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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Western Blot

The Western Blot

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

The Western Blot

2.10: Gel Purification

2.12: An Introduction to Transfection

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08:48 min

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April 30, 2023

Overview

L’immunotransfert est utilisé pour identifier la présence de protéines spécifiques dans des échantillons séparés par électrophorèse. Faisant suite à la séparation par une technique, connue sous le nom d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium, ou SDS-PAGE, l’immunotransfert est utilisé pour déplacer les protéines depuis un gel polyacrylamide vers un morceau de membrane qui piège les protéines dans leur emplacement respectif. Ensuite, les membranes sont sondées avec des anticorps dans un processus appelé immunotransfert. L’immunotransfert utilise les liaisons anticorps-protéine et anticorps-anticorps à travers des sites spécifiques de reconnaissance, fournissant la haute précision nécessaire pour identifier une seule protéine. La détection d’anticorps se fait en utilisant des systèmes rapporteurs ce qui inclu l’utilisation d’enzymes. Les enzymes peuvent être attachés à la fin d’un anticorps et réagir avec le substrat pour produire des changements de couleur ou de lumière. Ces signaux peuvent alors être imagés et quantifiés en utilisant un processus appelé densitométrie.

Cette vidéo-article présente une vue d’ensemble de la technique d’immunotransfert en décrivant le transfert, l’utilisation de la détection d’anticorps et l’analyse d’image. Les étapes impliquées dans l’immunotransfert tel que l’assemblage du sandwich de transfert et les conditions de transfert sont discutés en détails, aussi bien que la théorie sous-jacente aux liaisons d’anticorps et à la détection de ces anticorps. La large utilisation de cette technique est décrite à travers plusieurs exemples incluant la détection d’interactions protéine-protéine et l’identification de protéines individuelles à l’intérieur de complexes protéiques.

Procedure

L’immunotransfert ou Western blot est une technique puissante utilisée par de nombreux chercheurs pour identifier la présence de protéines spécifiques présentes dans un échantillon, séparées par électrophorèse et détectées en utilisant des anticorps.

Il y a 3 principales étapes dans cette technique qui sont essentielles pour un résultat de qualité: électrotransfert, immunoempreinte, et détection. Avant que ces étapes soient effectuées, un SDS-PAGE, dans lequel les protéines dénaturées sont séparées selon leur taille dans un gel de polyacrylamide, doit être effectué.

L’électrotransfert nécessite une cassette de transfert pour maintenir ensemble le “sandwich” ainsi qu’un appareil pour transférer des protéines à partir d’un gel d’acrylamide sur une membrane mince. Le sandwich d’électrotransfert est constitué du gel et d’une membrane spécialisée, prise en sandwich entre deux morceaux de papier-filtre. Au cours du transfert, un champ électrique est utilisé, pour déplacer les protéines dans le gel, où elles sont piégées sur une membrane grâce à leurs charges et interactions hydrophobes.

L’immunotransfert utilise des anticorps pour investiguer des protéines spécifiques sur la membrane. Les anticorps sont des protéines de grande taille en forme de Y qui contiennent deux fragments, également appelés régions Fab, qui se lient à d’autres protéines. La région Fab définit l’épitope spécifique, ou une partie spécifique d’une protéine à laquelle un anticorps se lie.

Les anticorps monoclonaux sont des anticorps qui reconnaissent un épitope unique et sont le type préféré d’anticorps utilisé pour l’immunotransfert en raison de leur spécificité. En revanche, les anticorps polyclonaux sont une série de différents anticorps qui ciblent plusieurs épitopes sur le même antigène – ou de la protéine pour laquelle l’anticorps a une spécificité. Les anticorps monoclonaux qui reconnaissent un épitope linéaire sont préférés car cela assure la détection de l’épitope sur une protéine dénaturée, ou linéarisée. Ceci est important car de nombreux anticorps ne reconnaissent pas les épitopes conformationels, ce qui signifie qu’ils reconnaissent uniquement les protéines dans leur état natif tridimensionnel.

En plus des fragments Fab, les anticorps contiennent une région Fc, qui est spécifique à l’animal qui produit l’anticorps. En immunotransfert, cette région est principalement utilisée comme l’épitope pour un anticorps secondaire – un anticorps qui reconnaît le premier anticorps qui est lié à la protéine que vous essayez de détecter.

Afin de produire un signal observable, les anticorps sont souvent liés, par leur région Fc, à une enzyme, telle que la phosphatase alcaline ou la peroxydase de Raifort. Ces enzymes produisent des signaux en réagissant avec leurs substrats pour provoquer des changements de couleur ou produire des changements de lumière.

Ces changements peuvent être quantifiés par densitométrie. La densitométrie est la technique utilisée pour mesurer la densité d’une bande de protéine en utilisant un logiciel d’analyse d’images pour calculer la densité de chaque bande. Les bandes peuvent être ensuite directement quantifiées à l’aide des standards de référence ou à l’aide d’un contrôle interne en utilisant un échantillon contrôle.

Pour un immunotransfert réussi, le gel est d’abord équilibré dans le tampon de transfert pendant 15 minutes. La membrane doit également être équilibrée selon les instructions du fabricant.

Ensuite, le sandwich comprenant le gel pour le transfert est soigneusement préparé dans un tampon de transfert en évitant que des bulles soient piégées au sein du système. Les bulles emprisonnées dans le sandwich peuvent être chassées en roulant par dessus elles avec une petite pipette. Même les petites bulles peuvent interrompre le transfert de protéines provoquant un transfert incomplet comme on peut le voir sur les parties inférieures de cette membrane.

Une fois assemblé, du tampon de transfert additionnel est versé dans la chambre de transfert et le transfert est exécuté entre 20-30 mA pendant 2-3 heures. Le tampon de transfert contient du méthanol, ce qui améliore la liaison des protéines à la membrane.

Une fois que le transfert est terminé, la cassette est démontée et la qualité du transfert peut être vérifiée en utilisant une coloration non spécifique de protéine telle que le Ponceau S. Ceci offre une détection rapide et réversible des bandes de protéines.

La première étape d’immunotransfert est de couvrir les zones inoccupées de la membrane avec une solution diluée de protéines. Cette étape est appelée le blocage et est réalisée, afin de bloquer la membrane et de réduire les liaisons non spécifiques de l’anticorps à la membrane. Typiquement, la solution de blocage est constituée soit d’albumine de sérum bovin ou de lait sec non gras dissous dans une solution saline tamponnée. Cette étape est généralement effectuée sur un agitateur pour une période de une à 24 heures.

L’étape suivante consiste à incuber la membrane avec l’anticorps primaire dilué dans la solution de blocage. Cette étape peut prendre de 30 minutes à une nuit et doit être effectuée avec une légère agitation.

Ensuite, la membrane est rincée abondamment de façon à réduire les liaisons non spécifiques et l’anticorps secondaire est ajouté dans le tampon de blocage. Après une courte incubation, la membrane est à nouveau rincée abondamment.

Les anticorps secondaires sont détectables grâce aux enzymes qui sont liées à ces derniers. Lors de l’addition du substrat approprié, les changements colorimétriques ou chimiluminescents peuvent être imagés et ensuite mesurés en utilisant des techniques de densitométrie. De plus, les standards de protéines fournissent les valeurs de références de taille de sorte que la taille linéaire de chaque protéine peut être estimée en fonction de la distance qu’elles ont migré dans le gel par rapport à ces marqueurs de taille. L’observation de la taille des protéines détectées par immunotransfert est un bon moyen pour vérifier que l’anticorps reconnait la bonne protéine et s’il s’agit d’un monomère ou d’un complexe de multiples copies de la protéine.

Il existe des milliers d’anticorps primaires disponibles commercialement, ce qui permet la détection et la quantification de protéines spécifiques dans un échantillon. Voici des chercheurs qui utilisent un anticorps spécifique pour HIF-1α pour mesurer la quantité de ce facteur de transcription sensible à l’oxygène dans des cultures de cellules pour le dépistage de l’hypoxie. Ils ont également utilisé un anticorps contre la bêta-actine en tant que contrôle de chargement. Comme vous pouvez le voir, les cellules cultivées dans des conditions normales d’oxygène produisent beaucoup moins de HIF-1 que celles cultivées dans des conditions pauvres en oxygène.

La combinaison de l’électrophorèse sur gel en 2 dimensions et l’immunotransfert peut fournir des informations précieuses sur la présence de complexes protéiques. Ici, les échantillons ont d’abord été dissociés selon la taille des complexes protéiques, puis dénaturés de sorte que chaque protéine individuelle dans le complexe pourrait être séparée par leur taille individuelle. Des anticorps pour trois protéines différentes montrent trois complexes uniques contenant différentes quantités de ces protéines dans chaque complexe arrangé selon une ligne verticale. La colonne la plus à gauche contient des bêta-2 et MCP-21, ainsi qu’une autre protéine non représentée par ces marqueurs. La colonne du centre représente un complexe qui contient les 3 protéines, et la colonne de droite ne contient que bêta-2 et MCP-21.

L’immunotransfert peut également être utilisé pour visualiser les interactions protéine-protéine. Ceci est réalisé d’abord par le transfert de protéines à partir d’un gel sur une membrane de nitrocellulose, puis par le sondage de la membrane avec des protéines supplémentaires. L’immunotransfert est ensuite utilisé pour détecter si les protéines ajoutées ont formées des complexes avec l’une des protéines qui ont été immobilisées sur la membrane.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’immunotransfert. Vous devriez maintenant comprendre comment transférer des protéines sur une membrane, investiguer la membrane avec des anticorps, et détecter le signal. Comme toujours, merci pour votre attention!

Transcript

Western Blotting is a powerful technique utilized by many researchers to identify the presence of specific proteins in an electrophoretically-separated sample using antibodies.

There are 3 principal stages of this technique that are essential for a quality outcome: Electroblotting, Immunoblotting, and Detection. Before these stages are attempted, SDS-PAGE, in which denatured proteins are separated by size in a polyacrylamide gel, must be performed.

Electroblotting, is also known as the Western “transfer” and requires a transfer cassette for holding together the “sandwich” as well as an apparatus for transferring protein from an acrylimide gel to a thin membrane. The electroblotting sandwich consists of the gel and a specialized membrane, sandwiched between two pieces of filter paper. During the transfer, an electric field is used, to move the proteins through the gel, where they become trapped on a membrane due to charged and hydrophobic interactions.

Immunoblotting uses antibodies to “probe” the membrane for specific proteins. Antibodies are large Y-shaped proteins that contain two fragments, also known as Fab regions, which bind to other proteins. The Fab region defines the specific epitope, or specific portion of a protein, to which an antibody will bind.

Monoclonal antibodies are antibodies that recognize a single epitope and are the preferred antibody type used for immunoblotting due to their specificity. In contrast, polyclonal antibodies are a series of different antibodies that target many epitopes on the same antigen – or protein for which an antibody has specificity. Monoclonal antibodies that recognize a linear epitope are preferred as that ensures the epitope can be found on a denatured, or linearized, protein. This is important because many antibodies only recognize conformational epitopes, which means that they recognize proteins in their native 3D state only.

In addition to Fab fragments, antibodies contain an Fc region, which is specific to the animal that produced the antibody. In immunoblotting, this region is mainly utilized as the epitope for a secondary antibody – an antibody which recognizes the first antibody that has bound to the protein you’re trying to detect.

In order to produce an observable signal, antibodies are often linked, through their Fc region, to a reporter enzyme, such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. These reporter enzymes produce signals by reacting with substrates to cause color changes or produce light changes.

These changes can then be quantified using densitometry. Densitometry is the technique used to measure the density of a protein band using image analysis software to calculate the density of each band. The bands can then be directly quantified using reference standards or internally controlled using a control sample.

For a successful Western transfer, the gel is first equilibrated in transfer buffer for 15 minutes. The membrane should also be equilibrated according to manufactures instructions.

Next, the gel transfer sandwich is carefully prepared in transfer buffer to prevent bubbles from being trapped within the system. Bubbles trapped in the sandwich can be forced out by rolling over them with a small pipette. Even small bubbles can interrupt the transfer of proteins causing incomplete transfer as can be seen on the lower parts of this membrane.

Once assembled, additional transfer buffer is poured into the transfer chamber and it is run at 20-30 mA for 2-3 hours. Transfer buffer contains methanol, which enhances the binding of the proteins to the membrane.

Once the transfer is complete the cassette is disassembled and the quality of the transfer can be checked using a non-specific protein stain such as Ponceau S. This offers a quick and reversible detection of protein bands.

The first step of immunoblotting is to cover the remaining areas of the membrane with a dilute solution of proteins. This step is called blocking and is performed, in order to block the membrane and reduce the nonspecific binding of the antibody to the membrane. Typically, the blocking solution consists of either bovine serum albumin or non-fat dry milk dissolved in a buffered saline solution. This step is usually done for 1 hour to overnight on a shaker.

The next step is to incubate the membrane with the primary antibody diluted in the blocking solution. This step can take from 30 minutes to overnight and should be performed with gentle agitation.

Then, the membrane is thoroughly rinsed to reduce nonspecific background staining and the secondary antibody is added in blocking buffer to the membrane. After a short incubation, the membrane is again thoroughly rinsed.

Secondary antibodies are detectable thanks to the reporter enzymes that are tethered to them. Upon addition of the correct substrate, colorimetric or chemiluminescent changes can be imaged and then measured using densitometry techniques. In addition, the protein ladder provides a valuable size reference so that each protein’s linear size can be estimated based on how far it has migrated in the gel relative to the size markers in the ladder. Observing the size of proteins detected via immunoblotting is a good way to verify that the antibody is recognizing the correct protein and whether it is a monomer or a multiple copies of the protein that are being seen.

There are thousands of commercially available primary antibodies, which allows for the detection and quantification of specific proteins within a sample. Here a researcher uses an antibody for HIF-1α to measure the amount of this oxygen responsive transcription factor in cell cultures to screen for hypoxia. They also used an antibody for beta-actin to act as a loading control. As you can see, the cells cultured in normal oxygen conditions produced far less HIF-1 than those cultured in low oxygen conditions.

The combination of 2D gel electrophoresis and immunoblotting can provide valuable information into the presence of protein complexes. Here, samples were first run by protein complex size, and then denatured so each individual protein in the complex could be separated by their individual size. Antibodies for three different proteins show three unique complexes containing different numbers of these proteins with each complex arranged in a vertical line. The left most column contains beta-2 and MCP-21, as well as another protein not shown by these markers. The center column shows a complex that contained all 3 proteins, and the right column contained only beta-2 and MCP-21.

Immunoblotting can also be used to visualize protein-protein interactions. This is performed by first transferring proteins from a gel onto a nitrocellulose membrane and then probing that membrane with additional proteins. Immunoblotting is then used to detect the if the added proteins complexed with any of the proteins that were immobilized on the membrane.

You’ve just watched JoVE’s video on immunoblotting. You should now understand how to transfer proteins to a membrane, probe the membrane with antibodies, and detect the signal. As always, thanks for watching!

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