Génération de Arenavirus recombinant pour le développement de vaccins approuvés par la FDA des cellules Vero

L’objectif global de cette procédure est de démontrer un protocole simple et hautement reproductible pour la génération de virus d’arène recombinants dans des cellules Vero approuvées par la FDA pour le développement potentiel d’un vaccin ou d’un vecteur vaccinal. Ceci est accompli en préparant d’abord soigneusement le mélange de transfection d’ADN plasmidique. La deuxième étape consiste à transfecter les cellules Vero avec le mélange de transfection d’ADN plasmidique.

Ensuite, il est nécessaire de mettre à l’échelle les cellules transfectées dans des paraboles de 100 millimètres. En fin de compte, la dernière étape consiste à confirmer le succès d’un sauvetage du virus par immunofluorescence à l’aide d’un virus de type sauvage ou d’une microscopie à bifluorescence et l’expression de la luciférase GIA à l’aide d’un virus tris segmenté par rapport aux méthodes existantes telles que les sauvetages et les lignées cellulaires de rine. Ce protocole génère des virus rénaux dans les cellules Vero, qui sont approuvées par la FDA pour le développement de vaccins.

En plus de la génération de semences vaccinales potentielles, le gène exprimant le virus trisegmenté peut également être utilisé pour l’identification d’antiviraux contre les VIR dans les cribles à débit de tête sans qu’il soit nécessaire de recourir à des tests secondaires pour la détection virale. Tout d’abord, préparez 250 microlitres de milieu optimal et, selon le virus, récupérez 10 à 12 microgrammes de lipo 2000 par transfection et incubez pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, préparez le mélange de transfection de plasma dans un microtube de centrifugation séparé en utilisant les quantités recommandées pour chaque sauvetage de virus.

Amenez le volume final à 50 microlitres avec optimum. Ensuite, à 250 microlitres du mélange lipo optimal, dans le mélange de transfection d’ADN plasmatique, incubez pendant 20 minutes à température ambiante. Pour préparer les cellules Vero à s’équilibrer, le milieu P-B-S-D-M-E-M 10 %FBS 1 %PS et le mélange trypsine EDTA à 37 degrés Celsius pour récolter le bureau des cellules, laver les cultures deux fois avec cinq millilitres de PBS.

Ajoutez ensuite un millilitre de trypsine EDTA pour le détachement des cellules si nécessaire, tapotez doucement pour détacher complètement les cellules. Maintenant, mettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de DMEM complet dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 1000 tr/min et suspendez les cellules dans 10 millilitres de DMEM complet.

Comptez les cellules et ajustez la concentration à une fois 10 à six cellules par millilitre. Après l’incubation de 20 à 30 minutes à température ambiante, ajoutez un millilitre de cellules Vero au mélange optimal de lemine, de plasmide d’ADN et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Grainez maintenant le mélange de cellules d’ADN lipo dans six plaques de puits.

Secouez doucement puis placez dans l’incubateur. Après 16 à 24 heures, après la transfection, retirez le milieu de transfection et ajoutez deux millilitres de culture de milieu infectieux, les cellules pendant 48 heures supplémentaires. Après le passage, les cellules éliminent le surnageant de culture tissulaire laver deux fois avec un XPBS et la trypsine glace les cellules comme indiqué précédemment.

Ensuite, mettez les cellules en suspension dans un millilitre de DMEM complet pour granuler les cellules centrifuges pendant cinq minutes. À 5 000 tr/min et quatre degrés Celsius. Remettez soigneusement les granulés en suspension dans un millilitre de milieu infectieux et transférez les cellules dans une parabole de 100 millimètres.

Avec un milieu infectieux, porter le volume total de la plaque à huit millilitres, un volume suffisant pour éviter le dessèchement des cellules, ainsi que pour concentrer le virus. Secouez doucement la boîte de 100 millimètres pour obtenir une monocouche uniforme de cellules transfectées après la culture. Après 72 heures, collectez la centrifugeuse de surnageants de culture tissulaire pour éliminer les débris cellulaires et stockez les surnageants à moins 80 degrés Celsius la veille du titrage.

Lavez les cellules Vero deux fois avec du PBS et de la glace de trypsine. Après ressus, suspension des cellules dans 10 millilitres de DMEM complet. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la concentration à quatre fois 10 des quatre cellules par puits, puis préparez des plaques de 96 puits pour atteindre 80 à 90 % de fluidité.

Le lendemain. Secouez doucement les plaques à la main pour obtenir une répartition uniforme des cellules. Cultivez les cellules pendant la nuit le jour de l’infection.

Vérifiez les cellules au microscope pour confirmer une monocouche avant de procéder à l’infection. Maintenant, diluez en série le virus contenant des surnageants de culture tissulaire qui ont été récupérés plus tôt dans une plaque de 96 puits, puis aspirez le milieu des cellules Vero ensemencées. Lavez deux fois avec 50 microlitres de PBS et infectez les cellules avec 50 microlitres du virus dilué en série.

Infectez les cellules pendant une heure et demie à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, retirez l’inoculum viral à 100 microlitres de milieu infectieux par puits et incubez les cellules pendant 16 à 18 heures. Retirez maintenant les surnageants de culture tissulaire de chacun.

Bien fixer les cellules avec 4 % de formaldéhyde dilué dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Retirez ensuite le formaldéhyde et perméase avec 0,1 % de trite X 100 à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez la solution de perméation et lavez-la trois fois avec 100 microlitres de cellules de verrouillage PBS avec 2,5 % de sérum d’albumine bovine.

Diluer l’anticorps primaire spécifique d’une protéine d’arénavirus dans 2,5 % BSA et centrifuger pendant 15 minutes. À 3 500 tr/min, incubez les cellules avec l’anticorps pendant une heure à 37 degrés Celsius après trois lavages PBS à un anticorps secondaire conjugué fluoro quatre approprié pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez l’anticorps secondaire et lavez-le trois fois avec 100 microlitres de PBS.

Ensuite, titrez en comptant les unités fluorescentes formant des foyers à l’aide de la microscopie à fluorescence. Semblable au virus d’arène recombinant de type sauvage. Titrer le virus segmenté tric en diluant d’abord en série le virus présent dans la culture tissulaire, surnageant puis infecter les cellules Vero dans 96, plaques de puits après 16 à 18 heures d’incubation titrer en comptant les foyers fluorescents, formant des unités à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Alternativement, mesurer le sauvetage réussi du virus par l’expression de Gaia luciferase en utilisant 100 microlitres de surnageants de culture tissulaire dans une plaque blanche de 96 puits. Réglez le luminomètre selon les recommandations du fabricant. Ajoutez 50 à 100 microlitres de solution de dosage Gaia à chaque échantillon.

Mesurez ensuite l’expression du gène rapporteur de Gaia avec le luminomètre comme contrôle négatif. Mesurer l’expression de Gaia à partir du TCS de cellules infectées par le virus de type sauvage. Les virus d’arène sont des virus à ARN de sens négatif enveloppés avec des génomes bi segmentés.

Chaque segment utilise une stratégie de revêtement ambi sense pour diriger la synthèse de deux protéines virales. Dans l’orientation opposée, deux types de plasmides de secours sont utilisés pour la génération d’arénavirus recombinant dans les cellules Vero. Le plasmide d’expression de l’ACP dirige la synthèse des protéines virales L et np.

Le plasmide polymérase humaine dirige la synthèse des segments d’ARN viral. Le sauvetage réussi d’un virus d’arène recombinant de type sauvage est confirmé par la présence d’antigènes viraux à l’aide de l’IFA après 16 à 18 heures. Après l’infection des cellules Vero par culture tissulaire, les cellules surnageantes sont colorées avec des anticorps spécifiques au LCMV ou au canidé numéro un.

Dans l’arénavirus tri-segmenté sauve la polymérase humaine, un plasmide est séparé en deux plasmides dans un plasmide. NP est remplacé par la GFP et dans l’autre plasmide, le GP est remplacé par le gène Gaia. Le succès d’un sauvetage viral peut être simplement évalué en observant l’expression de la GFP par microscopie à fluorescence.

De plus, le succès du sauvetage peut être confirmé en évaluant l’expression de Gaia. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sauver à la fois les virus de type sauvage et les virus d’arène segmentés tris dans des cellules Vero à haute reproductibilité. Nous recommandons trois transfects indépendants pour chaque virus recommandé afin d’augmenter les chances de réussite de notre sauvetage, car les cellules graves ne sont pas facilement transfectées.