi-euclidienne ont été utilisés respectivement dans cette étude). Indiquer un nom approprié pour le fichier de résultats, puis exécuter le programme. Un fichier de résultats sera généré dans le dossier ISA.</li>
		<li>Consulter le fichier de résultats afin d’obtenir les valeurs de vingt paramètres structuraux en 3D12, tels que le biovolume et l’épaisseur moyenne du biofilm (mesurés dans cette étude), qui quantifient la répartition tridimensionnelle de chaque composant (colorant) au sein du biofilm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Visualisation de la structure du biofilm
<ol>
	<li>Créer une reconstruction des composants superposés (colorations) au sein de chaque biofilm à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image. Les étapes suivantes décrivent l'utilisation du logiciel Volocity pour créer des reconstructions 3D.
	<ol>
		<li>Créer une bibliothèque pour chaque biofilm en copiant les fichiers d'images CLSM dans le logiciel, comme décrit dans le manuel.</li>
		<li>Utiliser l'option de menu 3D Renderer pour produire une image 3D reconstruite à partir des images CLSM de chaque biofilm (le format HR Opacity a été utilisé dans cette étude).</li>
		<li>Faire pivoter l'image 3D afin d'orienter tous les biofilms de manière similaire par rapport aux axes de coordonnées x, y et z. Capturer une image figée de la reconstruction du biofilm correctement orientée, puis exporter cette image au format TIFF, JPEG ou tout autre format approprié.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Effectuer une analyse visuelle de la distribution simultanée des composants EPS, des protéines et des acides nucléiques au sein des biofilms sur les images reconstruites.</li>
	<li>Utiliser le coefficient de corrélation de Pearson et le coefficient de recouvrement de Manders pour réaliser une analyse de colocalisation de plusieurs composants du biofilm (la colocalisation n'a pas été mesurée dans cette étude).</li>
</ol>
9. Analyse statistique
<ol>
	<li>Utiliser des analyses statistiques séparées basées sur des modèles mixtes afin de comparer les valeurs moyennes des paramètres structurels entre les groupes utilisant le bain de bouche et les groupes témoins (α = 0,05). Pour cette étude, le logiciel SAS a été utilisé pour effectuer l'analyse statistique.</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+assessments+to+determine+the+effects+of+sugars+and+antimicrobials+on+a+polymicrobial+oral+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytical+tool-box+for+comprehensive+biochemical%2C+structural+and+transcriptome+evaluation+of+oral+biofilms+mediated+by+mutans+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of confocal microscopy.</a> Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).</li>
<li>Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fluorochromes+for+two-photon+laser+scanning+microscopy+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).</li>
<li>Wood, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+intact+natural+human+plaque+biofilms+studied+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dental+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).</li>
<li>Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+extracellular+polymeric+substances+and+cells+in+bioaggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).</li>
<li>Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biofilm+structure+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biofilm structure quantification.</a> J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents. La production et l’accès gratuit à cet article sont sponsorisés par Leica Microsystems.

L’acquisition d’images CLSM doit être effectuée de la manière et dans le format nécessaires à la quantification des biofilms et à l’analyse de colocalisation, de sorte que la distribution de l’intensité du signal dans chaque image soit une représentation fiable de la distribution de chaque fluorochrome dans l’empilement de biofilms. L’intensité du signal doit pouvoir être distinguée du bruit et du bruit de fond10,11, ne pas être affectée par l’autofluorescence du substrat et présenter un débordement minimal en raison des interférences spectrales entre les fluorochromes utilisés11. Le bruit est une limitation inévitable de la microscopie à fluorescence11, et la qualité de l’image peut parfois être limitée pour des raisons techniques ou logistiques. L’identification des fluorochromes avec un chevauchement spectral minimal est essentielle au succès de cette méthode, mais peut être compliquée. De plus, la quantification de plusieurs fluorochromes pose un problème multifactoriel. Par conséquent, il n’est pas surprenant que très peu d’études aient réussi à quantifier la distribution simultanée de plus de deux composants dans les structures des biofilms.
L’objectif de cette étude était de présenter une méthodologie composée d’étapes distinctes mais interconnectées pour la quantification et la comparaison des distributions tridimensionnelles concurrentes de trois composants cellulaires et extracellulaires dans les biofilms. L’essai de croissance du biofilm décrit permet la croissance du biofilm sur des substrats pertinents et produit des structures de biofilm reproductibles, comme le démontrent les résultats rapportés dans le tableau 1. La combinaison d’une nouvelle coloration simultanée de l’EPS, des protéines et des composants d’acides nucléiques avec la mesure des paramètres structurels des biofilms 3D permet d’obtenir des distributions quantifiables des composants dans les biofilms. L’analyse visuelle qualitative de la distribution simultanée de l’EPS, des protéines et des acides nucléiques dans les biofilms est possible grâce à la reconstruction des colorants superposés dans chaque biofilm. Le logiciel ISA3D12 contient plusieurs paramètres structurels uniques tels que la dimension fractale, l’homogénéité et le coefficient de rugosité du biofilm, en plus des paramètres traditionnellement mesurés tels que la porosité et l’épaisseur du biofilm pour améliorer la quantification des structures 3D des biofilms. L’analyse statistique des paramètres structurels du biofilm permet des comparaisons pertinentes des biofilms dans des conditions expérimentales spécifiques telles que l’efficacité antibactérienne/antisalissure (par exemple après un traitement avec des bains de bouche) ou dans le temps (effets temporels).
Cette méthodologie a permis de quantifier et de comparer efficacement et avec succès les distributions 3D simultanées de trois composants majeurs dans les biofilms de S. mutans qui ont été cultivés sur des substrats pertinents, surmontant ainsi deux défis à l’évaluation simultanée des composants du biofilm. Cette méthode peut également être utilisée pour déterminer l’efficacité des traitements antibactériens ou des mesures antisalissure contre plusieurs composants du biofilm, comme le montre l’utilisation de bains de bouche dans cette étude. De plus, la majorité des protocoles décrits ci-dessus peuvent être remplacés par des protocoles pour la fabrication de substrats pertinents et des essais de croissance de biofilm de micro-organismes pertinents. Par conséquent, cette méthode a une large application car elle facilite la comparaison des structures/architectures 3D des biofilms in vitro et in vivo dans une variété de disciplines, notamment les sciences médicales, dentaires, géologiques et marines.

Les biofilms sont des communautés microbiennes structurées qui sont encapsulées dans une matrice extracellulaire autoproduite, et sont attachées à des surfaces biologiques ou inertes1. Les biofilms représentent un mode de vie commun à de nombreuses bactéries et se forment en passant par étapes de cellules flottantes (planctoniques) à des communautés multi-espèces complexes. La résistance inhérente des biofilms aux agents antimicrobiens est à l’origine de nombreuses infections bactériennes persistantes et chroniques1,2, comme le démontrent les biofilms buccaux (plaque dentaire). Les micro-organismes cariogènes tels que les mutans, les streptocoques, traitent le saccharose et d’autres glucides pour produire une matrice extracellulaire et générer des acides qui peuvent déminéraliser la structure des dents et provoquer des caries dentaires. La plupart des matrices de biofilm sont des biopolymères constitués de composants cellulaires et extracellulaires tels que des exopolysaccharides (EPS), des protéines et des acides nucléiques3,4.
La microscopie confocale à balayage laser (CLSM), la technique la plus largement utilisée pour l’imagerie de fluorescence, a radicalement transformé l’imagerie optique en biologie car elle a la capacité de collecter des images 3D de structures biologiques hydratées sans fixation5,6,7. Cette technique non destructive consiste à collecter des images de lames minces dans une région d’intérêt sur l’échantillon de manière à ce que la contribution de la lumière floue soit supprimée. La qualité et la résolution des images capturées par CLSM sont au-delà de ce qui est réalisable avec la microscopie à fluorescence à grand champ. L’un des principaux inconvénients de la CLSM est que le balayage des images se produit à un rythme plus lent qu’avec les techniques de microscopie à grand champ, dans lesquelles des images entières sont collectées simultanément5. Cependant, avec une sélection croissante de fluorochromes, de lasers et de filtres, la CLSM est devenue l’une des techniques dominantes pour l’imagerie multispectrale5,7.
Des études antérieures ont montré que la CLSM est un outil utile pour examiner la structure ou l’architecture des biofilms en utilisant une ou deux étiquettes fluorescentes ou des colorants pour mieux comprendre la distribution de l’EPS et des cellules dans les biofilms, et en particulier dans la matrice extracellulaire7,8. En théorie, la coloration fluorescente / le marquage de plusieurs composants est souhaitable pour explorer la structure détaillée et la colocalisation des composants cellulaires et extracellulaires dans les biofilms. Cependant, l’analyse simultanée de divers composants dans les biofilms peut s’avérer difficile pour les raisons suivantes : 1) la sélection de colorants fluorescents ayant un chevauchement spectral minimal est compliquée, et 2) la quantification de plusieurs fluorochromes pose un problème multifactoriel. La colocalisation à l’aide de plusieurs fluorochromes nécessite l’utilisation de colorants très spécifiques avec une interférence spectrale minimale pour éviter tout effet de fuite, ce qui se produit lorsque deux fluorochromes ont un chevauchement significatif dans leur pic spectral, ce qui fait que l’un est plus fortement excité que l’autre9. Idéalement, les fluorochromes ayant des spectres d’excitation qui ne se chevauchent pas donneraient les meilleurs résultats, mais il est très difficile de trouver des colorants qui répondent à ce critère. Au lieu de cela, la sélection des colorants est optimisée en choisissant des fluorochromes dont les spectres d’émission se chevauchent minimalement, ce qui permet de visualiser les colorants un par un dans une bande d’onde d’observation limitée9.
La superposition d’images de fluorescence est probablement la méthode la plus largement utilisée pour évaluer la distribution simultanée des fluorochromes. La colocalisation des différents composants se manifeste par un chevauchement de différentes couleurs à travers de multiples canaux créés par les fluorochromes examinés10. Les outils permettant d’afficher des images de fluorescence multicanaux sous forme d’images couleur fusionnées sont disponibles dans la plupart des logiciels CLSM et des logiciels d’analyse d’images biologiques. Bien que la superposition d’images soit utile pour l’évaluation spatiale de la colocalisation, les images ne peuvent être examinées qualitativement que par une analyse visuelle. Cela fournit une quantité limitée d’informations, car ces représentations ne sont généralement pas utiles pour quantifier la colocalisation dans différentes conditions expérimentales et ne déterminent pas non plus si la colocalisation dépasse la coïncidencealéatoire 11. Jusqu’à présent, très peu d’études ont utilisé des méthodes quantitatives pour analyser la structure tridimensionnelle des biofilms et des composants de biofilms, et encore moins ont quantifié l’effet des traitements antibactériens ou des mesures antisalissure sur les composants du biofilm.
L’objectif de cette étude était de présenter une méthodologie de quantification et de comparaison des distributions tridimensionnelles concurrentes de trois composants cellulaires et extracellulaires de biofilms. La méthode comprend des étapes distinctes mais interconnectées impliquant la croissance du biofilm, la coloration, l’imagerie CLSM des biofilms, l’analyse structurelle et la visualisation du biofilm, et l’analyse statistique des paramètres structurels. Le test de croissance du biofilm permet la croissance du biofilm sur des substrats pertinents et produit des structures de biofilm reproductibles. La combinaison d’une nouvelle coloration simultanée de l’EPS, des protéines et des composants d’acides nucléiques avec la mesure des paramètres structurels des biofilms 3D permet d’obtenir des distributions quantifiables des composants dans les biofilms. L’analyse statistique des paramètres structurels du biofilm facilite l’évaluation des biofilms dans des conditions expérimentales spécifiques (par exemple après un traitement avec des bains de bouche), comme nous le verrons dans la section suivante.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Todd Hewitt Broth</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>249240</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure, EMD granulé</td><td>Millipore</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur Saccharose</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium, réactif ACS, 99,0-100,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium, monobasique, &ge ; 99.0 %, Réactif ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium, monobasique, monohydraté</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane, 99.8+ %, réactif ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647</td><td>Conjugue Invitrogen</td><td>C21421</td><td></td></tr><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Sypro Red</td><td>Invitrogen</td><td>S12012 ou S6653</td><td></td></tr><tr><td>Biot&egrave ; Rince-bouche PBF</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Listerine Total Care</td><td>McNeil-PPC, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire composants des biofilms

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) est un outil puissant pour l’étude des biofilms. Très peu d’études ont réussi à quantifier la distribution simultanée de plus de deux composants dans les biofilms parce que : 1) la sélection de colorants fluorescents ayant un chevauchement spectral minimal est compliquée, et 2) la quantification de plusieurs fluorochromes pose un problème multifactoriel. Objectifs: Présenter une méthodologie pour quantifier et comparer les distributions tridimensionnelles simultanées de trois composants cellulaires/extracellulaires de biofilms cultivés sur des substrats pertinents. méthode: La méthode comprend des étapes distinctes et interconnectées impliquant la croissance du biofilm, la coloration, l’imagerie CLSM, l’analyse structurelle et la visualisation du biofilm, et l’analyse statistique des paramètres structurels. Des biofilms de Streptococcus mutans (souche UA159) ont été cultivés pendant 48 heures sur des échantillons stériles de composites de résine Point 4 et TPH3. Les échantillons ont ensuite été immergés pendant 60 secondes dans des bains de bouche Biotène PBF (BIO) ou Listerine Total Care (LTO), ou dans de l’eau (groupe témoin ; n = 5/groupe). Des biofilms ont été colorés avec des fluorochromes pour des substances polymères extracellulaires, des protéines et des acides nucléiques avant d’être imagés avec CLSM. Les paramètres structurels du biofilm calculés à l’aide du logiciel d’analyse d’images ISA3D étaient le biovolume et l’épaisseur moyenne du biofilm. Des analyses statistiques de modèles mixtes ont comparé les paramètres structurels entre les groupes de rince-bouche et de contrôle (logiciel SAS ; α=0,05). Le logiciel Volocity a permis de visualiser les distributions 3D des composants de biofilm superposés (fluorochromes). résultats: Le rince-bouche BIO a produit des structures de biofilm qui différaient considérablement de celles du témoin (p<0,05) sur les deux composites de résine, tandis que le LTO n’a produit aucune différence (p>0,05) sur l’un ou l’autre produit. Conclusions: Cette méthodologie a permis de quantifier et de comparer efficacement et avec succès les distributions 3D simultanées de trois composants majeurs dans les biofilms de S. mutans sur des substrats pertinents, surmontant ainsi deux défis liés à l’évaluation simultanée des composants du biofilm. Cette méthode peut également être utilisée pour déterminer l’efficacité des agents antibactériens/antisalissures contre plusieurs composants du biofilm, comme le montrent les bains de bouche. De plus, cette méthode a une large application car elle facilite la comparaison des structures/architectures 3D des biofilms dans une variété de disciplines.

Les résultats représentatifs des traitements (bains de bouche) et du groupe témoin non traité sont présentés dans le Tableau 2 ainsi que dans les Figures 1 et 2. Le Tableau 2 indique les valeurs moyennes et les écarts-types des paramètres structuraux du biofilm, à savoir le volume biologique (μm3) et l'épaisseur moyenne du biofilm (μm), calculés à l'aide du logiciel ISA3D. Les paramètres structuraux des biofilms traités avec un bain de bouche qui diffèrent significativement de ceux du groupe témoin (p&lt;0,05) ont leurs valeurs moyennes et écarts-types mis en évidence en rouge. Les résultats des analyses statistiques par modèles mixtes ont montré que le bain de bouche BIO produisait des structures de biofilm significativement différentes du témoin (p&lt;0,05) sur les deux composites résineux, tandis que le bain de bouche LTO n'entraînait pas de différences significatives (p&gt;0,05) sur l'un ou l'autre des composites résineux. Les résultats montrent clairement que les composants cellulaires et extracellulaires du biofilm restants après les deux traitements par bain de bouche étaient différents. Il convient également de noter que les biofilms de S. mutans cultivés sur les deux substrats (PF et TP) présentaient des structures tridimensionnelles différentes, bien qu'ils aient été cultivés dans des conditions similaires et que les deux substrats aient été polis avec des abrasifs comparables.
La distribution simultanée des EPS, des protéines et des acides nucléiques au sein des biofilms peut être visualisée grâce aux reconstructions 3D générées à l'aide du logiciel Volocity. Figures 1 et 2 montrent des reconstructions représentatives de biofilms du groupe témoin cultivés respectivement sur des composites résineux PF et TP. La coloration bleue représente les EPS dans les biofilms de S. mutans, la coloration verte indique les acides nucléiques, et la coloration rouge met en évidence les protéines. L'espace intermédiaire peut être occupé par de l'eau ou d'autres composants du biofilm non marqués par fluorescence.
<img alt="nuage de points 3D, visualisation dynamique des données, graphique, outil interactif de recherche, affichage analytique" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Une reconstruction 3D représentative d'un biofilm de S. mutans développé sur un composite résineux PF dans le groupe témoin (non traité avec un bain de bouche). La superposition simultanée des trois colorations au sein d'un même biofilm permet la visualisation conjointe des composants d'EPS (coloration bleue), d'acides nucléiques (coloration verte) et de protéines (coloration rouge) dans les biofilms de S. mutans. (1 unité = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig1large.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour voir la figure en taille agrandie</a>.
<img alt="Visualisation de structure cellulaire 3D, microscopie de fluorescence, analyse de données spatiales, graphique scientifique." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Une reconstruction 3D représentative d'un biofilm de S. mutans développé sur un composite résineux TP dans le groupe témoin (non traité avec un bain de bouche). La superposition simultanée des trois colorations au sein d'un même biofilm permet la visualisation conjointe des composants EPS (coloration bleue), acides nucléiques (coloration verte) et protéines (coloration rouge) présents dans les biofilms de S. mutans. (1 unité = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig2large.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour voir la figure en taille agrandie</a>.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Composite résineux</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Point 4</td>
			<td colspan="2">TPH3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bain de bouche</td>
			<td>Composant</td>
			<td>VB (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
			<td>VB (μm3)</td>
			<td>MT (μm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotène PBF</td>
			<td>Acides nucléiques</td>
			<td>279,517±53,291</td>
			<td>9,32±2,80</td>
			<td>195,033±42,014</td>
			<td>7,45±3,70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>344,902±56,386</td>
			<td>35,22±17,19</td>
			<td>197,840±62,351</td>
			<td>9,83±7,26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protéines</td>
			<td>298,796±62,868</td>
			<td>54,21±21,65</td>
			<td>216,033±66,654</td>
			<td>24,33±39,64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listerine Total Care</td>
			<td>Acides nucléiques</td>
			<td>355,707±110,444</td>
			<td>26,45±14,21</td>
			<td>273,296±47,323</td>
			<td>13,43±2,89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>494,099±180,592</td>
			<td>64,90±26,68</td>
			<td>329,150±47,145</td>
			<td>34,35±30,32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protéines</td>
			<td>348,416±161,316</td>
			<td>58,68±47,28</td>
			<td>303,150±54,705</td>
			<td>34,18±41,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Témoin (non traité)</td>
			<td>Acides nucléiques</td>
			<td>388,375±42,152</td>
			<td>51,15±40,66</td>
			<td>327,809±39,400</td>
			<td>17,08±1,65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EPS</td>
			<td>660,448±173,197</td>
			<td>91,37±74,84</td>
			<td>363,850±67,612</td>
			<td>28,33±15,07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protéines</td>
			<td>517,274±119,475</td>
			<td>127,96±73,84</td>
			<td>353,161±56,518</td>
			<td>21,17±4,41</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2. Valeurs moyennes et écarts types du biovolume (BV) et de l'épaisseur moyenne du biofilm (MT) des biofilms traités avec BIO ou LTO, ou non traités (groupe témoin). Les paramètres structuraux des biofilms traités avec des bains de bouche qui différaient significativement de ceux des biofilms du groupe témoin (p&lt;0,05) ont des valeurs moyennes et des écarts types mis en évidence en rouge.

Un protocole pour la quantification et la comparaison simultanées de trois composants cellulaires et extracellulaires dans des biofilms est présenté. La méthodologie implique l’utilisation d’une microscopie confocale à balayage laser, d’un logiciel d’analyse structurelle et de visualisation de biofilm et d’un logiciel d’analyse statistique.

Quantification simultanée de cellulaire et extracellulaire Composants des biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

L’objectif global de cette procédure est de quantifier et de comparer les distributions tridimensionnelles simultanées de trois composants du biofilm cellulaire et extracellulaire après un traitement avec des agents antibactériens. Ceci est accompli en fabriquant d’abord puis en polissant des échantillons composites en résine. Dans un deuxième temps, les biofilms d’intérêt sont cultivés sur les échantillons, puis traités avec des agents antibactériens.Ensuite, les biofilms sont colorés avec des fluorochromes pour les substances polymères extracellulaires, les acides nucléiques et les protéines, puis imagés par microscopie confocale à balayage laser. Dans la dernière étape, des images tridimensionnelles des fluorochromes superposés sont reconstruites pour faciliter la visualisation simultanée des composants du biofilm et les paramètres structurels sont calculés à partir des images du biofilm. En fin de compte, une analyse statistique des paramètres structurels du biofilm tels que le volume biologique et l’épaisseur moyenne du biofilm peut être effectuée pour comparer les différences entre le groupe de traitement et le groupe témoin.Le principal avantage de cette procédure par rapport aux méthodes existantes est qu’elle utilise des techniques distinctes mais interconnectées pour caractériser la distribution de plusieurs composants dans la structure de biofilms cultivés dans des conditions spécifiques, démontrant la procédure par le Dr Fernando Flores, chercheur postdoctoral, et Mme Kristen Smart, assistante de recherche de mon laboratoire. Pour créer les échantillons, commencez par placer un incrément de 0,4 ou de trois composites de résine dentaire TPH dans un Fabrication de moules en acier inoxydable. Ensuite, polymérisez le premier incrément avec une unité de photopolymérisation LED pendant 40 secondes. Après avoir répété la procédure pour le deuxième incrément, utilisez une meuleuse et une polisseuse semi-automatisées pour polir les échantillons durcis jusqu’à obtenir une finition de surface finale acceptable.Enfin, stérilisez les échantillons pour faire pousser le biofilm. Tout d’abord, inoculez une seule colonie de S mutans dans quatre millilitres de milieu de culture pendant la nuit, puis incubez la culture à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures pour obtenir une densité optique d’au moins 0,9. Ensuite, diluez la culture dans un rapport de 1 à 100 dans 10 millilitres de croissance de biofilm.Le milieu transfère aseptiquement les échantillons composites de résine stérile dans des plaques stériles à 12 puits, puis ajoute 2,5 millilitres de culture diluée dans chacun des puits. Pour le traitement par rince-bouche et les groupes témoins, ajoutez 2,5 millilitres de biofilm de croissance stérile non inoculé, milieu aux puits de contrôle de stérilité, puis faites pousser les biofilms à 37 degrés Celsius dans des conditions micro-paraphiliques sur un agitateur à 100 tr/min. Après 24 heures, aspirez aseptiquement le milieu de tous les puits et lavez chaque puits deux fois avec 2,5 millilitres de PBS stérile en aspirant la solution saline après chaque lavage, puis remplissez chaque puits avec 2,5 millilitres de milieu de croissance de biofilm frais et incubez la plaque pendant 24 heures supplémentaires, comme cela vient d’être démontré pour une croissance totale du biofilm. Durée de 48 heures après la fin de la croissance du biofilm, Aspirez le milieu de culture, puis versez 2,5 millilitres de rince-bouche dans chaque puits de groupe de traitement et 2,5 millilitres d’eau ultrapure stérile dans le groupe témoin.Bien agiter les plaques sur un agitateur orbital à 150 tr/min, puis après 60 secondes, aspirer à la fois le rince-bouche et l’eau ultrapure des puits pour colorer le composant exo polysaccharide des biofilms. Incuber chaque biofilm avec 50 microlitres de conjugué LOR pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez les échantillons deux fois avec 2,5 millilitres de tampon TC en aspirant après chaque lavage et colorez les acides nucléiques dans chaque biofilm avec une goutte de 50 microlitres de cyto nine pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière.Après avoir lavé les échantillons deux fois, colorez les composants protéiques de chaque biofilm avec 50 microlitres de rouge Cipro pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Après avoir lavé les échantillons trois fois, transférez-les dans des puits individuels d’une plaque de six puits contenant six millilitres d’eau ultrapure stérile par puits pour faciliter leur visualisation par microscopie confocale afin d’acquérir des images de chacune des taches des composants dans les biofilms des groupes de traitement et de contrôle. Réglez les lasers d’un microscope confocal à balayage laser sur les paramètres suivants pour la détection des exopolysaccharides par coloration conjuguée Exor, utilisez un laser de 633 nanomètres et une bande d’émission de 659 à 749 nanomètres pour la détection des acides nucléiques par coloration cyto nine.Utilisez un laser de 488 nanomètres et une bande d’émission de 495 à 500 nanomètres, et pour la détection des protéines par coloration rouge Cipro, utilisez un laser de 543 nanomètres et une bande d’émission de 615 à 651 nanomètres. Ensuite, à l’aide d’un objectif plongeur 63x avec une ouverture numérique de 0,9 et une distance de travail de 2,2 millimètres. Collectez des images de microscopie confocale à balayage laser à 400 hertz à l’aide d’un balayage séquentiel en mode entre les piles pour optimiser la capture d’images de plusieurs colorants au sein d’un même biofilm.Après avoir analysé les images de microscopie confocale à balayage laser, utilisez l’option de menu Moteur de rendu 3D du logiciel d’analyse d’images de vitesse pour créer une image 3D reconstruite des colorations des composants superposés dans chaque biofilm. Ensuite, faites pivoter l’image 3D pour obtenir une vue optimale du biofilm. Capturez ensuite un instantané de la reconstruction du biofilm et exportez-le dans un format de fichier image approprié.Enfin, effectuez une analyse visuelle de la distribution simultanée des composants de l’acide nucléique et des protéines exopolysaccharidiques dans les biofilms. Dans les images reconstruites, calculez les paramètres structurels du biofilm tels que le volume biologique et l’épaisseur moyenne du biofilm à l’aide du logiciel ISA 3D. Dans ce tableau, les valeurs moyennes et d’écart-type des paramètres structurels du biofilm calculées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique sont affichées. Les valeurs moyennes et d’écart-type des paramètres structurels des biofilms traités au bain de bouche qui différaient significativement de celles des biofilms du groupe témoin sont mises en évidence dans les modèles mixtes rouges.Les analyses statistiques ont démontré que le rince-bouche PBF Biotène produisait des structures de biofilm significativement différentes de celles du groupe témoin sur les deux composites de résine, tandis que le rince-bouche Listerine total care n’a pas produit de différences significatives sur l’un ou l’autre des composites de résine, indiquant clairement des différences dans les composants du biofilm cellulaire et extracellulaire restant après les deux traitements de rince-bouche. La distribution simultanée des exopolysaccharides, des acides nucléiques et des protéines dans les biofilms peut être visualisée via des reconstructions 3D générées à l’aide d’un logiciel de vitesse. Dans cette figure, une reconstruction représentative des biofilms du groupe témoin cultivés sur 0,4 montre que la couleur bleue a été attribuée à l’exo polysaccharide.Dans les biofilms de S mutans, la couleur verte a été attribuée aux acides nucléiques et la couleur rouge aux protéines. L’espace intermédiaire peut être occupé par de l’eau ou d’autres composants du biofilm qui n’ont pas été marqués par fluorescence. Dans cette figure, une reconstruction représentative des biofilms du groupe témoin cultivés sur trois composites de résine TPH avec les couleurs représentant les mêmes composants que la figure précédente est montrée.Cette procédure a été appliquée dans diverses disciplines telles que la médecine, les sciences dentaires, la géologie et les sciences marines. Étant donné que de nombreux substrats et biofilms peuvent être substitués à ceux utilisés ici.

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