La production de grands nombres de tumeurs Sphéroïdes Taille contrôlée à l'aide de micro puits Plaques

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer un grand nombre de sphéroïdes tumoraux contrôlés de taille uniforme. Ceci est réalisé en préparant d’abord les plaques de micropuits pour regrouper les cellules à former en stéroïdes. Dans un deuxième temps, une culture du type de cellule souhaité est récoltée, ce qui fournit la suspension cellulaire qui détermine la taille et la composition des OID.

La suspension cellulaire est ensuite centrifugée dans les micro-puits et incubée afin de permettre la formation de stéroïdes après l’incubation. Les stéroïdes résultants sont très uniformes et peuvent être collectés ou cultivés dans les micro-puits dans lesquels ils se sont formés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’il est possible de fabriquer simultanément un très grand nombre d’agrégats uniformes.

Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent trouver que leur carburant est très volumineux. Il est important de s’assurer que la suspension des cellules est uniformément répartie sur la plaque et que les supports de plaque oscillants dans le Fuge central se déplacent librement afin que la force soit perpendiculaire à la surface. Pour commencer, préparez une plaque stérile Agro well 400 en ajoutant 0,5 millilitre de surfactant contenant une solution de rinçage dans chaque puits.

L’utilisation d’un tensioactif garantit que les cellules n’interagissent pas avec la surface du micro-puits. Pour éviter de piéger les bulles d’air dans les micro-puits, ajoutez du liquide d’un côté et laissez-le se répandre sur la surface plutôt que de le laisser tomber verticalement sur la surface. Après avoir ajouté la solution dans les puits, replacez le couvercle.

Assurez-vous que le rotor est correctement équilibré avant de centrifuger les plaques pendant deux minutes à 2000 fois G.To éliminez les bulles à l’aide d’un microscope inversé à faible grossissement, vérifiez que les bulles ont été retirées des micro-puits. Incuber la plaque pendant au moins 30 minutes avec le couvercle à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Aspirez la solution de rinçage des puits et lavez la plaque avec de l’eau stérile ou du PBS immédiatement avant utilisation.

Ne laissez pas les plaques sécher après le codage. Les détails de la préparation des cellules varient en fonction du type de cellule spécifique étudié. Cependant, nous avons observé que cette condition est efficace pour un large éventail de cellules, y compris les lignées que nous avons discutées ici, ainsi que pour les cellules souches embryonnaires humaines et neuronales, les cellules souches pluripotentes induites humaines, les fibroblastes, les endones primitifs putatifs et les cellules stromales Pour préparer les cellules, commencez par le flacon T 75 de cellules HT 29.

Aspirez le milieu de croissance de la fiole et ajoutez trois millilitres de trypsine. Incuber les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Arrêtez la digestion de la trypsine en ajoutant trois millilitres de milieu de croissance.

Transférez le reste dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, à partir d’un tube de 15 millilitres, prélevez une aliquote pour le comptage cellulaire. Centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 200 fois G pendant la centrifugation.

Comptez les cellules. Ensuite, aspirez le mélange de milieu d’essai et remplacez-le par une croissance fraîche. Milieu à un volume déterminé par la densité de cellules requise, précédemment calculée comme décrit dans le protocole textuel en tant qu’étape facultative.

Passez la suspension cellulaire dans une passoire afin d’éliminer les grumeaux. Les sphéroïdes peuvent être générés dans une variété de formulations de milieux, mais les essais initiaux doivent être effectués en utilisant le milieu dans lequel les cellules ont été cultivées. Pour distinguer les conséquences de la transition vers un système de culture tridimensionnel des conséquences de la modification de la composition du milieu, commencez par ajouter 0,4 millilitre de milieu de croissance à chaque centrifugeuse de puits pendant deux minutes à 2000 fois G.To éliminez les bulles à l’aide d’un microscope inversé à faible grossissement, vérifiez que les bulles ont été retirées des micro-puits.

Ensuite, ajoutez 0,4 millilitre de suspension cellulaire à la densité requise dans les micro-puits. Ensuite, mélangez doucement en pipetant de haut en bas sans introduire de bulles d’air dans les micro-puits, assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties dans tout le puits. Pour obtenir des stéroïdes cohérents.

Centrifugez la plaque pendant cinq minutes à 200 fois. G, la plaque doit être équilibrée à l’intérieur ainsi que contre l’autre plaque afin que le poids soit réparti uniformément des deux côtés du porte-plaques. Cela garantit que la plaque se nivelle automatiquement pendant la centrifugation, de sorte que les courants de convection ne se produisent pas et n’entraînent pas une répartition inégale des cellules à travers les micro-puits.

À l’aide d’un microscope inversé, vérifiez que les cellules se sont regroupées dans les micropuits et qu’elles sont uniformément réparties dans le puits avant d’incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Observez le processus de formation des sphéroïdes à l’aide d’un microscope inversé. Certaines lignées cellulaires formeront des stéroïdes compacts dans les 24 heures.

D’autres peuvent prendre plus de temps. La progression du cluster à l’agrégat en cellules HT 29 est illustrée ici. La partie la plus difficile de cette procédure est de retirer les stéroïdes intex sans perturber les structures Pour extraire les stéroïdes des micro-puits, pipetez de haut en bas très doucement pour laisser les sphéroïdes sortir des micro-puits.

Inclinez ensuite la plaque pour aspirer le mélange de stéroïdes moyen. Utilisez des pointes de pipette à large orifice pour les stéroïdes de plus grande taille afin d’éviter de décomposer le stéroïde. Après avoir récupéré le stéroïde des micro-puits, transférez-le dans la culture en suspension en les jetant doucement avec une pipette.

Alternativement, la rose sévère peut être maintenue dans la crise avec un remplacement moyen. La durée dépend de la taille initiale et du taux de croissance, ce qui définit le temps jusqu’à ce qu’ils dépassent les micro-puits. Eh bien, ils ont été formés pour remplacer le milieu sans perdre de stéroïdes.

Aspirez le fluide au bord du puits. À l’aide d’une pipette de pâturage, abaissez lentement la pointe jusqu’à ce qu’elle commence à aspirer le liquide du ménisque et suivez le ménisque vers le bas pendant qu’il baisse. Ajoutez ensuite du fluide frais contre la paroi du puits au même endroit.

Lors de l’ajout du milieu frais, n’oubliez pas de pousser doucement la pipette et de maintenir la pointe contre la paroi pour éviter de perturber le PHE dans les micropuits. Quelques stéroïdes peuvent être perdus. Cependant, si le fluide est toujours aspiré et remplacé dans la même position, ce nombre restera faible.

Par rapport au grand nombre de stéroïdes dans le puits, les stéroïdes de plusieurs lignées tumorales d’origines anatomiques différentes peuvent être facilement extraits en suspension. Le contrôle cohérent de la taille pouvant être obtenu par cette méthode est démontré ici avec des populations de stéroïdes hautement uniformisées. Dans chaque condition formée de 700 ou 1 500 cellules.

Des différences claires de comportement entre les lignes sont également visibles avec des cellules cancéreuses du côlon HT 29 et des cellules cancéreuses de l’œsophage TE six formant des stéroïdes densément emballés avec des limites nettement définies. À l’inverse, les cellules cancéreuses de la prostate donnent naissance à des stéroïdes moins cohérents avec des limites irrégulières. Les forces internes plus fortes dans les agrégats plus cohérents ont également entraîné l’effondrement à une forme plus symétrique, même s’ils étaient encore dans les micropuits dans lesquels ils se sont formés.

Cependant, les agrégats de lin cap, en particulier à la plus grande taille, conservent visiblement la géométrie paramétallique carrée des micro-puits. Une fois maîtrisé, ce processus peut être réalisé en environ une heure plus la période d’incubation nécessaire pour que les cellules adhèrent et produisent des fluides. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer que les bulles en forment une autre, en parcourant les micro-puits avant d’ajouter les cellules.