Une méthodologie décellularisation pour la production d'un naturel acellulaire intestinale Matrice

L’objectif global de cette procédure est de créer un échafaudage acellulaire naturel pour l’ingénierie des tissus intestinaux. Ceci est accompli par la canulation d’abord, une artère mésentérique supérieure ou SMA, et le prélèvement de l’intestin grêle avec l’accès vasculaire. Dans la deuxième étape, les débris intraluminaux sont lavés et les canules intraluminales et vasculaires sont connectées à une pompe péristaltique.

Ensuite, l’intestin grêle est perfusé avec de l’eau désionisée pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Dans la dernière étape, l’intestin grêle est perfusé avec du désoxy de sodium, du coate et de l’ADN à température ambiante. En fin de compte, la décellularisation complète de l’intestin grêle, ainsi que son architecture et ses composants, peuvent être visualisés respectivement par histologie et microscopie électronique.

Nous sommes actuellement confrontés au problème clinique de l’insuffisance intestinale, une maladie dévastatrice qui touche aussi bien les enfants que les adultes. La nutrition parentale et la transplantation conventionnelle n’apportent pas une guérison complète. La production d’un échafaudage intestinal vascularisé tridimensionnel, comme démontré dans la vidéo suivante, s’étend vers le traitement de l’insuffisance intestinale.

Ce qui est remarquable avec cette technique, c’est que l’utilisation de produits chimiques de numérisation doux préserve la microarchitecture intestinale, comme en témoignent les résultats du microscope électronique. De plus, le maintien d’un réseau vasculaire hiérarchique suivant la civilisation permet l’ensemencement d’une structure qui peut être reconnectée à l’hôte. Approvisionnement en sang Commencez par installer une pompe péristaltique avec deux tubes, puis faites passer de l’éthanol à 70 % dans les tubes de la pompe péristaltique pendant 15 minutes à vitesse maximale, suivi d’un PBS AA fraîchement préparé pendant 15 minutes supplémentaires.

Après avoir rincé la pompe, vaporisez et essuyez l’abdomen d’un rat spra dolly euthanasié de 250 à 350 grammes avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, à l’aide d’instruments chirurgicaux stérilisés en autoclave, effectuez une incision de laparotomie pubienne XO sur l’abdomen pour assurer un champ chirurgical dégagé et éviscérez l’intestin grêle du côté droit de l’animal sur une serviette en papier vaporisée avec de l’éthanol à 70 %. Veillez à mouiller continuellement l’intestin avec du P-B-S-A-A pour éviter la déshydratation des tissus et la dénaturation de la matrice extracellulaire.

Ensuite, localisez l’AS, qui se forme à un angle de 90 degrés de l’aorte vers l’intestin. Placez une suture autour de l’AMP et préparez un nœud. Utilisez une canule de calibre 27 pour pénétrer dans l’ALE par l’aorte, puis retirez rapidement l’aiguille pour éviter de déchirer la paroi du vaisseau.

Avancez maintenant le tube en plastique de la canule dans le SMA, en fixant le tube avec des sutures Vicryl five oh, puis injectez 10 millilitres de P-B-S-A-A pour confirmer la canulation. Ensuite, utilisez des ciseaux pour inciser l’aorte proximale et distale à l’amyotrophie mobile afin de libérer la canule afin d’éviter les fuites de matières fécales lors de la dissection du gros intestin, placez un nœud de suture en soie cinq oh sur l’extrémité proximale de la jonction iléo-caecale et un à l’extrémité distale du côlon sigmoïde. Coupez ensuite l’iléon terminal et le côlon entre les deux nœuds et retirez le gros intestin.

Maintenant, coupez l’intestin grêle à la jonction Juno duodénale et libérez l’intestin de toute connexion de tissu conjonctif qu’il pourrait avoir avec l’abdomen. Transférez l’intestin grêle dans une boîte de Pétri contenant du PBS aa. Ensuite, utilisez une pipette postérieure en plastique pour canuler la section proximale de l’intestin, en la fixant en place avec des sutures.

Enfin, coupez la pipette de manière à ce qu’elle s’adapte au verrou de leurre d’une seringue de 60 millilitres, puis rincez la lumière intestinale avec deux lavages de 60 millilitres de P-B-S-A-A pour éliminer les excréments et les débris Avant de commencer le processus de décellularisation, assurez-vous qu’aucune bulle n’est présente dans la lumière intestinale et les canules vasculaires. Connectez ensuite un robinet d’arrêt à trois voies à la canule vasculaire et placez la boîte de Pétri dans un récipient pour recueillir toute solution débordante. Ensuite, commencez à faire couler de l’eau désionisée à travers la pompe à rouleau à vitesse variable master flex LS à 0,6 millilitre par heure.

Manipulez le tissu avec précaution pour vous assurer que les bulles sortent de l’extrémité distale. Une fois que toutes les bulles ont été retirées des canules, transférez l’appareil dans la chambre froide. Ensuite, commencez le processus de décellularisation en perfusant à la fois la lumière intestinale et l’arbre vasculaire avec de l’eau désionisée courante pendant 24 heures à 0,6 millilitre par heure pendant la première heure.

Vérifiez régulièrement l’appareil pour vous assurer que toutes les connexions sont sécurisées. Les fuites sont minimes et il n’y a pas de bulles dans l’intestin. Après 24 heures, ramenez l’appareil de décellularisation à température ambiante.

La couleur de l’intestin aurait dû passer à un rose clair sous une cagoule d’aspiration. Pesez suffisamment de désoxy de sodium pour faire une solution à 4 % dans 300 millilitres d’eau désionisée. Utilisez un vortex pour mélanger la solution jusqu’à ce qu’elle soit claire.

Maintenant, remplacez la solution désionisée par le désoxy de sodium. Vérifiez les connexions. Retirez toutes les bulles et perfuser l’intestin grêle à raison de 0,6 millilitre par heure pendant quatre heures.

Après l’étape de compilation du désoxy de sodium, le tissu devient transparent. Le maintien du réseau vasculaire devient également apparent après l’ajout de PBS AA à la pompe. Lavez l’intestin avec du PBS AA pendant 30 pour éviter toute interaction entre le désoxy de sodium, le coate et l’ADN.

Ensuite, perfuser le tissu avec des ADN fraîchement préparés, un à température ambiante à une vitesse de 0,6 millilitre par heure. Après trois heures, transférez l’échafaudage dans une hotte de culture tissulaire et, à l’aide d’une technique septique, changez la plaque. Stérilisez à nouveau le tube de la pompe péristaltique en faisant passer de l’éthanol à travers.

Lavez l’intestin une dernière fois avec du P-B-S-A-A pendant 30 minutes pour vous assurer que tous les restes des solutions de décellularisation sont éliminés. Enfin, transférez l’échafaudage sur un réticulant UV et exécutez deux cycles de stérilisation. Rangez ensuite l’échafaudage dans P-B-S-A-A.

Changer la solution tous les trois jours. Une fois la décellularisation réussie, l’échafaudage doit avoir un aspect macroscopique similaire à celui de l’intestin natif, mais avec des parois translucides. La préservation de la macro-architecture devrait également être évidente par la perméabilité de l’arbre vasculaire.

Lorsque le colorant est injecté à travers la canule SMA, il doit se répartir uniformément dans tout l’échafaudage et atteindre l’arbre capillaire. L’échafaudage doit être exempt de matières nucléaires et cytoplasmiques, ce qui peut être évalué. À l’aide d’un kit de quantification de l’ADN et d’une simple analyse histologique, la coloration à l’hématine et à l’éoïne devrait démontrer une absence de matériel nucléaire et cytoplasmique tout en préservant les couches de l’intestin grêle comme le montre cette image.

En particulier, le maintien des villosités et des crips du côté luminal devrait être évident après la microscopie électronique à balayage. Une conservation supplémentaire des composants de la matrice extracellulaire tels que le collagène, l’élastine et les glycanes de glyco Amin doit également être attendue, comme indiqué ici. Par exemple, la coloration Massen Tri CHRO permet de mettre en évidence le tissu conjonctif intact dans l’échafaudage.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer l’échafaudage intestinal cellulaire naturel.