Anticorps coloration dans C. Elegans Utilisation de «gel-Cracking"

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une coloration par anticorps sur C elegance. Pour ce faire, les nématodes sont rincés, étalés sur des lames et soigneusement compressés entre deux lames adhésives, qui sont ensuite congelées sur de la glace carbonique. Ensuite, les lames sont séparées pour ouvrir les nématodes et immédiatement placées dans un fixateur.

Les nématodes sont ensuite colorés à l’aide d’anticorps standard. L’analyse des techniques de coloration par microscopie fluorescente révèle une coloration réussie des nématodes semi-intacts. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la fixation de nématodes intacts est qu’elle minimise le traitement chimique de l’échantillon. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à le faire, car la préparation des lames et des nématodes est quelque peu difficile à démontrer.

La procédure sera prise en main par moi-même et RTO Basu, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour préparer des plaques de nématodes pour la coloration, commencez par placer un morceau de métal plat sur de la glace sèche pour le refroidir à l’aide d’eau distillée et d’un rinçage à pipette en verre. Des vers cultivés sur une plaque NGM de 60 millimètres avec des bactéries dans un tube de micro-fuge de 1,5 millilitre. Les vers peuvent être synchronisés ou d’âges mélangés, mais évitez d’utiliser des plaques avec de nombreux douaires difficiles à casser ou des vers affamés, ce qui augmentera l’autofluorescence en utilisant la même pipette en verre.

Rincez les vers trois à quatre fois avec de l’eau distillée pour les débarrasser des bactéries. Ensuite, pour recueillir principalement des adultes, laissez-les s’asseoir sur le banc pendant trois à cinq minutes. Une fois que les vers se sont déposés au fond du tube, retirez la majeure partie de l’eau du tube, en laissant environ deux fois le volume d’eau des vers, mais au moins 25 microlitres de volume total.

Étiquetez le côté givré des lames en polylysine avec de l’encre indélébile et placez les diapositives sur la paillasse à côté du récipient avec l’étiquette de glace sèche vers le haut. Cela servira de glissière inférieure. Avoir un nombre égal de produits propres non polylysine traités.

Diapositives supérieures disponibles. Ensuite, pipetez environ 25 microlitres de vers dans l’eau sur la lame d’adhérence inférieure et, à l’aide du côté de la pointe de la pipette, étalez les vers au centre de la lame. Laissez-les reposer pendant 30 secondes à deux minutes.

Les extrémités des vers se collent lorsqu’elles entrent en contact avec la lame. L’aspect le plus difficile de cette procédure est d’empêcher les vers de se déformer trop lorsque vous effectuez les prochaines étapes. La meilleure façon de le faire est d’être patient, d’avoir tout prêt et de ne pas boire trop de caféine pour que vos mains soient bien stables.

En tenant la glissière inférieure d’une main, placez la glissière supérieure dessus de manière à ce que toutes les pièces sauf les pièces givrées se chevauchent. Le liquide doit maintenir les lames légèrement écartées afin que les vers aient encore une certaine mobilité. Ne laissez pas les glissières glisser les unes sur les autres, ce qui tordra les vers.

Ensuite, à l’aide des pouces et de l’index de chaque main, appuyez soigneusement vers le bas sur la lame supérieure Avec la bonne quantité de pression, quelques-uns des plus grands hermaphrodites se rompront sur le bord de la lame. Bien que la plupart des adultes et des larves entrent en contact avec chaque lame, mais restent intacts immédiatement et soigneusement sans laisser les lames glisser, placez-les sur le morceau de métal sur de la glace sèche. Au bout d’une minute, les diapositives apparaîtront figées, mais gardez-les là pendant cinq minutes pour vous assurer qu’elles sont complètement gelées.

Les glissières sont maintenant prêtes à être fixées. Si ce n’est pas le cas, stockez immédiatement les lames dans une boîte étiquetée à moins 80 degrés Celsius pendant plusieurs jours. Ils doivent être utilisés dans la semaine environ suivant leur fabrication.

N’utilisez pas les lames après un stockage à long terme. Les nématodes individuels peuvent également être préparés sur des lames selon une méthode similaire à celle qui vient d’être montrée précédemment. Placez un morceau de métal plat sur de la glace sèche pour le refroidir.

Ensuite, utilisez un pic à vers pour transférer les nématodes individuels dans une goutte d’eau sur une plaque NGM pour les libérer des bactéries. Les nématodes doivent être bien nourris pour diminuer l’autofluorescence. Si possible, répétez le transfert vers de nouveaux endroits d’eau au besoin jusqu’à ce que le ver soit exempt de bactéries.

Ensuite, préparez les lames supérieure et inférieure comme précédemment. Placez ensuite une goutte de cinq à 10 microlitres d’eau sur la zone traitée à la polylysine de la lame inférieure tout en observant au microscope. Utilisez un pic à vers pour transférer jusqu’à 20 vers dans la goutte d’eau.

Les vers doivent s’enfoncer pour toucher la surface collante du toboggan. Placez ensuite la glissière supérieure comme précédemment, mais ne compressez pas tout en veillant à ce que les diapositives ne glissent pas immédiatement. Placez les lames sur le métal sur de la glace sèche.

Maintenez sur de la glace sèche pendant cinq à 30 minutes et procédez immédiatement à la fixation. Ces diapositives ne peuvent pas être stockées pour une utilisation ultérieure. Pour fixer légèrement les vers, commencez par placer des bocaux de coloration contenant des solutions de fixation sur de la glace pour les refroidir pendant 10 minutes.

Les solutions nécessaires sont 100 % méthanol, 100 % acétone et solution saline tamponnée au phosphate. Prenez une paire de lames inférieures et supérieures de la glace sèche, séparez-les rapidement et plongez immédiatement la lame inférieure dans du méthanol glacé pendant deux minutes, jetez la lame supérieure. Ensuite, transférez les lames du méthanol à l’acétone glacée pendant quatre minutes.

Si les lames avaient beaucoup de vers, la plupart d’entre eux tomberont dans le fixateur même avec des lames bien préparées. Si les lames de vers simples ont été correctement préparées, les vers doivent rester adhérents. Enfin, pour rincer le fixateur, trempez les lames dans le bocal avec du PBS.

Les lames sont maintenant prêtes pour la coloration afin d’effectuer une correction dure à l’aide de formaldéhyde ou de glutaraldéhyde. Commencez par diluer une solution de formaldéhyde ou de glutaraldéhyde de qualité réactive dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 0,5 à 4 %. Les aliquotes peuvent être stockées à moins 20 à moins 30 degrés et décongelées au besoin. N’oubliez pas que le formaldéhyde et le glutaraldéhyde sont toujours très toxiques, vous devez donc porter des gants et travailler dans une hotte.

Prenez une paire de lames inférieure et supérieure de la glace sèche et séparez-les rapidement et séparez-les immédiatement. Placez la lame inférieure qui a les vers dans un plat plat avec couvercle, jetez immédiatement la lame supérieure pipetez 200 microlitres du fixateur sur le centre de la zone de la lame. Avec les vers, le fixateur gèlera partiellement sur place, puis fondra pour couvrir une plus grande région de la lame.

Si les vers ne sont pas totalement recouverts de fixateur immédiatement et soigneusement, ajoutez plus de fixateur à l’aide d’une micro-pipette. Ne laissez pas le fixateur couler sur le bord de la lame. Ajoutez des lingettes humides non pelucheuses pliées au plat pour le garder humidifié.

Ne laissez pas les lingettes toucher les diapositives. Ensuite, couvrez le plat avec un couvercle et laissez-le pendant 10 minutes toute la nuit à température ambiante une fois la fixation terminée, utilisez une pipette pour transférer soigneusement le fixateur avec des vers lâches dans un tube de 1,5 millilitre. Trempez ensuite la lame dans un bocal colorant contenant du PBS.

Faites tourner le tube contenant les vers à grande vitesse pendant 30 secondes pour les granuler. Rincez les vers deux fois avec du PBS. Ensuite, procédez à leur coloration en parallèle avec les vers sur la lame.

Le protocole de coloration des anticorps est similaire aux protocoles standard pour tous les tissus sur les lames et est décrit en détail dans le document d’accompagnement. Après la coloration, transférez les lames sur PBS et laissez-les y rester jusqu’à 12 heures à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à monter. Pour monter les diapositives, retirez une diapositive du PBS.

Utilisez une lingette non pelucheuse pour sécher le dos, puis placez-le brièvement sur une serviette en papier rapidement. Placez environ 20 microlitres de milieu de montage sur les vers de sorte qu’il y ait des parties à peu près égales de milieu et de PBS. Sur la diapositive.

Inclinez doucement la glissière pour mélanger les deux solutions. Attention : le support de montage est toxique. Tenir le bord givré.

Inclinez la glissière de manière à ce que la solution s’accumule près du glaçage. Placez ensuite un bord d’une lamelle de 24 x 60 millimètres sur la solution pour minimiser les bulles d’air qui augmentent le blanchiment et perturbent la visualisation. Abaissez doucement la glissière de couverture.

Si des bulles se forment, soulevez lentement le bord de la lamelle. Ensuite, sans glisser sur les vers, abaissez-le. Ajoutez plus de PBS si nécessaire pour éliminer les bulles d’air.

À l’aide d’une lingette non pelucheuse, compressez les bords de la lamelle et faites-la glisser avec précaution pour sécher le bord. Le bord de la glissière doit être visible tout autour du bord de la lamelle et ne doit pas être trop humide. Scellez la lamelle et appliquez deux à trois couches de vernis à ongles sur le bord.

Une fois que la diapositive est bien scellée et sèche, nettoyez la lamelle de recouvrement et le dos de la diapositive et placez-la dans un puits de support de diapositive. Les lames scellées peuvent être conservées plusieurs jours à quatre degrés Celsius ou des semaines à moins 20 degrés Celsius sur de plus longues périodes. Les taches d’ADN et la plupart des colorants verts s’estompent, refermez la lamelle avec plus de vernis à ongles si nécessaire, en particulier après avoir utilisé une lentille à immersion dans l’huile.

Les images représentatives suivantes ont été recueillies à l’aide de lames réalisées lors des premières tentatives de coloration d’anticorps d’étudiants de premier cycle dans un cours de laboratoire de biologie cellulaire. Cette image montre un exemple de têtes de deux hermaphrodites adultes qui sont correctement comprimées, fissurées et légèrement fixées avec de l’acétone de méthanol. Ils ont été marqués avec plusieurs anticorps et colorants.

Dans ce cas, la quasi-totalité du ver est accessible aux anticorps. Coloration ici, l’emplacement des noyaux tel qu’indiqué par la coloration DPI indique quelles parties du ver sont intactes. Lorsque les vers sont soumis à un fixateur plus dur tel que le formaldéhyde, la morphologie du ver peut être déformée.

Cela peut être vu sur ces images comme une apparition ondulée des muscles montrés en rouge. Un autre problème courant associé à l’utilisation de fixateurs plus durs est la fixation inégale ou la pénétration de tissus particuliers. On peut le voir ici où le muscle indiqué en rouge n’est coloré que dans une partie du ver.

Ici, la présence d’autres taches, y compris l’ADN, indiquée en bleu indique qu’au moins une partie du corps était présente. Le modèle de coloration partielle qui en résulte peut être facilement identifié avec la pratique, de sorte que la distribution complète de la coloration peut être déterminée même si un seul ver présente une coloration inégale. Les problèmes courants rencontrés avec la fissuration par congélation en utilisant n’importe quelle condition de fixation sont illustrés ici.

Le problème le plus courant est la torsion de l’échantillon en raison du mouvement relatif des deux lames. Lors de la compression Ici, la morphologie des tissus colorés indique que le corps du ver est tordu juste en arrière du pharynx. Cette image montre également le problème de coloration de fond due à l’adhérence des anticorps à la polylysine recouvrant la lame.

Cela peut être évité en utilisant le microscope confocal. Notez que même avec de la pratique, de nombreux vers individuels seront perdus ou présenteront certains des problèmes présentés ici. Une fois maîtrisés, la préparation et la fixation peuvent se faire en une heure et la coloration peut se faire en une journée.

À la suite de cette procédure, diverses méthodes de fixation peuvent être mises en œuvre afin d’optimiser la coloration d’un anticorps et d’un tissu donnés.