Name: Haute Résolution Mont entier In Situ Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier lexpression des gènes et la fonction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Découvrez l'hybridation in situ sur embryons entiers de zebrafish pour analyser l'expression génique spatiale et temporelle. Cette méthode améliorée détecte les transcrits peu abondants tout en réduisant le bruit de fond non spécifique.

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<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons mis au point des méthodes améliorées pour visualiser l&#39;ARN avec une haute résolution. Le dans les procédures d&#39;hybridation in situ sont réalisées en utilisant des paniers sur mesure simples à fond poreux (figure 1). Les embryons sont traités à l&#39;aide des solutions sans RNase dans des plaques 6 puits à température ambiante dans des conditions stériles. De séparer les embryons paniers sont fabriqués à partir de différents tubes Eppendor...

Le poisson-zèbre (Danio rerio) a émergé comme un modèle animal puissant pour l&#39;étude du développement des vertébrés, la maladie, le comportement et le dépistage dans la drogue 1-3. Embryons de poissons zèbres peuvent être obtenues dans un grand nombre d&#39;un seul passage. Fertilisation et le développement survient ex utero et les embryons optiquement transparents se développent rapidement. Événements critiques du développement se produisent pendant les 48 premières heures après la fécondation (HPF). Cela comprend l&#39;apparition de l&#39;organe ébauches et l&#39;ouverture d&#39;cytodifférenciation. Démontables ou la sur-expression de protéines peuvent être atteints grâce à la micro-injection d&#39;embryons avec antisens morpholino (MO) des oligonucléotides ou d&#39;ARNm respectivement à l&#39;étape une ou deux cellules (0,75 HPF). Le souhait des embryons de poisson zèbre facilite l&#39;étude de l&#39;expression spatio-temporelle des gènes d&#39;intérêt spécifiques. Application de la technique de micro-injection WISH suite d&#39;embryons avec l&#39;ARNm ou de MO à plus-express ou les niveaux de protéines spécifiques knockdown révèle régulation différentielle d&#39;autres gènes. Changements dans les modes d&#39;expression des gènes peuvent être corrélées avec des changements phénotypiques et révèlent la fonction des gènes cibles au cours de l&#39;organogenèse tôt. Depuis sondes peuvent être préparés et stockés à l&#39;avance, la technique ISH peut être appliqué à révéler des modèles d&#39;expression génique pendant au moins 20 gènes à la fois en utilisant des plaques de six puits et des paniers sur mesure.

<table><tbody><tr><td>Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ Mini Plasmid Purification</td> Kit <td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 et HindIII Restriction Enzymes</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Phénol saturé</td>, <td>Invitrogen</td> ultra-pur <td>15513039</td><td>Conserver à 4 °C. Irritant et cancérogène suspecté pour les yeux, la peau et les voies respiratoires. Des précautions doivent être prises lors de la manipulation.</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>Toxique et cancérogène présumé. Travailler sous hotte.</td></tr><tr><td>DNAse sans RNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Préparez de petites aliquotes et stockez-les à -20°C.</td></tr><tr><td>Mélange de marquage DIG-RNA avec ARN polymérase Sp6, T7 et T3</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur de RNase</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3,0 M Acétate de sodium (pH 5,5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol</td><td>Alcools</td><td></td><td></td>commerciaux</tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>Le DEPC est un irritant pour les yeux, la peau et les voies respiratoires. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Utilisez des lunettes de sécurité, des gants et un masque.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 m (pH 8,0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Systèmes d’aquarium</td><td>instantanés au sel de mer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Préparer et conserver à -20&deg ; C sous forme d’aliquotes de 40 ml pour une utilisation ultérieure. Le PFA est toxique. Utilisez des lunettes de sécurité, des gants et un masque anti-poussière.</td></tr><tr><td>Phénylthiocarbomide (PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC est très toxique. Utilisez des lunettes de sécurité, des gants et un masque anti-poussière.</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (horloger' s) Pince modèle n° 5</td> Outils <td></td><td></td><td>de sciences fines</td></tr><tr><td>Grappe de culture cellulaire à six puits</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Les paniers sont faits de maille de nylon et de tubes Eppendorf</td><td>Préparation</td><td></td> interne <td>Pour fabriquer les paniers, coupez des tubes Eppendorf (1,5 ml) avec ou sans rebords pour retirer l’extrémité conique. Coupez la maille de nylon en petits morceaux correspondant à la taille de&nbsp ; les extrémités coupées des tubes d’Eppendorf. Placez les tubes avec la maille en nylon recouvrant l’extrémité coupée sur un Chauffer la plaque jusqu’à ce que le tube et le maillage en nylon collent ensemble (effectuer dans la hotte). Coupez l’excédent de maille des paniers et stockez-les dans du méthanol à 100 % jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.</td></tr><tr><td>Polyoxyéthylènesorbitan Monolaurate (Tween 20)</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride acétique</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Triéthanolamine</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, grade de haute pureté</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 Résine</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique monohydraté</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>Héparine Sel sodique</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de citrate salin-sodique (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levure de boulanger type X</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de lévamisole</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide anhydre (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>Irritant, toxique, combustible et tératogène suspecté. Manipulez avec un vêtement de sécurité approprié, y compris des gants et des lunettes de protection.</td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>Protégez cette solution de la lumière.</td></tr><tr><td>Nitroblue tétrazolium (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>Protégez cette solution de la lumière.</td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin, fraction V purifiée (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Mouton Anti-digoxigénine-AP Fab Fragments</td><td>Roche</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à 96 puits</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mnx1 :GFP)ml2/Tg(hb9 :GFP)ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg(mnx1 :GFP)ml2</td><td></td></tr><tr><td>Systèmes d’aquarium</td> <td>Instant Ocean</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

haute résolution mont entier<em&gt; in situ</em&gt; hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Cet article se concentre sur l&#39;ensemble du montage hybridation in situ (WISH) des embryons de poisson zèbre. La technologie WISH facilite l&#39;évaluation d&#39;expression de gènes à la fois en termes de distribution des tissus et le stade de développement. Les protocoles sont décrits pour l&#39;utilisation des embryons de poisson zèbre WISH de l&#39;aide d&#39;ARN antisens sondes marquées à la digoxigénine. Les sondes sont générés par l&#39;incorporation des nucléotides digoxigénine liés par transcription in vitro des modèles de gènes qui ont été clonés et linéarisé. Les chorions d&#39;embryons récoltés à des stades de développement définis sont retirés avant l&#39;incubation avec des sondes spécifiques. Selon un procédé de lavage pour éliminer la sonde en excès, les embryons sont mis à incuber avec un anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcaline. En utilisant un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, l&#39;expression du gène spécifique peut être évaluée. En fonction du niveau de l&#39;expression génique de toute la procédure peut être complété dans les 2-3 jours.

En utilisant le protocole avec 50 embryons par panier (par gène / par condition expérimentale) le profil d&#39;expression de ce gène peut être obtenue dans une expérience. Presque tous les embryons présentent des profils d&#39;expression similaires pour un gène particulier. Des exemples représentatifs de la coloration dans d&#39;hybridation in situ sont présentés aux figures 3-6. Tant le sens et anti-sens ribosondes ont été synthétisés à partir des ADNc cor...

Le poisson zèbre, un petit poisson tropical, est devenu un modèle populaire pour étudier la fonction des gènes au cours du développement des vertébrés et de la maladie. L&#39;expression spatiale et temporelle des gènes cibles peut être déterminée par<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation. Notre protocole amélioré permet la détection de faibles relevés de notes abondantes avec signal de fond non spécifique faible.

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer l’expression spatio-temporelle de gènes d’intérêt spécifiques dans des embryons de poisson-zèbre à un stade avancé. Ceci est accompli en générant d’abord des sondes CD NA en incorporant de l’oxygène digo dans des nucléotides liés à l’aide de la transcription in vitro. Ensuite, les embryons sont récoltés à des stades de développement définis.Le corium est retiré et les embryons sont stockés dans du méthanol à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, après la digestion et la post-fixation, les embryons sont hybridés avec les sondes appropriées. Enfin, les embryons sont colorés avec le gène antide et les anticorps et le signal est développé avec des substrats pour la phosphatase alcaline.En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la distribution tissulaire de l’expression génique à un stade de développement donné grâce à l’hybridation et à l’imagerie in situ de l’ensemble du mont. Bien que cette méthode puisse fournir de meilleures informations sur l’expression normale du gène cible, elle peut également être appliquée à d’autres conditions telles que l’expression du gène cible dans le modèle de la maladie, et lorsque d’autres gènes sont surexprimés ou sous-exprimés. À l’aide de la technologie de micro-injection En utilisant l’ADNC pour un gène d’intérêt, mettez en place une réaction de marquage de l’ARN pour synthétiser l’oxygène du digo Dans des sondes d’ARN marquées dans un flacon de réaction libre d’ARN en ajoutant un à cinq microgrammes d’ADN matrice purifié à de l’eau double distillée exempte d’ARN stérile traitée jusqu’à un volume de 13 microlitres.Refroidissez la réaction sur de la glace et ajoutez les réactifs suivants après avoir mélangé doucement la centrifugeuse 2000 RPM pendant 30 secondes à température ambiante avant d’incuber la réaction pendant deux heures à 37 degrés Celsius après l’incubation, retirez l’ADN matrice en ajoutant deux microlitres d’ARN libres. L’ADN on incube pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et arrête la réaction en ajoutant deux microlitres d’EDTA de 0,2 molaire, précipite les produits de réaction en ajoutant 2,5 microlitres de chlorure de lithium à quatre molaires et 75 microlitres d’éthanol à 100 %. Mélangez la solution et incubez à moins 20 degrés Celsius pendant 45 minutes ou toute la nuit.Centrifugez la suspension pendant 30 minutes à 13 000 tr/min et quatre degrés Celsius. Lavez ensuite le granulé avec de l’éthanol glacé après 10 minutes d’essorage. Faites sécher le granulé pendant deux minutes avant de le réinfuser, en le suspendant dans 50 microlitres de nucléase, de l’eau double distillée gratuite.Ensuite, incubez-le pendant 30 minutes. À 37 degrés Celsius, faites fonctionner un à deux microlitres de la sonde sur un gel à 1 % pendant environ 30 minutes pour vérifier sa qualité et son intégrité. Ensuite, à l’aide d’un spectrophotomètre, quantifier la sonde afin de réhydrater les embryons préalablement fixés et congelés.Commencez par fabriquer des paniers en coupant les extrémités coniques de microtubes de 1,5 millilitre. Retirez ensuite les bords supérieurs de la moitié d’entre eux. Coupez de petits morceaux de maille de nylon pour couvrir les extrémités, puis dans quelques capots, chauffez les extrémités du tube sur une plaque chauffante électrique et pressez-les dans la maille une fois refroidies.Retirez l’excédent de maille de nylon et conservez les paniers dans du méthanol à 100 % à température ambiante. Après avoir préparé la dilution successive du méthanol dans le PBS, conformément au protocole textuel et ajouté quatre millilitres de chaque dans les puits d’une boîte à six puits, placez les embryons dans des paniers individuels pour chaque sonde et incuberez-les dans la série de méthanol PBS pendant cinq minutes par puits, en terminant par trois lavages dans le PBST. Permétrer les embryons avec la protéinase K à température ambiante, en utilisant les temps d’incubation suivants par stade de développement.Ensuite, fixez les embryons dans de l’aldéhyde paraforme à 4 % dans du PBS pendant 20 minutes et lavez-les trois fois dans du PBST pendant cinq minutes chacune. Ensuite, préparez le mélange d’acétylation selon le protocole textuel et incubez les embryons deux fois pendant 10 minutes chacun. Ensuite, lavez les embryons et le PBST deux fois pendant 10 minutes chacun.Transférez les embryons dans des microtubes stériles et incubez avec 200 microlitres de mélange d’hybridation ou HM, dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant deux à quatre heures. Ajoutez 100 à 200 nanogrammes de sonde à la solution et incubez toute la nuit à 70 degrés Celsius dans un bain-marie. Remplacez la solution de la sonde par du HM préchauffé et incubez les échantillons à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes.Après avoir soumis les échantillons à une série H-M-S-S-C et bloqué les embryons conformément au protocole textuel, incubez les embryons dans une dilution de un à 5 000 d’anticorps anti-D AP dans un tampon de blocage pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec une légère agitation le lendemain. Lavez les embryons six fois pendant 15 minutes chacune. Après avoir pré-coloré les embryons, incubez-les dans le BCIP et le NBT.Ajouter la température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. Utilisez un stéréomicroscope pour surveiller la réaction de coloration toutes les 30 minutes afin d’arrêter la réaction. Transférez les paniers d’embryons dans des puits contenant la solution d’arrêt deux fois pendant 10 minutes chacune avec une légère agitation.Après post-fixation des embryons avec 4 % de para formaldéhyde dans du PBS pendant 20 minutes. Montez les embryons en les transférant dans le moins de PBS possible dans six plaques de puits contenant 100 % de glycérol. Bercez doucement les embryons dans l’obscurité à température ambiante, imagez pendant la nuit dans 100 % glycérol sous un stéréomicroscope.Des exemples représentatifs de coloration in situ à hybridation sont présentés ici. Les colorations violettes observées après hybridation avec la sonde ribo d’intérêt représentent à la fois l’abondance et les sites d’expression d’un gène particulier. Par exemple, PC 5.1 montre une expression très discrète dans les parties antérieure et postérieure de la vésicule otique et de la ligne latérale primordiale 24 heures après la fécondation et est fortement localisée dans les neuromastes des lignes latérales antérieure et postérieure 72 heures après la fécondation.En revanche, PC 5.2 montre une expression omniprésente dans le SNC avec une régionalisation distincte dans la vésicule otique somite et le canal frique couché, et est fortement exprimée dans le foie et l’intestin 96 heures après la fécondation. L’absence d’expression génique lors de l’utilisation des sondes Ribo sensorielles respectives sert de contrôle négatif, comme on le voit ici. L’analyse de l’expression des marqueurs sanguins a montré une coloration de SCL T one dans les cellules crâniennes bilatérales et dans la masse cellulaire intermédiaire ou ICM.Bien que la coloration du gata one soit également observée dans l’ICM, le modèle d’expression est différent. L’expression de F-L-K-K-D-R-L a été observée dans les vaisseaux principaux et intersegmentaires du cerveau postérieur, et dans l’ICM, une coloration pour le hérisson sonique a été observée dans le no cordon. Dans ces exemples, l’expression de DLX deux à 34 heures après la fécondation est localisée dans l’hypothalamus Talon Cephalon et les arcs mésenchymateux crâniens et dans le FK D sept Fox, une expression à 24 heures après la fécondation est observée principalement dans la plaque de sol et l’expression d’HypoChlor.Les modèles des marqueurs pancréatiques ont montré une coloration à l’insuline dans le pancréas endocrine et à la trypsine dans le pancréas exocrine. Les résultats montrant des profils d’expression à haute résolution confirment le succès du protocole décrit pour la détection de l’expression des gènes de haute et de faible abondance mis en évidence. Voici quelques exemples d’expériences réalisées dans des conditions optimales.Par exemple, un signal de fond élevé avec une faible expression sonore de hérisson résultait d’une perméabilité inadéquate et d’une hybridation entre 55 et 60 degrés Celsius. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un montage complet dans deux hybridations d’embryons de poisson zèbre à l’aide de sondes d’ARN marquées dans des fossés, de la coloration post-hybridation et de l’imagerie.

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Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Utilisation Mont entier<em&gt; In situ</emHybridation&gt; Lien vers biologie moléculaire et Organismal

Un moyen rapide pour effectuer immunocoloration des embryons de poisson zèbre coeur est décrite. Comparativement à l'approche immunologique monter ensemble, cette méthode augmente considérablement la pénétration de l'anticorps, ce qui permet d'obtenir des images haute résolution qui révèlent des structures cellulaires / subcellulaires dans le coeur dans un temps de traitement beaucoup plus réduite.

Immunocoloration des Disséqué coeur embryonnaire Zebrafish

L'embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l'embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l'observation et l'analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d'embryons de poisson zèbre.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Techniques sont décrites à immunocoloration phospho-épitopes dans embryons de poisson zèbre entiers et ensuite procéder à deux couleurs confocal fluorescent localisation dans des structures cellulaires aussi petites que les cils primaires. Les techniques de fixation et d'imagerie peuvent définir l'emplacement et de la cinétique de l'apparition ou de l'activation de protéines spécifiques.

Immunocoloration phospho-épitopes dans ciliées organes de Mont entiers embryons de poissons zèbres

Développement de cils est vitale pour l’organogenèse appropriée. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour étiqueter et de visualiser les cellules ciliées du poisson-zèbre.

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

Les technologies d'édition génétique ont permis aux chercheurs de générer des mutants de poissons zèbres pour étudier la fonction génique avec une relative facilité. Ici, nous fournissons un guide pour effectuer le génotypage d'embryons parallèles et la quantification des signaux d'hybridation in situ chez le poisson zèbre. Cette approche impartiale offre une plus grande précision dans les analyses phénotypiques basées sur l'hybridation in situ.

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Cet article décrit une méthode pour monter les embryons fragiles de poisson zèbre pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée. Cette méthode à faible coût est facile à exécuter en utilisant des plats de microscopie à fond de verre réguliers pour l'imagerie sur n'importe quel microscope inversé. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations.

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Ici, nous présentons un protocole pour la détection fluorescente des protéines par anticorps dans des préparations entières d'embryons et de larves de poissons zèbres.

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Le poisson-zèbre est un modèle important pour comprendre le développement des reins. Ici, un protocole d’hybridation in situ est optimisé pour détecter l’expression des gènes chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre pendant le développement du mésonéphros.

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Ce protocole décrit comment obtenir des images en combinant l’hybridation in situ et l’immunohistochimie de coupes embryonnaires de poisson-zèbre. L’hybridation in situ a été réalisée avant la cryosection, suivie d’une coloration des anticorps. Il est utile de détecter les schémas d’expression de deux gènes chez le poisson zèbre s’il y a une pénurie d’anticorps.

In situ Hybridation combinée à l’immunohistochimie dans des embryons de poisson-zèbre cryosectionnés

Découvrez l'hybridation in situ sur embryons entiers de zebrafish pour analyser l'expression génique spatiale et temporelle. Cette méthode améliorée détecte les transcrits peu abondants tout en réduisant le bruit de fond non spécifique.

Haute Résolution Mont entier In Situ Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier lexpression des gènes et la fonction (Vidéo) | JoVE Journal

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