2.11: Western Blot

L’immunotransfert ou Western blot est une technique puissante utilisée par de nombreux chercheurs pour identifier la présence de protéines spécifiques présentes dans un échantillon, séparées par électrophorèse et détectées en utilisant des anticorps.

Il y a 3 principales étapes dans cette technique qui sont essentielles pour un résultat de qualité: électrotransfert, immunoempreinte, et détection. Avant que ces étapes soient effectuées, un SDS-PAGE, dans lequel les protéines dénaturées sont séparées selon leur taille dans un gel de polyacrylamide, doit être effectué.

L’électrotransfert nécessite une cassette de transfert pour maintenir ensemble le "sandwich" ainsi qu'un appareil pour transférer des protéines à partir d'un gel d'acrylamide sur une membrane mince. Le sandwich d’électrotransfert est constitué du gel et d’une membrane spécialisée, prise en sandwich entre deux morceaux de papier-filtre. Au cours du transfert, un champ électrique est utilisé, pour déplacer les protéines dans le gel, où elles sont piégées sur une membrane grâce à leurs charges et interactions hydrophobes.

L’immunotransfert utilise des anticorps pour investiguer des protéines spécifiques sur la membrane. Les anticorps sont des protéines de grande taille en forme de Y qui contiennent deux fragments, également appelés régions Fab, qui se lient à d'autres protéines. La région Fab définit l'épitope spécifique, ou une partie spécifique d'une protéine à laquelle un anticorps se lie.

Les anticorps monoclonaux sont des anticorps qui reconnaissent un épitope unique et sont le type préféré d'anticorps utilisé pour l’immunotransfert en raison de leur spécificité. En revanche, les anticorps polyclonaux sont une série de différents anticorps qui ciblent plusieurs épitopes sur le même antigène - ou de la protéine pour laquelle l'anticorps a une spécificité. Les anticorps monoclonaux qui reconnaissent un épitope linéaire sont préférés car cela assure la détection de l'épitope sur une protéine dénaturée, ou linéarisée. Ceci est important car de nombreux anticorps ne reconnaissent pas les épitopes conformationels, ce qui signifie qu'ils reconnaissent uniquement les protéines dans leur état natif tridimensionnel.

En plus des fragments Fab, les anticorps contiennent une région Fc, qui est spécifique à l'animal qui produit l'anticorps. En immunotransfert, cette région est principalement utilisée comme l'épitope pour un anticorps secondaire - un anticorps qui reconnaît le premier anticorps qui est lié à la protéine que vous essayez de détecter.

Afin de produire un signal observable, les anticorps sont souvent liés, par leur région Fc, à une enzyme, telle que la phosphatase alcaline ou la peroxydase de Raifort. Ces enzymes produisent des signaux en réagissant avec leurs substrats pour provoquer des changements de couleur ou produire des changements de lumière.

Ces changements peuvent être quantifiés par densitométrie. La densitométrie est la technique utilisée pour mesurer la densité d'une bande de protéine en utilisant un logiciel d'analyse d'images pour calculer la densité de chaque bande. Les bandes peuvent être ensuite directement quantifiées à l'aide des standards de référence ou à l’aide d’un contrôle interne en utilisant un échantillon contrôle.

Pour un immunotransfert réussi, le gel est d'abord équilibré dans le tampon de transfert pendant 15 minutes. La membrane doit également être équilibrée selon les instructions du fabricant.

Ensuite, le sandwich comprenant le gel pour le transfert est soigneusement préparé dans un tampon de transfert en évitant que des bulles soient piégées au sein du système. Les bulles emprisonnées dans le sandwich peuvent être chassées en roulant par dessus elles avec une petite pipette. Même les petites bulles peuvent interrompre le transfert de protéines provoquant un transfert incomplet comme on peut le voir sur les parties inférieures de cette membrane.

Une fois assemblé, du tampon de transfert additionnel est versé dans la chambre de transfert et le transfert est exécuté entre 20-30 mA pendant 2-3 heures. Le tampon de transfert contient du méthanol, ce qui améliore la liaison des protéines à la membrane.

Une fois que le transfert est terminé, la cassette est démontée et la qualité du transfert peut être vérifiée en utilisant une coloration non spécifique de protéine telle que le Ponceau S. Ceci offre une détection rapide et réversible des bandes de protéines.

La première étape d'immunotransfert est de couvrir les zones inoccupées de la membrane avec une solution diluée de protéines. Cette étape est appelée le blocage et est réalisée, afin de bloquer la membrane et de réduire les liaisons non spécifiques de l'anticorps à la membrane. Typiquement, la solution de blocage est constituée soit d'albumine de sérum bovin ou de lait sec non gras dissous dans une solution saline tamponnée. Cette étape est généralement effectuée sur un agitateur pour une période de une à 24 heures.

L'étape suivante consiste à incuber la membrane avec l'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage. Cette étape peut prendre de 30 minutes à une nuit et doit être effectuée avec une légère agitation.

Ensuite, la membrane est rincée abondamment de façon à réduire les liaisons non spécifiques et l'anticorps secondaire est ajouté dans le tampon de blocage. Après une courte incubation, la membrane est à nouveau rincée abondamment.

Les anticorps secondaires sont détectables grâce aux enzymes qui sont liées à ces derniers. Lors de l'addition du substrat approprié, les changements colorimétriques ou chimiluminescents peuvent être imagés et ensuite mesurés en utilisant des techniques de densitométrie. De plus, les standards de protéines fournissent les valeurs de références de taille de sorte que la taille linéaire de chaque protéine peut être estimée en fonction de la distance qu'elles ont migré dans le gel par rapport à ces marqueurs de taille. L'observation de la taille des protéines détectées par immunotransfert est un bon moyen pour vérifier que l'anticorps reconnait la bonne protéine et s'il s'agit d'un monomère ou d’un complexe de multiples copies de la protéine.

Il existe des milliers d'anticorps primaires disponibles commercialement, ce qui permet la détection et la quantification de protéines spécifiques dans un échantillon. Voici des chercheurs qui utilisent un anticorps spécifique pour HIF-1α pour mesurer la quantité de ce facteur de transcription sensible à l’oxygène dans des cultures de cellules pour le dépistage de l'hypoxie. Ils ont également utilisé un anticorps contre la bêta-actine en tant que contrôle de chargement. Comme vous pouvez le voir, les cellules cultivées dans des conditions normales d'oxygène produisent beaucoup moins de HIF-1 que celles cultivées dans des conditions pauvres en oxygène.

La combinaison de l'électrophorèse sur gel en 2 dimensions et l’immunotransfert peut fournir des informations précieuses sur la présence de complexes protéiques. Ici, les échantillons ont d'abord été dissociés selon la taille des complexes protéiques, puis dénaturés de sorte que chaque protéine individuelle dans le complexe pourrait être séparée par leur taille individuelle. Des anticorps pour trois protéines différentes montrent trois complexes uniques contenant différentes quantités de ces protéines dans chaque complexe arrangé selon une ligne verticale. La colonne la plus à gauche contient des bêta-2 et MCP-21, ainsi qu'une autre protéine non représentée par ces marqueurs. La colonne du centre représente un complexe qui contient les 3 protéines, et la colonne de droite ne contient que bêta-2 et MCP-21.

L'immunotransfert peut également être utilisé pour visualiser les interactions protéine-protéine. Ceci est réalisé d’abord par le transfert de protéines à partir d'un gel sur une membrane de nitrocellulose, puis par le sondage de la membrane avec des protéines supplémentaires. L’immunotransfert est ensuite utilisé pour détecter si les protéines ajoutées ont formées des complexes avec l'une des protéines qui ont été immobilisées sur la membrane.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’immunotransfert. Vous devriez maintenant comprendre comment transférer des protéines sur une membrane, investiguer la membrane avec des anticorps, et détecter le signal. Comme toujours, merci pour votre attention!