Name: Biopolymères à base dacide malique Nano pour le ciblage des marqueurs tumoraux multiples: une opportunité pour la médecine personnalisée? (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Découvrez la synthèse de nano-médicaments à base d'acide polymalique pour le traitement personnalisé du cancer du sein Her2-positif chez la souris. Cette méthode de nanomédecine offre une thérapie ciblée sans effets secondaires.

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Nous remercions grandement le soutien financier des NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, des subventions du Département de neurochirurgie du Cedars-Cedars Medical Center et d’Arrogene Technology Inc.

Toutes les expériences sont conformes aux réglementations officielles d&#39;animaux y compris les procédures chirurgicales et non chirurgicales réalisées in vivo et sont en pleine conformité avec les protocoles IACUC. 1. Bioproduction de l&#39;acide malique <ol><li> Cultiver une culture de semences de sphérules sur gélose et transférer plasmodies à 100 ml de milieu de culture en utilisant un 25 ° C Thermo déclaré incubateur et un milieu de culture de base 8,9. </li><li> Produire une quantité de gravité emballé 500 micro plasmodia ml sous l&#39;abri de la lumière afin d&#39;éviter la sporulation. </li><li> Préparez 80 g CaCO3 en suspension dans 8 L milieu de base dans 10 L récipient bioréacteur. Transférer les 500 ml emballés micro Plasmodium dans le récipient de réaction et monté pour permettre le bioprocédé 75 h à 25 ° C, 10 L / min de débit d&#39;air filtré et 150 tours par minute sous agitation par un agitateur de segment. </li><li> Fin lorsque le bouillon de culture a un pH de 4,8, indiquant la fin de la production de PMLA et mesurer la teneur PMLA par til hydroxamate / Fe (III) dosage. </li><li> Refroidir le bouillon à 17 ° C et permettent aux cellules de se déposent par gravité. </li><li> Laisser refroidir à 4 ° C et ajuster le pH à 7,5, utiliser NaOH 2. Pomper le liquide surnageant à travers une colonne remplie avec 1,5 l de DEAE-cellulose dans le fond de la direction vers le haut (de DEAE à grains grossiers, équilibrée avec 20 mM Tris-HCl pH 7,5 à 5 ° C). </li><li> Laver avec 3 colonnes de tampon contenant 0,3 M de NaCl, après modification de la direction de haut en bas et éluer PMLA en présence de 0,7 M de NaCl. </li><li> Régler à 0,1 M CaCl 2 et précipiter PMLA-Calcium avec 80% éthanol glacé. Fractionner sur Sephadex G25 dans PMLA-calcium de 80 à 300 kDa, 50-80 kDa, et de 10 - 50 kDa, en utilisant de l&#39;eau en l&#39;absence de tampon et de sel. </li><li> Passer chaque fraction sur une 120H Amberlite IR + colonne, et geler immédiatement l&#39;acide malique accréditives dans l&#39;azote liquide pour la lyophilisation. </li><li> Dissoudre dans de l&#39;acétone sec. Après filtration, éliminer le solvantdans le flux d&#39;air sec, lyophiliser et conserver à -20 ° C. </li></ol> 2. Synthèse de nano médicaments à base d&#39;acide malique <ol><li> Activer les groupes carboxyles de PMLA (P) par mélange de 116 mg (1 mmol unités malyl) de PMLA-H dans 1 ml d&#39;acétone anhydre et 1 mmole de N-hydroxysuccinimide et de 1 mmol de dicyclohexyl carbodiimide dans 2 ml de diméthylformamide (DMF). Agiter à 20 ° C pendant 3 heures. Ajouter 0,05 mmole de mPEG 5000-NH 2 (0,05% molaire d&#39;unités malyl) dans 1 ml de DMF, suivi par 0,05 mmol de triéthylamine (TEA). </li><li> Ajouter goutte à goutte en solution dans le DMF de 0,4 mmol d&#39;ester de leucine d&#39;éthyle (Loet) (40% molaire d&#39;unités malyl), 0,1 mmol de 2-thiol-1-éthylamine (2-méthoxyéthyle) (10% en moles de motifs malyl) et 0,5 mmoles de TEA, tous dissous dans du DMF. Après chaque addition, laisser 1 heure et vérifier la fin de la réaction négative par la ninhydrine réponse (couche de chromatographie, CCM). </li><li> Ne retirer les restes de NHS-ester par hydrolyse spontanée avec une solution saline tamponnée au phosphate (30 min, pH 6,8). Dessaler sur PD-10 Colonne, obtenir &quot;preconjugate&quot; comme une poudre blanche par lyophilisation. Entreposer au sec moins 20 ° C. </li><li> Dissoudre 30 mg d&#39;anticorps (anticorps monoclonal, IgG2a-κ) dans 4,5 ml de phosphate de sodium 100 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5. </li><li> Réduire les liaisons disulfure avec 5 mM de Tris (2-carboxy-éthyl) chlorhydrate de phosphine pendant 30 min à 20 ° C et on purifie sur colonne PD-10. </li><li> Dissoudre Mal-PEG 3400-Mal dans 2 ml du même tampon et ajouter le mAb réduite à un volume final de 10 ml et on agite pendant une nuit à 4 ° C. Concentrer à 2,5 ml sur Vivaspin 20, exclusion 30 kD, et purifier sur Sephadex G75. Vérifiez produit sur sec-HPLC et évaluer la valeur photométrique à 280 nm de longueur d&#39;onde. </li><li> Fixez Mal-PEG-Mal-mAb à &quot;preconjugate&quot; thiols obtention P / PEG 5000 (5%) / Loet (40%) / mab (0,2%) / 2-MEA (10%). Pour ce faire, en mélangeant 5 ml de 200 nmol mAb-PEG 3400-Mal à 50 mg (P / MPEG 5000 / LOEt/2-MEA) dans le tampon pH supérieur à 5,5, ajuster la concentration de sulfhyDryl à 2 mM et incuber à 20 ° C pendant 3 heures (rendement 98%). </li><li> Solubiliser 3&#39;-H 2 N-AON dans du DMF / PBS (pH 7,2) et de réagir avec le N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP) à (01:01 v / v) DMF / méthanol (test à la ninhydrine ) et purifier AON-PDP sur Sephadex LH20-en méthanol, puis dans l&#39;eau et lyophiliser. </li><li> Incuber 800 nmol AONs activés dans la mémoire tampon de pH 5,5 à la Mal-PEG 3400-Mal-mAb-preconjugate préparé ci-dessus pendant la nuit jusqu&#39;à ce que la réaction d&#39;échange de disulfure est terminée. </li><li> Incorporer fluorescent Alexa Fluor 680-maléimide formant thioéther avec un polymère-2-MEA-SH. Bloquer sulfhydryls excès de 3-pyridyldithio-propionate (PDP) et purifier sur Sephadex G75. Conserver à 4 ° C ou congelé instantanément à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol> 3. Tests et Propriétés <ol><li> Effectuer des tests de pureté et de stabilité dans le sérum et PBS à 4 ° C et 37 ° C par analyse HPLC-sec. Utilisez polystyrène sulfonate comme molecnormes de poids ment ses. Mesurer la distribution de la taille des nano et zeta-potentiels. Utilisez les systèmes commerciaux. </li><li> Ajouter 320 ul d&#39;échantillon de 160 ul de 10% (p / v) de chlorure d&#39;hydroxylammonium et 160 ul de 10% (p / v) de NaOH. Après 10-15 minutes, mélanger avec 160 pi de 5% (p / v) Fe (III) Cl 3 à 12% (v / v) de HCl et de lire Un 540 de hydroxamate / Fe (III). Calculez PMLA supposant 1 mg / ml PMLA correspond à 2,5 A 540. </li><li> Hydrolyser la molécule nano pendant une nuit dans du HCl 2 M à 110 ° C et le dosage de l&#39;acide malique sur la chromatographie en phase inverse en faisant référence à des échantillons standards dopé avec de l&#39;acide malique. Cliver le médicament nano avec dithiothréitol 100 mM et mesurer Morpholino-AON par quantitative HPLC en phase inversée par rapport aux normes Morpholino AON. </li><li> Prendre nano médicament sans clivage et de mesurer l&#39;anticorps en utilisant un kit de dosage de protéine. Quantifier mPEG en permettant sa réaction avec l&#39;ammonium ferrothiocyanate, puis extraire avec du chloroforme et l&#39;absorbance à 510 nm de longueur d&#39;onde 10 </sup&gt;. </li><li> Effectuer ELISA avec 5 pi de drogue nano (1-10 pg de mAb) par puits tester l&#39;activité des anticorps et emboîtement. Utiliser 0,5 pg / puits récepteur de la transferrine et de HER2, respectivement, comme des antigènes de la plaque revêtue et des anticorps secondaires couplés à la peroxydase. </li><li> Calculer atteint% pour AON, MPEG et mAb à l&#39;égard de l&#39;acide malique (100%) et comparer avec le% prévu par la conception (voir les exemples les tableaux 1 et 2). </li></ol> 4. Tests in vitro <ol><li> Incuber le médicament avec des nano cellules cancéreuses en culture et les cellules survivantes mesure au cours du temps par leur activité pour réduire réactif jaune [3 - (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfophényl )-2H-tétrazolium, sel interne] (MTS) à un colorant bleu et lire l&#39;absorbance relative avec un photomètre. Suivez les instructions du fabricant de kit. </li><li> Préparer des extraits de cellules in vitro ou ex vivo pour le transfert de Western. Utilisez glacée extraction buffer qui contient SDS et inhibiteur de la protéase cocktail. Séparer les protéines par électrophorèse sur gel réducteur de SDS-polyacrylamide. </li><li> Avez-western blot des protéines d&#39;intérêt dans les extraits d&#39;échantillons. Utiliser des anticorps secondaires conjugués à la phosphatase alcaline. </li><li> Utiliser la microscopie confocale pour démontrer l&#39;absorption cellulaire et la co-localisation de la plate-forme de nano de médicament polymère, AON endosomes et en utilisant un marquage par fluorescence. Attacher Alexa Fluor 680 de la plate-forme de conjugué de nano et Lissamine à AONs que des marqueurs de fluorescence. Utiliser un microscope 5X scanner spectrale et les cellules cancéreuses vivantes de visualiser la distribution des molécules marquées </li><li> Membranes endosomes tache avec Styryl rouge colorant fluorescent et démontrent colocalisation endosome ou de libération. </li></ol> 5. Essais in vivo <ol><li> Préparer le modèle de souris de cancer du sein humain HER2-positif (Tac nu de la souris: Cr: (MCR)-Foxnnm). Insérez un 0,72 mg 17β-estradiol libérer culot (90 jours de presse) subcutaneously dans le cou de chaque souris. </li><li> Puis injecter des cellules tumorales BT-474 1 x 10 7 sous-cutanée dans le flanc droit et laisser la tumeur se développer. </li><li> Commencer le traitement lorsque les tumeurs sont de 120 mm 3 de la taille de l&#39;injection dans la veine caudale de 150 ul de conjugué nano contenant 2,5 mg / kg AON et / ou 4,5 mg / kg de chaque anticorps. Pour le traitement injecter deux fois par semaine, total six fois. </li><li> Mesurer la taille de la tumeur avec étriers deux fois la faiblesse et calculer les volumes en utilisant la formule (longueur x profondeur x largeur) x (π / 6). Euthanasier les animaux deux semaines après la dernière injection et après une sédation avec une solution de kétamine et de dexmédétomidine suivie par dislocation cervicale. </li><li> Isoler les tumeurs et les sections de tache avec H &amp; E pour l&#39;évaluation morphologique. </li><li> Pour l&#39;évaluation de la distribution du médicament à l&#39;échelle animale, en utilisant un système d&#39;imagerie par fluorescence. Injecter le médicament Alexa Fluor 680 nano marqué et l&#39;image à 24 et 48 h. </li><li> Euthanasier l&#39;animal et de détecter le fluorescence dans les tumeurs et des organes isolés et perfusés. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs Julia Y. Ljubimova, Keith L. Black, et Eggehard Holler sont actionnaires de Arrogene Technology Inc.

La voie expérimentale pour la préparation de médicaments à partir de nanoparticules d&#39;un polymère naturel biodégradable est présenté qui peut être utilisé dans la synthèse de la médecine personnalisée. La description commence par la production contrôlée et la purification de l&#39;acide malique, qui est une plate-forme flexible pour la synthèse de médicaments nano. En utilisant des techniques reproductibles, le polymère est obtenu avec un poids moléculaire élevé et une pureté extrême convenable pour la synthèse pharmaceutique. La synthèse est décrite pour un médicament nano qui est montré pour traiter efficacement le cancer du sein HER2-positif. La description peut être traduit dans des synthèses de la plupart des autres médicaments nano pour le traitement du cancer. Le ciblage comprend des anticorps tels que Herceptin qui se lient à un antigène spécifique de tumeur comme la protéine HER2 ou de tout autre marqueur de tumeur qui est internalisé efficacement. Le médicament de nano délivre une sélection d&#39;oligonucléotides antisens et des agents chimiothérapeutiques qui inhibent efficacement la croissance du cancer sous Treatment. Dans l&#39;exemple, la liaison à HER2 Herceptin et recuit spécifique d&#39;oligonucléotide antisens avec HER2-codante de l&#39;ARNm traduit par le blocage durable de HER2-signalisation et la réduction sévère du cancer du sein HER2-positif. Basé sur le principe sous-jacent de ciblage de la tumeur et l&#39;inhibition de l&#39;expression des gènes par des oligonucléotides antisens nous avons à jour synthétisé plusieurs autres médicaments nano et succès inhibé glioblastome humain préclinique et le cancer du sein triple négatif 11,14-18. Le travail de synthèse commence par la préparation hautement purifiée de la plate-forme de nano médicament, qui est l&#39;acide malique à partir du surnageant de culture de Physarum polycephalum (une espèce de la famille &quot;boue de moule»). La préparation met l&#39;accent sur des poids moléculaires élevés du polymère, en principe, permettre la fixation de plusieurs anticorps, de peptides, d&#39;oligonucléotides et d&#39;autres molécules qui fonctionnent en administration de médicament actif et l&#39;inhibition de la croissance tumorale. Following la mise en culture et la purification contrôlée, qualité reproductible de polymère avec des rendements prévisibles a été produite. Le polymère est stocké dans des conditions avantageuses pour tout le temps. La synthèse des conjugués de nanoparticules PMLA commençant par l&#39;activation chimique des carboxylates pendants polymère est réalisée en quelques étapes de synthèse. Entre les deux étapes, la synthèse peut être éventuellement mis en attente permettant la préparation des quantités arbitraires de produits intermédiaires, et donc peut être utilisé en haut mise à l&#39;échelle. Le progrès de la synthèse est suivie par CCM et HPLC-sec, et à la fois la composition et l&#39;activité de la molécule nano est commandé par des dosages spécifiques à un groupe chimique quantitative, ELISA, et une série de mesures physiques. Notre expérience est que ces synthèses ont été progressé en douceur et de façon reproductible avec d&#39;excellents rendements et pureté. En choisissant la spécificité des anticorps et des oligonucléotides antisens toute variante de nano médicament est favorable synthétisé comme nécessaire dans personalized médecine. Les modalités de la réussite du traitement du cancer du sein HER2-positif humain sont des représentants valides pour la préparation de modèles de cancer de la souris, l&#39;application de médicaments nano, l&#39;imagerie et l&#39;analyse de la croissance tumorale. Les résultats des tests in vitro de viabilité sont utiles dans la sélection de la lignée cellulaire et le médicament conduisant à être utilisé dans l&#39;expérimentation animale. Xenogen imagerie in vivo confirme que le médicament est en effet de nano délivrée dans la tumeur. Résultats de western blot révèle que le niveau de certaines protéines a répondu de la manière prévue au cours du traitement du cancer. Mesure de la taille de la tumeur informe de la réussite du traitement, soit environ inhibition, récession ou de la régression. L&#39;exemple décrit reflète notre expérience avec d&#39;autres médicaments à base d&#39;acide nano-polymalique indiquant un degré élevé de prévisibilité, reproductibilité et l&#39;absence de toxicité notable. Les résultats récents sur la toxicité et l&#39;efficacité des multiples targeted conjugués d&#39;acide malique pour le traitement triple négatif cancer du sein sont en forte appui de cette notion 18. Une caractéristique essentielle est que notre médicament nano est capable de pénétrer dans les bio-barrières: la barrière endothéliale par extravasation dans la interstitiel de la tumeur, la membrane de la cellule tumorale par endosome absorption, et rupture de la membrane de l&#39;endosome par action des groupes d&#39;ester éthylique de leucine ou la trileucine. Extravasation et endosome absorption sont fiable accompli par les anticorps spécifiques liées à la drogue nano. Anticorps anti-récepteur de la transferrine anti-souris médie afflux efficace dans la tumeur par transcytose, probablement parce que le récepteur est surexprimé dans la plupart vasculaire tumoral. Un autre anticorps fixé sur les mêmes fonctions nano molécule conjuguée à diriger précisément le médicament nano dans la cellule tumorale de destinataire. La présence de deux anticorps, l&#39;un pour la transcytose et l&#39;autre pour l&#39;absorption endosome, est essentiel pour un fonctionnement optimal. L&#39;analyse quantitative des macide Alic et anticorps est fortement recommandé afin de contrôler la composition optimale du médicament nano. Enfin, il convient de noter que le nano covalente médicament tout-en-un livre médicament sous forme chimiquement liée, en route à travers le système vasculaire de l&#39;hôte dans la cellule tumorale de destinataire. fixation chimique rend inactive la plupart des médicaments (prodrogues) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient reconstitués en médicaments gratuits par clivage de la plate-forme nano conjugué au site ciblé. Ceci est important car la modalité de réactivation fournit un degré élevé de sécurité lors de l&#39;accouchement et une chance minime d&#39;évoquer des effets secondaires néfastes. Polyvalence, l&#39;efficacité et la sécurité sont des attributs indispensables de la bonne médecine personnalisée.

Dans l&#39;ère post-génomique quand génomes de cancer ont été démêlé (Centre national pour la biotechnologie et la génomique du cancer Atlas), le traitement futur du cancer représentera la diversité génétique des tumeurs souvent dans la même tumeur 1-4. Bioinformatique et séquençage de l&#39;ADN rapide, pas cher permet l&#39;acquisition de gènes / mutations malignes à un niveau personnel 2,4,5. Une fois que les gènes ont été identifiés, les patients seront traités avec la médecine personnalisée de modifier ou de réduire au silence l&#39;expression de gènes malignes 6. La nécessité de cibler les cellules cancéreuses et délivrer des médicaments dans ces cellules nécessite des systèmes de délivrance polyfonctionnels. De toute évidence, les médicaments de nano peuvent répondre à cette exigence 7. Dans une vague déferlant de découvertes nanoparticules ont prouvé approprié pour apporter des charges utiles de médicaments chimiothérapeutiques, des protéines et / ou de matériel génétiquement actif pour les cellules cancéreuses. Cependant, les effets indésirables restent à l&#39;annoncehabillé. L&#39;un d&#39;entre eux en rapport avec l&#39;absence de biodégradabilité peut provoquer un dépôt de matière dans les tissus et organes en bonne santé avec le risque de provoquer des maladies. Pour minimiser le dépôt, on introduit l&#39;acide malique non toxique et non immunogène, ce qui est d&#39;origine microbienne et biodégradable à H 2 O et CO 2 8. Nous utilisons le polymère à synthétiser un type covalent tout-en-un de nano médicament. Il contient des agents chimiothérapeutiques attachés chimiquement tels que le témozolomide, la doxorubicine, ou des oligonucleotides antisens et des groupes fonctionnels qui servent extravasation, le ciblage tissulaire, la livraison endosomolytique. Les médicaments sont intrinsèquement clivés de la plate-forme de nano quand ils sont arrivés dans la cellule tumorale ciblée, régénérant ainsi l&#39;activité pharmaceutique complet. Nous décrivons le procédé de production microbienne de la plate-forme de nano polymère, sa purification, et de la synthèse chimique d&#39;un médicament qui contient des nano trastuzumab (Herceptin) pour le cancerLe ciblage et un oligonucléotide anti-sens pour l&#39;inhibition de la surproduction HER2. En appliquant le médicament nano cancer xénogénique humaine sein HER2-positif sur la souris nude, nous démontrons une grande efficacité du traitement du cancer. Les principes de ciblage de la tumeur et l&#39;inactivation de gène introduit ici pour polymalique médicaments nano d&#39;acide peuvent être utilisés dans le traitement d&#39;autres cas de cancer.

<table><tbody><tr><td>2-Mercapto-1-éthylamine (Cysteamine ; 2MEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30078-25G</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories, Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Libération de 90 jours 17&beta ;-estradiol pellet&nbsp ;</td><td>Recherche innovante d’Amérique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 C2 maléimide</td><td>Invitrogen</td><td>A20344</td><td></td></tr><tr><td>Amberlite IR 120H</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6428</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mousse Y-30 Émulsion</td><td>Sigam-Aldrich</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Chaîne anti-laminine-411 mAbs</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-59980</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pAkt mAb</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9271S</td><td></td></tr><tr>Anticorps anti-facteur de <td></td> von Willebrand 556494 <td></td><td>anti-PARB mAb</td><td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure Bacto</td><td>Bacto, Dickinson/Sparks, MD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Signalisation cellulaire</td> de<td>la bêta-actine</td><td>3700</td><td></td></tr><tr><td>BT-474&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>HTB-20</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de calcium</td><td>Alfa Aesar</td><td>36337</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage de la prolifération cellulaire</td><td>Promega, Madison, WI, États-Unis PR-G3580</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centriplus 100&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>4414</td><td></td></tr><tr><td>Dicyclohexylcarbodimide</td><td>Fluka</td><td>36650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Cardinal Health</td><td>S7439-4</td><td></td></tr><tr><td>Galardin (inhibiteurs de la MMP)&nbsp ;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-994</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxiline</td><td>Cardinal Health</td><td>S7439-3</td><td></td></tr><tr><td>Hémine de porc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>Herceptin</td><td>Genentech</td><td>15534</td><td></td></tr><tr><td>Herceptin (Western blot)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2165S</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a-kappa malignome murin</td><td>Sigma</td><td>M77695X5m</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Star AP Pack de substrat</td><td>Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>Immun-StarTM AP Substrate Pack&nbsp ;</td><td>Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>LAL Réactif eau&nbsp ;</td><td>Lonza, MD</td><td>W50-1000</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-411 mAbs</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leucine ethyl ester (LOEt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61850-10G-F</td><td></td></tr><tr><td>Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests</td><td>Cambrex BioScience</td><td>N384</td><td></td></tr><tr><td>Lissamin-Morpholino</td><td>AON Gene Tools</td><td>Acide</td> L-malique sur <td></td>mesure</tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6413</td><td></td></tr><tr><td>Malate déshydrogénase&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2634</td><td></td></tr><tr><td>Mal-PEG-Mal</td><td>Laysan</td><td>mal-PEG-mal-3400</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre&nbsp ;</td><td>Protéomique</td><td>M203-10G</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides morpholino·s ;</td><td>GeneTools</td><td>sur</td><td></td>mesure</tr><tr><td>mPEG5000</td><td>Lysan</td><td>mPEG-NH2-5000</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimde (NHS)&nbsp ;</td><td>ACROS Organics</td><td>15727100</td><td></td></tr><tr><td>Ninhydrin</td><td>Merck</td><td>1.06762.0100</td><td></td></tr><tr><td>Sandwich de papier filtre à membrane de nitrocellulose</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Sandwich de papier filtre à membrane de nitrocellulose, 0.45 &micro ; m&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Novex &reg ; Tampon de transfert Tris-Glycine (25x)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>Nude Mice [Tac :Cr :(MCr)-Foxnnm]&nbsp ;</td><td>Taconic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 10x</td><td>Gibco</td><td>10010-49</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 1x</td><td>Gibco</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>-10 colonnes de dessalage</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851</td><td></td></tr><tr><td>Physarum polycephalum M3CVII</td><td>ATCC</td><td>204388</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA protein assay&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>1.18362E+11</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de protéines Kit ELISA</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 superfine</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0031</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex-LH20&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090</td><td></td></tr><tr><td>SKBR-3&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>SPDP</td><td>Proteochem&nbsp ;</td><td>C1116</td><td></td></tr><tr><td>Streamline-DEAE</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0994</td><td></td></tr><tr><td>Rouge Styryl FM 1-43&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ;</td><td>T-3163</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>TLC, feuilles d’aluminium revêtues de silice</td><td>Merck, Darmstadt, DE</td><td>60F254</td><td></td></tr><tr><td>Trileucine (LLL)</td><td>Bachem</td><td>H-3915</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X114</td><td></td></tr><tr><td>Tween&reg ; 20&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>14005-302</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories, Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexmédétomidine</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofène</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Foster et Smith, Wisconsin</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biopolymères à base d&#39;acide malique nano pour le ciblage des marqueurs tumoraux multiples: une opportunité pour la médecine personnalisée?

Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Les tumeurs de grade et de morphologie similaires répondent souvent différemment au même traitement en raison des variations de profilage moléculaire. Pour tenir compte de cette diversité, la médecine personnalisée est développée pour réduire au silence les gènes associés à la malignité. Les nanomédicaments répondent à ces besoins en ciblant la tumeur et en délivrant des oligonucléotides antisens pour le silençage des gènes. Comme les médicaments pour le traitement sont souvent administrés de manière répétée, l’absence de toxicité et une réponse immunitaire négligeable sont souhaitables. Dans l’exemple présenté ici, un nanomédicament est synthétisé à partir de la plateforme biodégradable, non toxique et non immunogène de l’acide polymalique par ligature chimique contrôlée d’oligonucléotides antisens et de molécules ciblant les tumeurs. La synthèse et le traitement sont illustrés pour le cancer du sein humain Her2 positif à l’aide d’un modèle de souris expérimental. Le cas peut être traduit vers la synthèse et le traitement d’autres tumeurs.

Un exemple d&#39;un médicament à base de nano acide malique est présentée vers la conception rationnelle de médicament personnalisé qui est applicable à un cancer. Il décrit la synthèse d&#39;un médicament pour traiter le cancer nano sein HER2-positif humain dans une souris nude.

Biopolymères à base d&#39;acide malique Nano pour le ciblage des marqueurs tumoraux multiples: une opportunité pour la médecine personnalisée?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

L'objectif général est de mettre en place une plateforme à l'échelle nanométrique permettant un protocole universel de synthèse de médicaments personnalisés en fonction de l'ensemble génétique de la maladie d'un individu, en particulier pour le cancer. Commencez par produire et purifier l'acide poly malique à partir de l'organisme microbien frum polycephalum, puis activez chimiquement le PMLA purifié au niveau de ses groupes carboxyliques latéraux. Fixez les petits groupes fonctionnels et le linker MEA par substitution des groupes activés, puis convertissez les groupes activés non utilisés en groupes carboxyliques par hydrolyse.Ensuite, ajoutez les anticorps et les molécules antisens via les groupes sulfhydryle du br spacer, de la MEA et du bouchon. Le spacer inutilisé par réaction avec le PDP permet, une fois le test terminé, d'évaluer la composition et la fonction du composé principal. Le médicament nanostructuré provient d'un modèle animal tel que des souris portant un cancer humain agressif.Le cancer du sein HER2 positif permet de déterminer l'efficacité du traitement ainsi que s'il s'accompagne ou non d'effets secondaires indésirables. Le principal avantage de la bioproduction par rapport aux méthodes synthétiques existantes, comme la polymérisation en chaîne, réside dans le fait que le biopolymère conserve une pureté optique totale et n'est pas contaminé par des sous-produits. Cette famille de nanomédicaments PolyPhen peut cibler n'importe quel type cellulaire grâce à un ciblage spécifique et réguler l'expression des protéines.En général, le traitement du cancer par les nanomédicaments à base de PHE est très efficace chez plusieurs modèles animaux, notamment les cancers cérébraux et mammaires primaires. Nous avons tout d'abord eu l'idée de bloquer la synthèse de la laminine spécifique au glioblastome sous ses formes isoformes, puis nous avons démontré le ciblage et l'inhibition des protéines HER2 et des protéines du cancer du sein triple négatif afin de prévenir la croissance tumorale. Les implications de cette technique s'étendent au diagnostic du cancer par imagerie optique et par résonance magnétique.Les médicaments poly-nano peuvent fournir des informations sur la distribution de médicaments pour le traitement du cancer. Ils peuvent également être appliqués à d'autres affections pathologiques telles que les maladies infectieuses, le soulagement de la douleur et les troubles neurologiques. Après avoir cultivé une culture initiale de plasmodium à partir d'un prélèvement sur spiale, inoculer 100 millilitres de milieu de culture basal et faire croître la culture à 25 degrés Celsius.L'incubateur thermostaté produit une quantité de microplasme modia compactée par gravité à l'abri de la lumière. Afin d'éviter la sporulation dans un réacteur biologique de 10 litres, dissoudre 80 grammes de carbonate de calcium dans huit litres de milieu basal, puis transférer le microplasme modia compacté dans le réacteur monté et programmer le bioprocédé pendant 75 heures. À 25 degrés Celsius, avec un débit d'air filtré de 10 litres par minute et une agitation de 150 tr/min assurée par un agitateur segmenté.Lorsque le bouillon de culture atteint un pH de 4,8, arrêtez la culture afin de mesurer la production d'acide polyacrylique. Refroidissez maintenant le bouillon à 17 degrés Celsius et laissez les cellules se déposer par gravité, puis retirez le surnageant de la culture du réacteur. Ajustez le pH à 7,5.Maintenant, faites passer le surnageant du bas à travers une colonne de 1,5 litre de DEAE cellulose équilibrée avec du chlorhydrate de tris 20 millimolaire, pH 7,5, à cinq degrés Celsius. Ensuite, faites passer trois colonnes de tampon de lavage contenant du chlorure de sodium 0,3 molaire du bas vers le haut de la colonne, puis éluerez le PMLA en présence de chlorure de sodium 0,7 molaire. Ajustez la fraction de PMLA éluée à du chlorure de calcium 0,1 molaire et ajoutez de l'éthanol glacé à 80 % pour précipiter le PMLA au calcium. Ensuite, fractionnez par taille le PMLA au calcium en utilisant du cidex G 25 et de l'eau.Enfin, passez chaque fraction sur une colonne à lumière ambrée et congélez immédiatement l'écoulement d'acide poly malique dans de l'azote liquide, puis lyophilisez avant de stocker à moins 20 degrés Celsius. Pour activer les groupes carboxyles du PMLA, mélangez un millimole d'unités de mala de P-M-L-A-H dans un millilitre d'acétone anhydre et un millimole chacun d'hydroxy CIN aide et de cylo heyl carbo ide dans deux millilitres de diméthylformamide ; après avoir agité à 20 degrés Celsius pendant trois heures, ajoutez 0,05 millimole de méthyl Pega mean dans un millilitre de DMF, suivi de 0,05 millimole de triéthylamine.Ensuite, ajouter de manière goutte à goutte 0,4 millimole de leucine éthylester et, après une heure, vérifier l'achèvement de la réaction par une réponse négative au test de la ninhydrine en chromatographie sur couche mince. De la même manière, ajouter 0,1 millimole de 2-mercaptoéthylamine et 0,5 millimole de TEA. Éliminer l'excès d'ester de NHS par hydrolyse spontanée à l'aide de solution saline tamponnée au phosphate.Désalez sur une colonne PD 10 et lyophilisez pour obtenir une poudre blanche. Conservez ce préconjugué à l'état sec à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 30 milligrammes d'anticorps dans 4,5 millilitres de chlorure de sodium 150 millimolaire dans du phosphate de sodium 100 millimolaire à pH 5,5. Réduisez les ponts disulfure à l'aide de tris 5 millimolaire, chlorure de 2-carboxyéthylphosphine, puis purifiez sur une colonne PD 10.Dissolve maintenant l'IDE PEG IDE dans deux millilitres du tampon ci-dessus, mais à un pH de 6,3. Ajoutez l'anticorps réduit et agitez à 20 degrés Celsius pendant une heure. Concentrez jusqu'à 2,5 millilitres sur une colonne AVEVA spin 20 avec une coupure à 30 kilodaltons, puis purifiez sur cidex G 75.À présent, vérifiez le produit par HPLC en chromatographie d'exclusion stérique. Mesurez la quantité à 280 nanomètres et confirmez également l'absence d'impuretés à d'autres longueurs d'onde. Ensuite, mélangez 50 milligrammes du préconjugué avec 200 UIM d'IDE de PEG conjugué à l'anticorps dans 5 millilitres de tampon à pH 6,3.Ajustez la concentration de sulfhydrule à deux millimolaires et incubez à 20 degrés Celsius pendant trois heures. Pour obtenir un rendement de 98 %, solubilisez l'oligonucléotide antisens amino en trois prime, faites-le réagir avec un volume de SPDP, purifiez l’A-O-N-P-D-P sur Cidex LH 20 dans le méthanol, puis évaporez le méthanol, dissolvez le produit dans l’eau et lyophilisez. Incubez maintenant 800 nanomoles de l’AOS activé avec le préconjugué d’anticorps PEG à MEA-SH toute la nuit. Lorsque la réaction d’échange de dissulfure est terminée, incorporez le bloc de colorant fluorescent, bloquez les excès de sulfhydryles avec PDP et purifiez sur Cidex G 75.Conserver le nano-médicament final à base d'acide poly malique à moins 20 degrés Celsius. Pour estimer la teneur en acide poly malique pendant la production, procéder comme suit : à 320 microlitres d'échantillon, ajouter 160 microlitres de chlorure d'hydroxylammonium à 10 % et 160 microlitres de soude à 10 %. Après 10 à 15 minutes, mélanger avec 160 microlitres de solution de chlorure ferrique à 5 % et visualiser la formation d'une couleur violet foncé à 540 nanomètres. Ensuite, hydrolyser le nano-médicament toute la nuit dans de l'acide chlorhydrique deux molaire à 110 degrés Celsius à l'aide d'un ampoule scellée, puis doser l'acide maléique par chromatographie en phase inversée.À l'aide d'échantillons dopés avec des étalons d'acide maléique. Cisaillez maintenant le nanomédicament avec 100 millimolaire de dihi trois etol et mesurez les oligonucléotides antisens morpholino par HPLC en phase inverse quantitative par rapport aux étalons d'ON morpholino. À l'aide du nanomédicament clivé, mesurez la teneur en anticorps à l'aide d'un kit de dosage des protéines afin de quantifier la teneur en PEG Malik.Tout d'abord, réalisez une réaction avec du thiocyanate d'ammonium OT, puis extrayez à l'aide de chloroforme et mesurez l'absorbance à 510 nanomètres. Testez l'activité de l'anticorps et la co-ligation par ELISA en utilisant cinq microlitres de nanomédicament par puits et 0,5 microgramme par puits d'Her2 comme antigène fixé sur la plaque. Enfin, calculez le pourcentage obtenu pour l'oligonucléotide antisens, l'EG et l'anticorps par rapport à l'acide maléique.Comparer avec le pourcentage prévu par la conception du médicament. Cette approche stratégique bimodale du médicament nano utilise l'Herceptin pour inhiber la voie de signalisation HER2 et un ON spécifique d'HER2 pour bloquer la transcription des anticorps du récepteur HER2, facilitant ainsi la transcytose via le TFR endothélial des vaisseaux tumoraux. La plateforme nanoconjuguée d'acide poly-maléique a été produite par un microplasme cultivé et purifié ; l'activation des groupes carboxyliques du PMLA a facilité la synthèse du squelette préconjugué.Et enfin, le nanocomplexe à base de plomb. Des tests Eli SA ont démontré la rétention d'anticorps monoclonaux actifs tout au long de la synthèse du médicament nanostructuré. Avec les deux anticorps assemblés sur la même plateforme polymère, une microscopie à fluorescence confocale a permis de suivre l'absorption cellulaire du médicament nanostructuré.Les images superposées à zéro et trois heures ont été analysées conjointement avec les endosomes marqués. Les coefficients de corrélation de Pearson pour la colocalisation indiquent une libération du nano-médicament à partir des endosomes vers le cytoplasme ainsi que la dissociation d'un ON du nano-médicament par clivage disulfure dépendant du glutathion dans le cytoplasme. In vitro, le nano-médicament principal a inhibé de manière significative la croissance, de façon particulièrement efficace, dans la lignée cellulaire surexprimant HER2.Des expériences in vivo chez des souris porteuses d'un cancer du sein humain BT 4 74 surexprimant HER2 ont montré une inhibition de la croissance supérieure à 95 % grâce au nanomédicament principal contenant l'Herceptin. Des analyses Western blot ex vivo spécifiques d'HER2 ont indiqué une inhibition de la synthèse d'HER2 ainsi que de la phosphorylation d'AKT, et le clivage de PARP marquait l'apoptose. La régression tumorale en réponse au traitement médicamenteux est démontrée par la réduction du volume tumoral et l'élimination des cellules tumorales observée lors de l'examen histologique.Vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser une plateforme nano-biocompatible pour obtenir un traitement personnalisé efficace sans effets secondaires, et pour élaborer un médicament nanostructuré à composition contrôlée et aux activités fonctionnelles vérifiées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée avec une forte reproductibilité après son développement. Cette méthode, utilisant une plateforme nanostructurée à base d'acide polyacrylique pour la délivrance ciblée d'oligonucléotides antisens, ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine nano-personnalisée pour explorer des traitements des tumeurs ciblant des marqueurs moléculaires tumoraux spécifiques identifiés par analyse génétique personnalisée. Sur le plan pharmacologique, les agents actifs et les cellules peuvent présenter un danger extrême.Des précautions telles que le port d'un masque et de gants doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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