Name: Anticorps coloration dans C. Elegans Utilisation de gel-Cracking (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Découvrez la technique de freeze-cracking pour la coloration anticorps chez C. elegans en neurosciences. Cette méthode minimise les traitements chimiques et améliore la localisation protéique par microscopie fluorescente.

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Le financement a été fourni par la NSF CCLI # 0633618 et Université de l&#39;Ohio. Certaines souches ont été fournies par le Centre de Génétique Caenorhabditis. étudiants diplômés Reetobrata Basu apparaît dans la vidéo.

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoulin%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Duerr, J. S. Immunohistochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth%2C+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li>
<li>Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+DM+%22Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).</li>
<li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li>
<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
<li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Using+Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Using Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

L&#39;auteur déclare qu&#39;elle n&#39;a pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Le protocole de congélation-craquage est l&#39;un de plusieurs procédés pour la coloration des anticorps pour C. elegans. C&#39;est un moyen relativement simple pour colorer les vers, mais ne nécessite réactifs spécifiques et pratique pour des résultats optimaux. Les étapes critiques (décrites dans la figure 1): 1) la préparation des lames (voir les étapes 1 et 2) la compression manuelle des nématodes (voir les étapes 2 et 3) la fixation rapide (voir l&#39;étape 3). Tout d&#39;abord, afin de ma...

Pour déterminer la localisation cellulaire et subcellulaire des protéines, les scientifiques ont toujours marqué les tissus avec des anticorps sélectionnés de reconnaître spécifiquement des protéines particulières 1. Dans certains organismes modèles tels que C. elegans, la coloration des anticorps a souvent été remplacé par des techniques génétiques moléculaires, qui donnent des résultats plus rapidement. Ceux-ci comprennent les organismes transformants avec des constructions, comprenant des fusions de gène entre le promoteur et les régions codantes du gène d&#39;intérêt et la protéine fluorescente verte. Cependant, les techniques moléculaires sont soumis à un certain nombre d&#39;objets, y compris les problèmes de connaître le véritable promoteur et changements dans l&#39;expression des constructions à grand nombre de copies (les techniques habituelles chez C. elegans) 2,3. Par conséquent, la coloration avec des anticorps demeure un objectif pour de nombreux scientifiques étudient la fonction des protéines in vivo. La coloration des tissus avec des anticorps peut être difficile, car untibodies ne peuvent reconnaître leur antigène dans une conformation particulière 1. Par exemple, les anticorps peuvent reconnaître que l&#39;antigène dénaturé ou intact fixe d&#39;une manière particulière et peuvent ne pas reconnaître l&#39;antigène in situ. Le problème de la coloration des anticorps chez les nématodes est exacerbé par le fait que la cuticule du nématode forme une barrière relativement imperméable, le blocage de l&#39;accès des anticorps aux tissus. Il existe plusieurs méthodes différentes utilisées pour la coloration des anticorps à C. elegans (revue dans nos travaux précédents 4). Pour colorer intactes »vers,« méthodes ont été développées pour geler et dégeler dans un fixateur relativement dur (formaldéhyde ou glutaraldéhyde), les cycles de gel-dégel contribuent à fissurer la cuticule pour permettre la pénétration rapide du fixateur 5. Après fixation, la cuticule a été perméabilisées pour permettre la pénétration de l&#39;anticorps; méthodes comprenaient le traitement avec des agents, la collagénase, ou les deux 5-7 réduire. Ces Treatments conservés morphologie, mais souvent réduites ou détruites reconnaissance d&#39;anticorps. Méthodes alternatives incluent dissection 8 pour permettre la pénétration d&#39;anticorps. &quot;Freeze-craquage&quot; est un moyen d&#39;accéder à l&#39;intérieur de la semi-ver intact pour permettre anticorps coloration 9-10. Cryo-craquage peut être effectuée avec une variété de conditions de fixation, tout en évitant des traitements de la collagénase et de réduction. Les nématodes sont placés entre deux lames d&#39;adhésifs, congelés, puis les lames sont séparées, laissant la plupart des nématodes sur la lame de fond et beaucoup de la cuticule sur la lame supérieure. La glissière inférieure peut être placée dans un fixateur et le coulisseau avec l&#39;ensemble de nématodes adhéré est transférée à travers la procédure de coloration à l&#39;anticorps. La méthode ne présentent deux difficultés majeures. Premièrement, il est difficile d&#39;appliquer la bonne quantité de pression nécessaire pour séparer les nématodes sans les déformer sérieusement. Deuxièmement, bon nombre des vers ne sera pas scocher soit diapositive, et sera perdu dans le fixateur ou rinçages. Cependant, avec les diapositives et les pratiques appropriées, la méthode donnera rapidement nématodes morphologie raisonnable qui peut être utilisé avec une grande variété de fixateurs et des anticorps. Le procédé peut faire varier légèrement, en fonction de l&#39;objectif de l&#39;expérimentateur. Si la coloration des nématodes est désirée (par exemple, pour déterminer si un seul transformant a modifié la coloration des anticorps), puis glisse avec une adhérence maximale (mais supérieur coloration de fond) peut être utilisé, par exemple sous forme de diapositives préparés en laboratoire avec polylysine supplémentaire (voir ci-dessous). Pour le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde fixation, les lames d&#39;adhésion plus élevés (diapositives polylysine préparés en laboratoire) doivent être utilisés, car les nématodes adhèrent plus mal à la polylysine après ces fixations. Si les nématodes de type sauvage sont fixées avec du méthanol et / ou de l&#39;acétone, puis glisse avec une adhérence plus en plus bas bruit de fond doit être utilisé (commercial ou ldiapositives aboratory préparé). Si une variété d&#39;anticorps et fixateurs sont utilisés dans le laboratoire, une sélection de diapositives peut être préparé à l&#39;avance et stocké jusqu&#39;à son utilisation. Après avoir accès au tissu de nématodes a été gagné, les procédures de coloration anticorps suivent des méthodes standard (avec de plus longues incubations caractéristiques des tissus plutôt que des cellules 1,11).

<table><tbody><tr><td>lame de poly-L-lysine (marque ESCO)</td><td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>Les lames de marque Sigma conviennent également au</td></tr><tr><td>bromhydrate de poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td>IMPORTANT : Marque et poids moléculaire élevé des lames critiques en polylysine</td></tr><tr><td>à bord unique givré</td><td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>D’autres marques conviennent à</td></tr><tr><td>l’azoture de sodium</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>TOXIQUE, portez des gants et un masque tout en pesant la poudre pour faire 10 % de stock. Porter des gants lors de la tuyauterie</td></tr> du <tr><td>pot de coloration de la solution mère coplin</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr><tr><td>Enveloppe à 5 lames</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>71549-01</td><td>L’une des nombreuses marques différentes de support de petites lames, adapté à la coloration</td></tr><tr><td>du paraformaldéhyde</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><fort>IMPORTANT :</fort> Les solutions de formol régulières (37 % de formaldéhyde) ne conviennent PAS. Soit 1) Dissoudre la paraformaldéhyde crysatlaline dans un tampon phosphate et stocker dans de petites aliquotes congelées. Ou 2) acheter du paraformaldéhyde de qualité microscopie électronique en aliquotes. TOXIQUE -porter des gants ; Jetez l’excédent dans l’évier avec de l’eau.</td></tr><tr><td>Solution de glutaraldéhyde, 25 % dans l’eau</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td>IMPORTANT : acheter du glutaraldéhyde de qualité microscopie électronique en ampoules ; TOXIQUE -porter des gants ; Jetez l’excédent dans l’évier avec de l’eau.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr><tr><td>Sérum de bovin Albumine</td><td>Fisher</td><td>ICN820451</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr><tr><td>Sérum d’âne, lyophilisé</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr><tr><td>Cy3 Donkey anti-Souris IgG multi-marquage</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>Cette société est recommandée pour ses anticorps multi-marqueurs de haute qualité (appauvris en affinité). Sélectionnez le colorant et l’antigène appropriés (animal utilisé pour produire l’anticorps primaire). </td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Fisher</td><td>ICN10274750</td><td>D’autres marques conviennent DAPI</td></tr><tr><td>, 4',6'-diamidino-2-phénylindole</td><td>dichlorhydrate Sigma</td><td>D 9542</td><td>TOXIQUE. Portez des gants et distribuez en petites aliquotes et feeze pour minimiser l’exposition</td></tr><tr><td>Whatman #1 Filtres de 15 cm de diamètre</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 l’épaisseur est optiquement la meilleure</td></tr><tr><td>Chemise de lames de microscope</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr></tbody></table>

anticorps coloration dans<em&gt; c. elegans</em&gt; utilisation de «gel-cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Pour colorer C. elegans avec des anticorps, la cuticule relativement imperméable doivent être contournés par des méthodes chimiques ou mécaniques. &quot;Freeze-craquage&quot; est une méthode utilisée pour tirer physiquement la cuticule de nématodes en comprimant les nématodes entre deux lames adhérentes, les congeler, et en tirant les diapositives en dehors. Cryo-craquage fournit un moyen simple et rapide pour accéder à des tissus, sans traitement chimique et peut être utilisé avec une variété de fixateurs. Toutefois, elle conduit à la perte d&#39;un grand nombre de spécimens et la compression requise déforme mécaniquement l&#39;échantillon. La pratique est nécessaire pour maximiser la récupération d&#39;échantillons avec une bonne morphologie. Cryo-craquage peut être optimisée pour les conditions spécifiques de fixation, la récupération d&#39;échantillons, ou faible coloration non-spécifique, mais pas pour tous les paramètres à la fois. Pour les anticorps qui requièrent des conditions de fixation très durs et tolèrent les traitements chimiques nécessaires pour perméabiliser chimiquement la cuticule, traitement de nématodes intactes en solution peut être préférée. Si l&#39;anticorps nécessite une solution claire ou plus si les conditions optimales de fixation ne sont pas connus, de gel-craquage est un moyen très utile pour doser rapidement l&#39;anticorps et peuvent donner des informations spécifiques de localisation subcellulaire et cellulaire de l&#39;antigène d&#39;intérêt.

Lorsque les vers sont bien compressés, fissuré, et légèrement fixés, la quasi-totalité ver peut être accessible à la coloration des anticorps (voir la figure 2). La localisation des noyaux, comme indiqué par la coloration DAPI indique quelles parties de la vis sans fin sont intacts Lorsque les vers sont soumis à un fixateur plus dur, tel que le formaldehyde, la morphologie de la vis sans fin peut être déformée (comme montré par l&#39;apparition anormalement ondulé de l&#39; muscles dans les figu...

&quot;Freeze-fissuration,&quot; une méthode pour exposer les tissus internes du nématode C. elegans aux anticorps pour la localisation des protéines, est démontrée.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une coloration par anticorps sur C. elegans. Pour ce faire, les nématodes sont rincés, étalés sur des lames et soigneusement comprimés entre deux lames adhésives, puis congelés sur de la glace sèche. Ensuite, les lames sont séparées afin de rompre les nématodes et immédiatement placées dans un fixateur.Les nématodes sont ensuite colorés en utilisant des techniques standard de coloration par anticorps. L'analyse par microscopie fluorescente révèle une coloration réussie des nématodes semi-intacts par les anticorps. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la fixation de nématodes intacts, est qu'elle minimise le traitement chimique de l'échantillon. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la préparation des lames et des nématodes est quelque peu délicate à mettre en œuvre.La procédure sera réalisée par moi-même et RTO Basu, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour préparer des lames de nématodes destinées à une coloration, commencez par placer une pièce métallique plate sur de la glace sèche afin de la refroidir, puis rincez-la avec de

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