Name: Anticorps coloration dans C. Elegans Utilisation de gel-Cracking (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Découvrez la technique de freeze-cracking pour la coloration anticorps chez C. elegans en neurosciences. Cette méthode minimise les traitements chimiques et améliore la localisation protéique par microscopie fluorescente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le financement a été fourni par la NSF CCLI # 0633618 et Université de l&#39;Ohio. Certaines souches ont été fournies par le Centre de Génétique Caenorhabditis. étudiants diplômés Reetobrata Basu apparaît dans la vidéo.

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoulin%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Duerr, J. S. Immunohistochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth%2C+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li>
<li>Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+DM+%22Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).</li>
<li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li>
<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
<li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Using+Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Using Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

L&#39;auteur déclare qu&#39;elle n&#39;a pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Le protocole de congélation-craquage est l&#39;un de plusieurs procédés pour la coloration des anticorps pour C. elegans. C&#39;est un moyen relativement simple pour colorer les vers, mais ne nécessite réactifs spécifiques et pratique pour des résultats optimaux. Les étapes critiques (décrites dans la figure 1): 1) la préparation des lames (voir les étapes 1 et 2) la compression manuelle des nématodes (voir les étapes 2 et 3) la fixation rapide (voir l&#39;étape 3). Tout d&#39;abord, afin de ma...

Pour déterminer la localisation cellulaire et subcellulaire des protéines, les scientifiques ont toujours marqué les tissus avec des anticorps sélectionnés de reconnaître spécifiquement des protéines particulières 1. Dans certains organismes modèles tels que C. elegans, la coloration des anticorps a souvent été remplacé par des techniques génétiques moléculaires, qui donnent des résultats plus rapidement. Ceux-ci comprennent les organismes transformants avec des constructions, comprenant des fusions de gène entre le promoteur et les régions codantes du gène d&#39;intérêt et la protéine fluorescente verte. Cependant, les techniques moléculaires sont soumis à un certain nombre d&#39;objets, y compris les problèmes de connaître le véritable promoteur et changements dans l&#39;expression des constructions à grand nombre de copies (les techniques habituelles chez C. elegans) 2,3. Par conséquent, la coloration avec des anticorps demeure un objectif pour de nombreux scientifiques étudient la fonction des protéines in vivo. La coloration des tissus avec des anticorps peut être difficile, car untibodies ne peuvent reconnaître leur antigène dans une conformation particulière 1. Par exemple, les anticorps peuvent reconnaître que l&#39;antigène dénaturé ou intact fixe d&#39;une manière particulière et peuvent ne pas reconnaître l&#39;antigène in situ. Le problème de la coloration des anticorps chez les nématodes est exacerbé par le fait que la cuticule du nématode forme une barrière relativement imperméable, le blocage de l&#39;accès des anticorps aux tissus. Il existe plusieurs méthodes différentes utilisées pour la coloration des anticorps à C. elegans (revue dans nos travaux précédents 4). Pour colorer intactes »vers,« méthodes ont été développées pour geler et dégeler dans un fixateur relativement dur (formaldéhyde ou glutaraldéhyde), les cycles de gel-dégel contribuent à fissurer la cuticule pour permettre la pénétration rapide du fixateur 5. Après fixation, la cuticule a été perméabilisées pour permettre la pénétration de l&#39;anticorps; méthodes comprenaient le traitement avec des agents, la collagénase, ou les deux 5-7 réduire. Ces Treatments conservés morphologie, mais souvent réduites ou détruites reconnaissance d&#39;anticorps. Méthodes alternatives incluent dissection 8 pour permettre la pénétration d&#39;anticorps. &quot;Freeze-craquage&quot; est un moyen d&#39;accéder à l&#39;intérieur de la semi-ver intact pour permettre anticorps coloration 9-10. Cryo-craquage peut être effectuée avec une variété de conditions de fixation, tout en évitant des traitements de la collagénase et de réduction. Les nématodes sont placés entre deux lames d&#39;adhésifs, congelés, puis les lames sont séparées, laissant la plupart des nématodes sur la lame de fond et beaucoup de la cuticule sur la lame supérieure. La glissière inférieure peut être placée dans un fixateur et le coulisseau avec l&#39;ensemble de nématodes adhéré est transférée à travers la procédure de coloration à l&#39;anticorps. La méthode ne présentent deux difficultés majeures. Premièrement, il est difficile d&#39;appliquer la bonne quantité de pression nécessaire pour séparer les nématodes sans les déformer sérieusement. Deuxièmement, bon nombre des vers ne sera pas scocher soit diapositive, et sera perdu dans le fixateur ou rinçages. Cependant, avec les diapositives et les pratiques appropriées, la méthode donnera rapidement nématodes morphologie raisonnable qui peut être utilisé avec une grande variété de fixateurs et des anticorps. Le procédé peut faire varier légèrement, en fonction de l&#39;objectif de l&#39;expérimentateur. Si la coloration des nématodes est désirée (par exemple, pour déterminer si un seul transformant a modifié la coloration des anticorps), puis glisse avec une adhérence maximale (mais supérieur coloration de fond) peut être utilisé, par exemple sous forme de diapositives préparés en laboratoire avec polylysine supplémentaire (voir ci-dessous). Pour le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde fixation, les lames d&#39;adhésion plus élevés (diapositives polylysine préparés en laboratoire) doivent être utilisés, car les nématodes adhèrent plus mal à la polylysine après ces fixations. Si les nématodes de type sauvage sont fixées avec du méthanol et / ou de l&#39;acétone, puis glisse avec une adhérence plus en plus bas bruit de fond doit être utilisé (commercial ou ldiapositives aboratory préparé). Si une variété d&#39;anticorps et fixateurs sont utilisés dans le laboratoire, une sélection de diapositives peut être préparé à l&#39;avance et stocké jusqu&#39;à son utilisation. Après avoir accès au tissu de nématodes a été gagné, les procédures de coloration anticorps suivent des méthodes standard (avec de plus longues incubations caractéristiques des tissus plutôt que des cellules 1,11).

<table><tbody><tr><td>lame de poly-L-lysine (marque ESCO)</td><td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>Les lames de marque Sigma conviennent également au</td></tr><tr><td>bromhydrate de poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td>IMPORTANT : Marque et poids moléculaire élevé des lames critiques en polylysine</td></tr><tr><td>à bord unique givré</td><td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>D’autres marques conviennent à</td></tr><tr><td>l’azoture de sodium</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>TOXIQUE, portez des gants et un masque tout en pesant la poudre pour faire 10 % de stock. Porter des gants lors de la tuyauterie</td></tr> du <tr><td>pot de coloration de la solution mère coplin</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr><tr><td>Enveloppe à 5 lames</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>71549-01</td><td>L’une des nombreuses marques différentes de support de petites lames, adapté à la coloration</td></tr><tr><td>du paraformaldéhyde</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><fort>IMPORTANT :</fort> Les solutions de formol régulières (37 % de formaldéhyde) ne conviennent PAS. Soit 1) Dissoudre la paraformaldéhyde crysatlaline dans un tampon phosphate et stocker dans de petites aliquotes congelées. Ou 2) acheter du paraformaldéhyde de qualité microscopie électronique en aliquotes. TOXIQUE -porter des gants ; Jetez l’excédent dans l’évier avec de l’eau.</td></tr><tr><td>Solution de glutaraldéhyde, 25 % dans l’eau</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td>IMPORTANT : acheter du glutaraldéhyde de qualité microscopie électronique en ampoules ; TOXIQUE -porter des gants ; Jetez l’excédent dans l’évier avec de l’eau.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr><tr><td>Sérum de bovin Albumine</td><td>Fisher</td><td>ICN820451</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr><tr><td>Sérum d’âne, lyophilisé</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr><tr><td>Cy3 Donkey anti-Souris IgG multi-marquage</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>Cette société est recommandée pour ses anticorps multi-marqueurs de haute qualité (appauvris en affinité). Sélectionnez le colorant et l’antigène appropriés (animal utilisé pour produire l’anticorps primaire). </td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Fisher</td><td>ICN10274750</td><td>D’autres marques conviennent DAPI</td></tr><tr><td>, 4',6'-diamidino-2-phénylindole</td><td>dichlorhydrate Sigma</td><td>D 9542</td><td>TOXIQUE. Portez des gants et distribuez en petites aliquotes et feeze pour minimiser l’exposition</td></tr><tr><td>Whatman #1 Filtres de 15 cm de diamètre</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 l’épaisseur est optiquement la meilleure</td></tr><tr><td>Chemise de lames de microscope</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>D’autres marques conviennent</td></tr></tbody></table>

anticorps coloration dans<em&gt; c. elegans</em&gt; utilisation de «gel-cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Pour colorer C. elegans avec des anticorps, la cuticule relativement imperméable doivent être contournés par des méthodes chimiques ou mécaniques. &quot;Freeze-craquage&quot; est une méthode utilisée pour tirer physiquement la cuticule de nématodes en comprimant les nématodes entre deux lames adhérentes, les congeler, et en tirant les diapositives en dehors. Cryo-craquage fournit un moyen simple et rapide pour accéder à des tissus, sans traitement chimique et peut être utilisé avec une variété de fixateurs. Toutefois, elle conduit à la perte d&#39;un grand nombre de spécimens et la compression requise déforme mécaniquement l&#39;échantillon. La pratique est nécessaire pour maximiser la récupération d&#39;échantillons avec une bonne morphologie. Cryo-craquage peut être optimisée pour les conditions spécifiques de fixation, la récupération d&#39;échantillons, ou faible coloration non-spécifique, mais pas pour tous les paramètres à la fois. Pour les anticorps qui requièrent des conditions de fixation très durs et tolèrent les traitements chimiques nécessaires pour perméabiliser chimiquement la cuticule, traitement de nématodes intactes en solution peut être préférée. Si l&#39;anticorps nécessite une solution claire ou plus si les conditions optimales de fixation ne sont pas connus, de gel-craquage est un moyen très utile pour doser rapidement l&#39;anticorps et peuvent donner des informations spécifiques de localisation subcellulaire et cellulaire de l&#39;antigène d&#39;intérêt.

Lorsque les vers sont bien compressés, fissuré, et légèrement fixés, la quasi-totalité ver peut être accessible à la coloration des anticorps (voir la figure 2). La localisation des noyaux, comme indiqué par la coloration DAPI indique quelles parties de la vis sans fin sont intacts Lorsque les vers sont soumis à un fixateur plus dur, tel que le formaldehyde, la morphologie de la vis sans fin peut être déformée (comme montré par l&#39;apparition anormalement ondulé de l&#39; muscles dans les figu...

&quot;Freeze-fissuration,&quot; une méthode pour exposer les tissus internes du nématode C. elegans aux anticorps pour la localisation des protéines, est démontrée.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une coloration par anticorps sur C. elegans. Pour ce faire, les nématodes sont rincés, étalés sur des lames et soigneusement comprimés entre deux lames adhésives, puis congelés sur de la glace sèche. Ensuite, les lames sont séparées afin de rompre les nématodes et immédiatement placées dans un fixateur.Les nématodes sont ensuite colorés en utilisant des techniques standard de coloration par anticorps. L'analyse par microscopie fluorescente révèle une coloration réussie des nématodes semi-intacts par les anticorps. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la fixation de nématodes intacts, est qu'elle minimise le traitement chimique de l'échantillon. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la préparation des lames et des nématodes est quelque peu délicate à mettre en œuvre.La procédure sera réalisée par moi-même et RTO Basu, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour préparer des lames de nématodes destinées à une coloration, commencez par placer une pièce métallique plate sur de la glace sèche afin de la refroidir, puis rincez-la avec de l'eau distillée à l'aide d'une pipette en verre. Transférez les vers cultivés sur une plaque NGM de 60 millimètres ensemencée avec des bactéries dans un tube microfuge de 1,5 millilitre. Les vers peuvent être synchronisés ou de différents âges, mais évitez d'utiliser des plaques contenant de nombreuses drosophiles, difficiles à casser, ou des vers affamés, qui augmenteraient l'autofluorescence, en utilisant la même pipette en verre.Rincez les vers trois à quatre fois avec de l'eau distillée afin de les débarrasser des bactéries. Ensuite, pour recueillir principalement des adultes, laissez-les reposer sur la paillasse pendant trois à cinq minutes. Une fois que les vers se sont déposés au fond du tube, retirez la majeure partie de l'eau du tube, en laissant un volume d'eau environ deux fois supérieur à celui des vers, mais d'au moins 25 microlitres au total.Étiquetez le côté givré des lames de polylysine à l'aide d'une encre indélébile et placez les lames sur le plan de travail à côté d'un récipient contenant de la glace sèche, le côté étiqueté vers le haut. Cela servira de lame inférieure. Prévoyez un nombre égal de lames propres non traitées au polylysine.Les lames supérieures sont disponibles. Ensuite, pipetez environ 25 microlitres de vers dans l'eau sur la lame d'adhérence inférieure et, à l'aide du côté de la pointe de la pipette, répartissez les vers au centre de la lame. Laissez-les se déposer pendant 30 secondes à deux minutes.Les extrémités des vers adhéreront lorsqu'elles entreront en contact avec la lame. L'aspect le plus délicat de cette procédure consiste à éviter que les vers ne soient trop déformés pendant les prochaines étapes. La meilleure façon d'y parvenir est de faire preuve de patience, de tout préparer à l'avance et de ne pas consommer trop de caféine afin que vos mains restent bien stables.En tenant la lame inférieure d'une main, placez la lame supérieure par-dessus de sorte que toutes les parties, sauf les parties dépolies, se chevauchent. Le liquide doit maintenir les lames légèrement écartées afin que les vers conservent une certaine mobilité. Veillez à ce que les lames ne glissent pas l'une sur l'autre, ce qui risquerait de tordre les vers.Ensuite, à l’aide des pouces et des index de chaque main, appuyez soigneusement et verticalement vers le bas sur la lame supérieure. Avec la pression adéquate, quelques-uns des hermaphrodites les plus gros se rompront au bord de la lame. Tandis que la plupart des adultes et des larves entreront en contact avec les lames sans se rompre, déposez-les immédiatement et soigneusement, sans laisser glisser les lames, sur un morceau de métal placé dans de la glace sèche. En moins d’une minute, les lames apparaîtront gelées, mais laissez-les en place pendant cinq minutes afin de garantir un gel complet.Les lames sont désormais prêtes pour la fixation. Si vous ne poursuivez pas immédiatement, conservez les lames dans une boîte étiquetée à moins 80 degrés Celsius pendant plusieurs jours. Elles doivent être utilisées dans un délai d'une semaine environ après leur préparation.Ne pas utiliser les lames après un stockage à long terme. Des nématodes individuels peuvent également être préparés sur des lames selon une méthode similaire à celle qui vient d'être montrée précédemment. Placer un morceau de métal plat sur de la glace sèche pour le refroidir.Ensuite, utilisez un curette à vers pour transférer des nématodes individuels dans une goutte d'eau sur une boîte de milieu NGM afin de les libérer des bactéries. Les nématodes doivent être bien nourris afin de réduire l'autofluorescence. Si possible, répétez le transfert vers de nouveaux points d'eau selon les besoins, jusqu'à ce que le ver soit débarrassé des bactéries.Ensuite, préparez les lames supérieure et inférieure comme précédemment. Puis, déposez une goutte d'eau de cinq à 10 microlitres sur la zone traitée au polylysine de la lame inférieure tout en observant au microscope. Utilisez un curet à vers pour transférer jusqu'à 20 vers dans la goutte d'eau.Les vers doivent descendre jusqu'à toucher la surface collante de la lame. Ensuite, placer la lame supérieure comme précédemment, sans comprimer, tout en veillant à ce que les lames ne glissent pas immédiatement. Placer les lames sur le métal placé sur de la glace sèche.Conserver sur de la glace sèche pendant cinq à 30 minutes et passer immédiatement à la fixation. Ces lames ne peuvent pas être stockées pour une utilisation ultérieure. Pour fixer légèrement les vers, commencer par placer des bocaux de coloration contenant les solutions de fixation sur de la glace afin de les refroidir pendant 10 minutes.Les solutions nécessaires sont le méthanol à 100 %, l'acétone à 100 % et le tampon salin phosphate. Prenez rapidement une paire de lames supérieure et inférieure depuis la glace sèche, séparez-les en les tournant et immergez immédiatement la lame inférieure dans du méthanol glacé pendant deux minutes, puis jetez la lame supérieure. Ensuite, transférez les lames du méthanol à l'acétone glacée pendant quatre minutes.Si les lames contenaient beaucoup de vers, la plupart tomberont dans le fixateur, même avec des lames bien préparées. Si les lames individuelles contenant un ver ont été correctement préparées, les vers doivent rester adhérents. Enfin, pour rincer le fixateur, plongez les lames dans le bocal contenant du PBS.Les lames sont désormais prêtes pour la coloration afin de réaliser une fixation rigide à l’aide de formaldéhyde ou de glutaraldéhyde. Commencez par diluer une solution de formaldéhyde ou de glutaraldéhyde de qualité réactif dans du PBS pour obtenir une concentration finale de 0,5 à 4 %. Des aliquotes peuvent être conservées entre -20 et -30 degrés et décongelées selon les besoins. N’oubliez pas que le formaldéhyde et le glutaraldéhyde sont très toxiques ; vous devez donc toujours porter des gants et travailler sous une hotte aspirante.Prenez une paire de lames inférieure et supérieure depuis la glace sèche et séparez-les rapidement par une torsion immédiate. Placez la lame inférieure, sur laquelle se trouvent les vers, dans une boîte plate avec couvercle, jetez immédiatement la lame supérieure, puis pipetez 200 microlitres de fixateur au centre de la zone de la lame. En présence des vers, le fixateur gèle partiellement sur place, puis fond pour recouvrir une région plus étendue de la lame.Si les vers ne sont pas immédiatement et soigneusement recouverts de fixateur, ajouter davantage de fixateur à l’aide d’une micropipette. Veiller à ce que le fixateur ne déborde pas du bord de la lame. Ajouter des lingettes sans peluches humides pliées dans la boîte pour maintenir une humidité constante.Ne laissez pas les lingettes toucher les lames. Ensuite, couvrez la boîte avec un couvercle et laissez-la de 10 minutes à toute la nuit à température ambiante après la fixation. Une fois la fixation terminée, utilisez une pipette pour transférer délicatement le fixateur contenant les vers non fixés dans un tube de 1,5 millilitre. Plongez ensuite la lame dans un bocal de coloration contenant du PBS.Faire tourner le tube contenant les vers à grande vitesse pendant 30 secondes pour former un culot. Rincer les vers deux fois avec du PBS. Ensuite, procéder à la coloration en parallèle avec les vers présents sur la lame.Le protocole de coloration par anticorps est similaire aux protocoles standards pour tout tissu sur lames et est décrit en détail dans le document joint. Après la coloration, transférez les lames dans du PBS et laissez-les y rester jusqu'à 12 heures à quatre degrés Celsius jusqu'au moment de la montaison. Pour monter les lames, retirez une lame du PBS.Utilisez un chiffon sans peluches pour sécher la face arrière, puis placez-le brièvement sur une serviette en papier rapidement. Déposez environ 20 microlitres de milieu de montage sur les vers de manière à obtenir des quantités à peu près équivalentes de milieu et de PBS sur la lame.Inclinez doucement la lame pour mélanger les deux solutions. Attention, le milieu de montage est toxique. Tenez le bord mat.Inclinez la lame de manière à ce que la solution s’accumule près de la zone recouverte. Ensuite, placez un bord d’une lame couvre-objet de 24 sur 60 millimètres sur la solution afin de minimiser les bulles d’air, qui augmentent la décoloration et perturbent l’observation. Abaissez délicatement la lame couvre-objet.Si des bulles se forment, soulevez lentement le bord de la lame. Ensuite, sans la faire glisser sur les vers, rabaissez-la. Ajoutez du PBS supplémentaire si nécessaire pour éliminer les bulles d'air.À l’aide d’un chiffon sans peluches, comprimez soigneusement les bords de la lame et de la lamelle pour sécher le pourtour. Le bord de la lame doit être visible tout autour de la lamelle et ne doit pas être trop humide. Scellez la lamelle et appliquez deux à trois couches de vernis à ongles sur le bord.Une fois que la lame est bien scellée et sèche, nettoyez le coverslip et l'arrière de la lame, puis placez-la dans les alvéoles d'un support à lames. Les lames scellées peuvent être conservées plusieurs jours à quatre degrés Celsius ou plusieurs semaines à moins vingt degrés Celsius pendant de plus longues périodes. La coloration DAPI de l'ADN et la plupart des colorants verts s'estompent ; rescellez le coverslip avec du vernis à ongles supplémentaire au besoin, en particulier après avoir utilisé un objectif à immersion dans l'huile.Les images représentatives suivantes ont été recueillies à l’aide de lames préparées lors des premières tentatives de marquage par anticorps réalisées par des étudiants de licence dans le cadre d’un cours de laboratoire de biologie cellulaire. Cette image montre un exemple de têtes de deux hermaphrodites adultes correctement comprimées, fissurées et légèrement fixées avec du méthanol acétone. Elles ont été marquées à l’aide de plusieurs anticorps et colorants.Dans ce cas, pratiquement tout le ver est accessible aux anticorps. La coloration, ici, la localisation des noyaux indiquée par la coloration au DPI indique quelles parties du ver sont intactes. Lorsque les vers sont soumis à un fixateur plus fort, comme le formaldéhyde, la morphologie du ver peut devenir déformée.Cela peut être observé sur ces images par l'aspect ondulé des muscles représentés en rouge. Un autre problème courant lié à l'utilisation de fixateurs plus durs est une fixation ou une pénétration inégale de certains tissus. On peut le voir ici, où le muscle représenté en rouge n'est coloré que sur une partie du ver.Ici, la présence d'autres colorations, notamment celle de l'ADN, représentée en bleu, indique qu'au moins une partie du corps était présente. Le motif résultant de coloration partielle peut être facilement identifié avec de la pratique, permettant ainsi de déterminer la distribution complète de la coloration, même si un ver individuel présente une coloration irrégulière. Les problèmes courants rencontrés lors du clivage par congélation, quelle que soit la condition de fixation utilisée, sont illustrés ici.Le problème le plus fréquent est la torsion de l'échantillon due au mouvement relatif des deux lames. Lors de la compression, la morphologie des tissus colorés indique que le corps du ver est tordu juste en arrière de la pharynx. Cette image montre également le problème de coloration de fond due à l'adhésion de l'anticorps au polylysine recouvrant la lame.Cela peut être évité en utilisant le microscope confocal. Notez que, même avec de la pratique, de nombreux vers individuels seront perdus ou présenteront certains des problèmes illustrés ici. Une fois maîtrisées, la préparation et la fixation peuvent être réalisées en une heure et la coloration peut être effectuée en une journée.Après cette procédure, diverses méthodes de fixation peuvent être réalisées afin d'optimiser la coloration pour un anticorps et un tissu donnés.

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons une méthode pour localiser les protéines marquées par fluorescence en microscopie électronique. Fluorescence est d'abord localisée en utilisant la microscopie localisation photo-activé sur coupes ultrafines. Ces images sont ensuite alignées à micrographies électroniques de la même section.

Nano-FEM: la localisation des protéines en utilisant la microscopie Localisation Photo-actif et microscopie électronique

L'abondance des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses en cluster influe fortement sur la force synaptique. Cette méthode permet de quantifier les récepteurs des neurotransmetteurs marquage fluorescent en trois dimensions avec une seule synapse...

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Cette vidéo décrit le fissurage par congélation, une méthode permettant de rendre les tissus de C. elegans accessibles pour la coloration des anticorps en perturbant la cuticule.

Fissuration par congélation des nématodes : une méthode pour exposer les tissus intérieurs des vers pour la coloration

Nous rapportons une procédure concise d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) dans la gonade et les embryons de Caenorhabditis elegans pour observer et quantifier les séquences répétitives. Nous avons réussi à observer et à quantifier deux séquences répétitives différentes, les répétitions de télomères et le modèle d’allongement alternatif des télomères (TALT).

Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation (FISH) avec PNA Sondes en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Nous proposons une méthode basée sur la formation d' image par immunofluorescence pour la localisation spatiale et temporelle de ERK actif dans le disséqué C. gonades elegans. Le protocole décrit ici peut être adapté à la visualisation de toute signalisation ou d'une protéine structurelle du C. elegans gonades, pourvu d' un réactif d'anticorps convenable est disponible.

Analyse spatiale et temporelle d&#39;Active ERK dans le<em&gt; C. elegans</em&gt; germinale

Le transparent c. elegans intestin peut servir comme une «en vivo tissu chambre » pour l’étude des apicobasal la biogenèse membranaire et lumen au niveau unicellulaire et subcellulaire pendant tubulogenèse multicellulaires. Ce protocole décrit comment combiner un étiquetage standard, perte de fonction génétique/ARNi et approches microscopiques de disséquer ces processus au niveau moléculaire.

Le c. elegans intestin comme un modèle intercellulaires Lumen morphogenèse et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire au niveau unicellulaire : marquage par des anticorps, RNAi perte de fonction analyse et imagerie

Ce protocole montre comment suivre une translocation nucléaire de protéines sous la contrainte thermique à l’aide d’une protéine de fusion de protéine (GFP) par fluorescence verte comme un marqueur et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Le DAPI souillant le protocole est rapide et préserve les signaux de localisation sous-cellulaire GFP et de protéines.

Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4', 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Le protocole suivant décrit le développement et l’optimisation d’un flux de travail à haut débit pour la culture de vers, l’imagerie par fluorescence et le traitement automatisé d’images afin de quantifier les agrégats de polyglutamines en tant qu’évaluation des changements dans la protéostasie.

Automatisation de la quantification agrégée chez Caenorhabditis elegans

Il s’agit d’une méthode couramment utilisée pour la dissection de gonades de C. elegans suivie d’une fissure de congélation, qui produit des échantillons germinaux pour l’immunofluorescence via la coloration des anticorps, ou pour la coloration DAPI simple pour visualiser l’ADN. Ce protocole a été couronné de succès pour les étudiants de premier cycle dans un laboratoire de recherche et dans une expérience de recherche de premier cycle basée sur des cours.

C. elegans Dissection de gonade et fissure de congélation pour immunofluorescence et coloration DAPI

La microscopie à super-résolution peut fournir un aperçu détaillé de l’organisation des composants au sein du complexe synaptonémique dans la méiose. Ici, nous démontrons un protocole pour résoudre les protéines individuelles du complexe synaptonemal Caenorhabditis elegans .

Microscopie à super-résolution du complexe synaptonémique dans la lignée germinale de Caenorhabditis elegans

Découvrez la technique de freeze-cracking pour la coloration anticorps chez C. elegans en neurosciences. Cette méthode minimise les traitements chimiques et améliore la localisation protéique par microscopie fluorescente.

Anticorps coloration dans

Explorer plus de vidéos