Name: Les analyses de viabilité de cellules en culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Découvrez les tests de viabilité cellulaire combinant mesure d'ATP, immunomarquage et imagerie infrarouge pour évaluer la santé cellulaire. Cette méthode offre une analyse objective de l'intégrité structurale et métabolique.

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Nous reconnaissons Juliann Jaumotte à l&#39;idée d&#39;économiser sur les volumes de réactifs dans le dosage de l&#39;ATP. Nous sommes profondément reconnaissants pour le soutien administratif superbe de Marie Caruso, Deb Willson, et Jackie Farrer et à l&#39;École de pharmacie de Mylan pour fournir un soutien financier pour ces études. Merci aussi aux maladies Hunkele redouté Fondation et le Parkinson et les troubles du mouvement de la Fondation pour le soutien financier des études primaires de neurones.

Aucun des auteurs n&#39;a de conflit de divulguer.

Nous avons trouvé que la puissance du signal dans les trois essais de viabilité est linéaire et en corrélation avec la densité de placage. Cependant, tous les tests sont également sensibles à 2 fois ou 1,5 fois les changements dans la densité de placage. Pour les cellules N2a, les analyses infrarouges sont moins sensibles que le dosage de l&#39;ATP, en particulier à des densités de plaquage inférieure. Bien que les analyses infrarouges sont moins sensibles que l&#39;ATP, les DRAQ5 + Sapphire tests et les essais α-tubuli...

Le test de viabilité la plus courante dans les sciences biologiques implique nombre de cellules. Ceci est démontré par une analyse des meilleurs (les plus récents) de 200 publications parues dans PubMed avec l&#39;un des mots-clés «in vitro» ou «culture» sur 29/04/2013 et 30/04/2013. Parmi ces publications, 23,5% utilisés essais de comptage de cellules, y compris les manuels nombre de cellules chiffres, le nombre de cellules automatisé compte avec un logiciel d&#39;imagerie, et exclusion au bleu Trypan. Le dosage Vivant / Mort a été utilisé dans 1% de ces publications. Le nombre de publications utilisant le MTT (3 - (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl) test pour la viabilité métabolique était de 11%. Cette revue de la littérature montre également que le nombre de publications en utilisant des tests tels que MTT en conjonction avec les tests de comptage cellulaire n&#39;était que de 3,5%. Malgré la tendance à utiliser un test de viabilité par lui-même, l&#39;évaluation de la fonction cellulaire en combinaison avec le nombre de cellules semble le meilleur choix pour l&#39;évaluation i cellulaireNtegrity. Les comptages cellulaires par eux-mêmes ne sont pas suffisants parce que les cellules restantes ne peuvent pas être fonctionnel ou en bonne santé, même si elles sont présentes dans le puits de 1,2. A l&#39;inverse, les mesures fonctionnelles telles que l&#39;ATP peut augmenter ou diminuer en l&#39;absence de changements parallèles dans le nombre de cellules. Le découplage de lectures métaboliques du nombre de cellules suggère que l&#39;ATP et MTT essais ne doivent jamais être utilisés comme seul test de viabilité. Dans le présent rapport, trois essais de viabilité, qui sondent les structures cellulaires et la fonction métabolique sont décrits, pour une vision plus globale de l&#39;intégrité cellulaire que n&#39;importe quel test en lui-même ne peut se permettre. Deux de nos tests nécessitent un imageur infrarouge qui mesure la fluorescence dans les canaux 700 et 800 nm. Le bruit est faible dans les longueurs d&#39;onde infrarouges, entraînant une hausse des signal-bruit ratios 3. L&#39;imageur de l&#39;Odyssée que nous utilisons a une gamme dynamique de 4,5 log et une profondeur de bits de 16, Translating à 2 16 ou 65 536 nuances de l&#39;infrarouge. Cela peut être comparé à l&#39;imagerie de couleur 8 bits, qui ne donne 2 8 ou 256 nuances de couleur pour chaque longueur d&#39;onde. Ainsi, l&#39;imagerie 16 bits a une résolution plus fine. Il convient de noter que les images infrarouges d&#39;origine sont souvent pseudocolored vert (800 nm) et le rouge (700 nm) dans des rapports publiés pour la présentation. imageurs Odyssey sont couramment utilisés à la fois pour Western blot et In-Cell Westerns 4-7. In-Cell Westerns sur les cellules fixées au formaldehyde utilisent des anticorps primaires contre toute protéine d&#39;intérêt et de les étiqueter à son tour avec des anticorps secondaires fluorescents infrarouges. Cette technique est connue pour être particulièrement utile pour les points d&#39;extrémité de phosphorylation 6. Dans notre In-Cell Westerns, nous colorer les cellules fixes de protéines du cytosquelette α-tubuline ou aux microtubules neuronaux de la protéine associée à 2 (MAP2) dans le canal de 800 nm. Ces protéines sont assez abondantes pour donner rapports signal sur bruit. Nous tachons également nos assiettes dans le 700canal nm pour les noyaux avec la tache de DRAQ5 et pour le cytoplasme avec la tache de Sapphire. Tant les protéines du cytosquelette et les DRAQ5 + taches Sapphire reflètent donc des structures cellulaires. Le troisième test de viabilité de mesurer la fonction métabolique et est appelé &quot;Cell Titer Glo.&quot; Pour ce dosage à base de luciférase-, valeurs de luminescence sont en proportion directe avec les taux d&#39;ATP. Essais ATP sont couramment utilisés pour quantifier les cellules viables 8-12. Cependant, y compris le mot «titre» dans le nom de l&#39;analyse est un peu un abus de langage car la production d&#39;ATP par cellule peut changer en fonction des traitements de toxine et n&#39;est donc pas toujours en proportion du nombre de cellules 8. Les niveaux d&#39;ATP peuvent également être affectés par les rythmes circadiens 13 et par la division cellulaire 14 et la différenciation des cellules 15. Néanmoins, le dosage de l&#39;ATP montré ici est simple à réaliser et utile car l&#39;ATP est une mesure robuste métaboliqueviabilité 16-21, sinon la cellule numéro en soi. L&#39;utilisation de ce test pour compléter l&#39;infrarouge In-Cell Westerns cède donc une image plus complète de l&#39;intégrité cellulaire que tout un test seul.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Achetez en quantités de 100 ml et aliquote, au lieu d’acheter la quantité plus chère de 10 ml. Les réactifs reconstitués et non utilisés peuvent être recongelés à -20 &deg ; C pendant au moins 21 semaines</td></tr><tr><td>18 % Formalin</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>L’achat de ce fixateur évite la pesée des poudres de formaldéhyde et l’ébullition de la solution ; l’exposition aux vapeurs est ainsi minimisée</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Il n’est pas essentiel de l’ajouter aux solutions de formaldéhyde, mais cela améliore l’apparence des cellules fixées</td></tr><tr><td>Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Ce sérum de poisson peut être acheté en vrac et congelé à -20 &deg ; C pour une utilisation à long terme</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Nous stockons une solution mère de 10 % de Triton-X 100 dans de l’eau stérile à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>On peut également acheter des comprimés PBS ou des solutions 10x PBS, mais ils sont plus chers</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Voir ci-dessus</td></tr><tr><td>Azoture de sodium (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>N’achetez pas la poudre car l’azoture de sodium est très toxique. Nous stockons tous nos anticorps utilisés dans 1x azoture de sodium à 4 &deg ; C jusqu’à ce qu’ils soient contaminés par des débris</td></tr><tr><td>Souris anti-&alpha ;-tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Cet anticorps est coûteux mais peut être considérablement dilué et est très spécifique</td></tr><tr><td>Souris anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Cet anticorps est coûteux mais est très spécifique (une condition préalable pour les westerns en cellule)</td></tr><tr><td>800 nm Chèvre anti-souris IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>D’autres sociétés vendent également des anticorps secondaires infrarouges. Assurez-vous d’acheter les anticorps hautement adsorbés et notez que les concentrations d’IgG peuvent varier avec la source</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Ce composé était vendu par LI-COR à 1 mM</td></tr><tr><td>Sapphire</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminomètre</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 compteur</td><td></td>multi-étiquettes</tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr>Produits <td>de recherche</td> sur les<td>agitateurs/mélangeurs</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

les analyses de viabilité de cellules en culture

Viability Assays for Cells in Culture

Le nombre de cellules manuelles sur un microscope sont des moyens sensibles à l&#39;évaluation de la viabilité cellulaire, mais prennent du temps et par conséquent coûteux. Essais de viabilité informatiques sont coûteux en termes d&#39;équipement, mais peut être plus rapide et plus objective que les comptages manuels cellulaires. Le présent rapport décrit l&#39;utilisation de ces trois essais de viabilité. Deux de ces dosages sont l&#39;infrarouge et l&#39;autre est luminescent. Les deux tests infrarouges reposent sur un imageur 16 bits Odyssey. Une analyse infrarouge utilise la tache de DRAQ5 pour les noyaux combinés avec la tache de Sapphire pour cytosol et est visualisé dans le canal 700 nm. L&#39;autre test infrarouge, un In-Cell occidentale, utilise des anticorps contre les protéines du cytosquelette (α-tubuline ou microtubules protéines associées 2) et les étiquettes dans le canal 800 nm. Le troisième test de viabilité est un dosage luminescent couramment utilisé pour l&#39;ATP, mais nous utilisons un quart de la quantité recommandée pour économiser sur les coûts. Ces mesures sont toutes linéaires et sont en corrélation avec le nombre de CElls plaqué, mais varient en sensibilité. Tous les trois essais contourner microscopie temps et déguster l&#39;ensemble bien, ce qui réduit l&#39;erreur d&#39;échantillonnage. Enfin, tous les tests peuvent facilement être achevée dans un délai d&#39;une journée de la fin de l&#39;expérience, ce qui permet un plus grand nombre d&#39;expériences à réaliser dans des délais courts. Cependant, elles reposent toutes sur l&#39;hypothèse que le nombre de cellules restent en proportion de la force du signal après les traitements, une hypothèse qui est parfois pas satisfaite, en particulier pour l&#39;ATP cellulaire. En outre, si les cellules augmentent ou diminuent en taille après le traitement, cela pourrait affecter la force du signal sans affecter le nombre de cellules. Nous concluons que tous les tests de viabilité, y compris les comptages manuels, souffrent d&#39;un certain nombre de réserves, mais que les essais de viabilité informatisés valent bien l&#39;investissement initial. En utilisant les trois dosages donne ainsi une vue d&#39;ensemble de la structure et de la fonction cellulaire.

Le facteur limitant la vitesse dans ces expériences est la coloration de l&#39;infrarouge, comme le dosage de l&#39;ATP est relativement courte en durée. Pour les tests infrarouges, nous prévoyons que huit plaques à 96 puits peuvent être colorés et analysés dans un jour par échelonnement deux lots de quatre assiettes maximum (voir la figure 1). Cette estimation suppose 20 min de fixation, 30 min de lavage, 30 min de blocage, 2 h primaire incubation d&#39;anticorps puis 30 min de lavages, 1 heure d&#39;i...

Les composés thérapeutiques sont souvent d&#39;abord examiné in vitro par des tests de viabilité. Le nombre de cellules aveugles par un observateur humain peuvent être très sensibles à de faibles variations du nombre de cellules mais ne pas évaluer la fonction. Essais de viabilité informatiques, tel que décrit ici, peuvent évaluer à la fois la structure et la fonction d&#39;une manière objective.

Les analyses de viabilité de cellules en culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser plusieurs tests de viabilité qui offrent une vision plus complète de la capacité cellulaire que ne pourrait en fournir un seul test pris isolément. Cela est réalisé en mesurant d'abord les niveaux d'ATP des cellules en culture afin d'évaluer leur fonction métabolique. La deuxième étape consiste à effectuer une immunomarquage de protéines du cytosquelette telles que la tubuline alpha ou la protéine associée aux microtubules deux, à l'aide d'anticorps infrarouges ayant des longueurs d'onde de 800 nanomètres.Ensuite, les cellules sont marquées avec le drac cinq infrarouge et le saphir pour colorer le noyau et le cytoplasme à 700 nanomètres. La dernière étape consiste à imager l'alpha-tubuline ou la MAP2 ainsi que le drac cinq plus le saphir aux longueurs d'onde de 700 et de 800 nanomètres sur un imageur infrarouge. En fin de compte, ces dosages luminescents et infrarouges fournissent des informations sur les structures anatomiques ainsi que sur la fonction physiologique.L'avantage principal de ces techniques par rapport aux méthodes existantes, telles que le test de viabilité MTT, réside dans la mesure rapide et sensible de plusieurs aspects de l'intégrité cellulaire. Ces méthodes permettent de répondre à des questions clés dans les domaines des neurosciences et de la pharmacologie, notamment pour déterminer si des composés thérapeutiques peuvent protéger les structures anatomiques et la fonction métabolique. Pour commencer, récoltez et resuspendez les cellules dans 100 ou 200 microlitres de milieu à différentes densités cellulaires dans une plaque de 96 puits selon le protocole joint, puis remplissez les puits environnants avec 200 microlitres d'eau stérile afin de réduire les effets d'évaporation aux bords.Laisser les cellules adhérer toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur tamponné au CO2. Le jour suivant, retirer 50 des 100 microlitres de milieu ou 150 des 200 microlitres de milieu afin de laisser 50 microlitres de milieu dans chaque puits. Ensuite, ajouter 25 microlitres du réactif Cell Titer-Glo aux puits intérieurs des colonnes deux à six.Pour obtenir une dilution d’un à deux dans les colonnes sept à onze, lignes B à D, ajouter 50 microlitres du réactif Cell Titer Glow afin d’obtenir une dilution d’un à un dans les puits restants. Colonnes sept à onze, lignes E à G. Ne pas retirer de milieu, mais ajouter plutôt 100 microlitres du réactif Cell Titer Glow pour obtenir une dilution d’un à un dans un volume total de 200 microlitres. Placer immédiatement la plaque sur un agitateur rotatif ou orbital pendant 10 minutes afin de mélanger les échantillons durant l’incubation.Ensuite, transférez 60 microlitres de chaque puits dans une plaque blanche à 96 puits. Les valeurs de luminiscence sont plus élevées dans les plaques blanches que dans les plaques transparentes ou noires, car elles réfléchissent la lumière vers le haut, en direction du détecteur. Si des bulles se forment pendant le transfert, faites-les éclater à l’aide d’air comprimé provenant d’un embout en plastique de pipette de transfert.Ensuite, dans les 12 minutes suivant l'ajout des réactifs, placer la plaque dans un luminomètre et mesurer les valeurs de luminescence. Faire la moyenne des valeurs luminescentes provenant des trois ou six puits de chaque groupe et les représenter en fonction du nombre de cellules, en utilisant la dilution la plus élevée des réactifs qui donne tout de même des résultats linéaires et proportionnels, comme défini dans le texte accompagnant. Cela permettra de réduire les coûts des dosages infrarouges ; récolter les cellules et les reprendre à différentes densités, comme décrit dans le protocole du texte accompagnant.Remplir les puits environnants avec 200 microlitres d'eau stérile afin de réduire l'effet des gradients de température et de l'évaporation sur les bords. Laisser les cellules adhérer toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur tamponné au CO2, puis fixer les cellules en ajoutant 100 microlitres d'un fixateur, tel que du formaldéhyde 4 % et du saccharose 4 % dans un tampon phosphate 0,1 molaire. Incuber la plaque à température ambiante pendant 20 minutes, puis éliminer le fixateur et laver les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS.Ensuite, diluez la solution de blocage au ratio de un pour un dans du PBS et ajoutez 0,3 % de Triton X-100 comme agent perméabilisant pour les cellules. Ajoutez ensuite 35 microlitres de la solution de blocage dans chaque puits, en prenant soin d'éviter la formation de bulles. Incubez la plaque avec la solution de blocage pendant 30 à 60 minutes à température ambiante.Pendant cette incubation, diluez les anticorps primaires dirigés contre les protéines d'intérêt. Par exemple, diluez l'anticorps primaire Antifa tubuline au 1/10 000 dans un mélange égal de tampon de blocage et de PBS contenant 0,3 % de TRITON X-100 lors de l'optimisation du test de la procédure. Pour d'autres dilutions d'anticorps, l'anticorps primaire Antifa tubuline est également dilué au 1/5 000 dans un mélange égal de tampon de blocage et de PBS contenant 0,3 % de Triton X-100.Ensuite, ajoutez les anticorps aux concentrations indiquées ici sur les cellules fixées dans la plaque. Veillez à laisser les puits du contrôle négatif dans la colonne deux dans la solution de blocage, car ils ne seront exposés qu'aux anticorps secondaires. Incubez les cellules avec les anticorps primaires pendant une à deux heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.Ensuite, préparez les anticorps secondaires anti-IgG de souris de 800 nanomètres en les diluant au 1/1000 ou au 1/2000 dans un mélange à 1:1 de tampon de blocage et de PBS contenant 0,3 % de Triton X-100, après l'incubation avec l'anticorps primaire. Lavez les puits trois fois, 10 minutes chacun, avec 200 microlitres de PBS par puits, puis ajoutez 35 microlitres d'anticorps secondaires dans les puits.Ajouter la dilution au 1/1000 à la moitié supérieure de la plaque et la dilution au 1/2000 à la moitié inférieure. Incuber les cellules avec les anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière. Puis éliminer les anticorps secondaires non liés par trois lavages de 10 minutes au PBS, en utilisant 200 microlitres par puits à chaque fois.Ensuite, diluez le stock de DRAC cinq au 1/10 000 pour obtenir une concentration finale de 0,5 micromolaire et le stock de saphir au 1/1000 dans du PBS contenant 0,3 % de Triton X-100. Ajoutez 35 microlitres de ce mélange à la moitié gauche de la plaque, mais n'ajoutez rien aux puits de contrôle négatif de la colonne deux. Pour la moitié droite de la plaque, ajoutez 35 microlitres de DRAC cinq dilué au 1/20 000 et de saphir dilué au 1/2000.Incuber pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière dans ces solutions. Puis laver la plaque trois fois avec 200 microlitres de PBS par puits pendant 10 minutes à chaque fois. Commencer par numériser les plaques sur l’imagerie infrarouge à une intensité de cinq et une résolution de 169 microns.Les réglages de qualité moyenne ou faible sont suffisants. Effectuez ensuite la numérisation à différents décalages de mise au point de 2,5 millimètres, 3,0 millimètres, 3,5 millimètres et 4,0 millimètres afin de déterminer où le rapport signal sur bruit le plus élevé et le signal le plus net sont obtenus. Une fois le décalage de mise au point optimisé, utilisez la fonction incel western du logiciel pour placer une grille de la taille appropriée sur l'image de la plaque, puis exportez les données vers Microsoft Excel.Soustrayez la moyenne des intensités intégrées dans les puits de contrôle négatif de chaque point de données correspondant dans les canaux de 700 et 800 nanomètres. Ensuite, faites la moyenne des intensités de signal intégrées pour chaque groupe de puits et représentez les données sous forme de nuage de points en fonction de la densité cellulaire après optimisation. L'intensité du signal dans les trois tests était significativement corrélée au nombre de cellules par puits ; bien que les trois tests soient très linéaires, ils n'étaient pas équivalents en sensibilité.Le test ATP a montré la sensibilité la plus élevée des trois, définie comme le changement le plus proportionnel du signal luminescent par rapport à la diminution du nombre de cellules dans les cellules neuronales primaires de rat. Les concentrations optimales de réactifs étaient différentes, et les tests présentaient une moindre linéarité sur toute la gamme du dosage. Toutefois, les tests étaient à la fois linéaires et sensibles à des densités de semis inférieures à 100 000 cellules, comme illustré ici.Nos courbes de réponse à la dose de cellules de neuroblastome traitées avec le MG 132, un inhibiteur du protéasome, ont été établies en présence ou en absence du précurseur du glutathion, la N-acétylcystéine. La N-acétylcystéine décale les trois courbes vers la droite. Par exemple, la CI50 mesurée par DRAC5+ Sapphire était de 1,64 micromolaire de MG 132 en l'absence de N-acétylcystéine et de 4,64 micromolaire de MG 132 en présence de N-acétylcystéine. Ces valeurs étaient similaires à celles obtenues dans le test de l’alpha-tubuline, respectivement de 1,96 micromolaire et 6,35 micromolaire de MG 132.Cependant, les concentrations de TP ont augmenté à faibles concentrations de MG 132, un phénomène appelé hormèse. Ces données montrent que les concentrations de TP ne sont pas nécessairement proportionnelles au titre cellulaire après traitement, et que la N-acétylcystéine peut également protéger la fonction métabolique. Une fois maîtrisé, le dosage luminescent des TP peut être réalisé en moins de 30 minutes, et la coloration infrarouge peut facilement être terminée en moins de huit heures.Lors de la mise en œuvre de ces procédures, il est important de garder à l'esprit qu'elles ne mesurent pas le nombre de cellules de la même manière qu'un microscope à haute résolution. Par exemple, un inconvénient est que les niveaux de protéine de tubuline alpha ou les niveaux de TP peuvent être modifiés par les traitements, en l'absence de changements parallèles du nombre de cellules.

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Les analyses de viabilité de cellules en culture

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