Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d'Innate Immune Health chez le poisson zèbre

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser la fluorescence pour quantifier la réponse de l'explosion respiratoire. Commencez par charger les embryons de poisson zèbre dans les puits d'une plaque de 96 puits. Ajoutez ensuite un substrat fluorescent et activez l'explosion respiratoire à l'aide d'un agent chimique.

Ensuite, quantifiez la fluorescence relative à l'aide d'un fluorimètre. En fin de compte, la fluorescence sert à montrer le potentiel de production de burst respiratoire. Cette méthode peut être utilisée pour étudier comment des manipulations expérimentales affectent la santé globale du système immunitaire inné.

Ici, nous l'utilisons pour étudier l'explosion respiratoire des embryons de poisson zèbre, mais cette méthode peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les poissons zèbres adultes, les cellules rénales et les préparations cellulaires provenant d'autres espèces de poissons. Faire développer les embryons dans des boîtes de Pétri profondes à 28 degrés Celsius dans de l'eau pour œufs jusqu'au stade de développement souhaité. Retirer quotidiennement les embryons morts.

Verse soigneusement l'ancienne eau d'œufs et remplacez-la par de l'eau d'œufs fraîche chaque jour. Le jour de l'expérience, préparez une solution working de fluorescéine réduite dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre enveloppé dans du papier d'aluminium. Préparez également une solution working de PMA à une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre.

Préparez ensuite cinq millilitres de chaque solution de dosage dans des tubes coniques de 15 millilitres, comme décrit dans le texte accompagnant. Gardez les solutions de dosage sur glace, puis allumez d'abord le lecteur de microplaques et faites chauffer la source lumineuse afin de mesurer la fluorescence. Configurez un programme indiquant les longueurs d'onde d'excitation et d'émission, la sensibilité de la position optique, et incluez également une étape d'agitation de cinq secondes.

Avant la réédification, préparez le matériel expérimental composé de boîtes contenant des embryons enrobés. Une microplaque noire de 96 puits, un pipeteur P200 et des embouts, un seau à glace contenant les réactifs à base de fluorescéine. Un pipeteur multicanal P200, deux réservoirs stériles, du papier d'aluminium et des ciseaux.

À présent, coupez la pointe d'une pipette de manière à ce que les embryons ou les reins puissent passer par l'ouverture. Réglez une pipette P200 sur 100 microlitres et transférez un embryon avec de l'eau d'œuf dans autant de puits qu'il le faut d'une microplaque noire à 96 puits. Versez ensuite la solution de dosage dans un réservoir stérile de 25 millilitres à l'aide d'une pipette multicanal P200.

Ajouter 100 microlitres de solution de dosage H 2D CFDA dans une colonne de la microplaque 96 puits ; répéter l'opération pour la moitié des échantillons d'embryons contrôles et la moitié des échantillons d'embryons manipulés expérimentalement. Verser la solution de dosage contenant la PMA dans un nouveau réservoir stérile de 25 millilitres.

Ensuite, aliquoter cette solution de dosage dans les colonnes restantes de la microplaque 96 puits. Couvrir la microplaque avec du papier d'aluminium et placer sur un agitateur pendant environ 20 secondes. À 150 tr/min, incuber la microplaque à 28 degrés Celsius lorsqu'elle n'est pas en cours de lecture.

Lisez la microplaque après l'ajout de PMA. Continuez à effectuer des mesures toutes les quelques minutes pendant l'intervalle de temps souhaité, ou incubez la microplaque enveloppée de papier d'aluminium à 28 degrés Celsius jusqu'à un point temporel fixé. Ensuite, récupérez les embryons des puits et euthanasiez-les conformément au protocole institutionnel de soins et d'utilisation des animaux.

Également, jetez la microplaque et les autres matériaux jetables dans le récipient pour déchets biologiques. Déterminez le point temporel auquel vous souhaitez comparer la fluorescence. Soustrayez la valeur moyenne de fluorescence du groupe témoin non induit des valeurs individuelles de fluorescence du groupe témoin induit par le PMA.

Répétez cela pour le groupe expérimental avec et sans PMA. Ensuite, stockez ces valeurs de fluorescence normalisées dans des colonnes, le groupe témoin avec PMA et le groupe expérimental avec PMA. Calculez ensuite les moyennes et les écarts types des valeurs de fluorescence normalisées pour le groupe témoin avec PMA et le groupe expérimental avec PMA.

Comparez les valeurs de fluorescence normalisées à l'aide d'un test T non apparié afin de déterminer la signification statistique. Représentez graphiquement les moyennes du groupe témoin plus PMA et du groupe expérimental plus PMA, avec des barres d'erreur reflétant les écarts-types appropriés, et indiquez le niveau de significativité sur le graphique ainsi que dans la légende de la figure. Cette expérience compare la réponse de burst respiratoire chez des embryons de zebrafish de type sauvage, lignée AB, à 48 heures et 72 heures après la fécondation.

La fluorescence brute a été mesurée quatre heures après l'ajout de PMA dans les groupes induits par le PMA. Les valeurs de fluorescence brute étaient plus élevées dans la population à 72 HPF. Comme l'indiquent les moyennes calculées, les valeurs de fluorescence sont normalisées afin de tenir compte des variations des niveaux de fluorescence de fond.

Les résultats de ce test de production de burst respiratoire ont révélé que les embryons de poisson-zèbre à 72 hpf sont capables de produire significativement plus d'espèces réactives de l'oxygène, et par conséquent de déclencher une réponse de burst respiratoire plus intense que les embryons à 48 hpf après induction par le PMA. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la fluorescence pour quantifier le potentiel de burst respiratoire des embryons de poisson-zèbre. N'oubliez pas que le travail avec la poudre de PMA peut être extrêmement dangereux ; prenez donc des précautions telles que le port d'un masque facial lors de la pesée de la poudre de PMA.