Name: Induction pharmacologique de mélanine épidermique et la protection contre les coups de soleil dans un modèle humanisé de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Découvrez l'induction pharmacologique de mélanine épidermique par forskoline pour protéger la peau contre les UV dans un modèle murin humanisé. Cette méthode permet d'évaluer la sensibilité aux rayonnements et la résistance aux coups de soleil.

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Les auteurs tiennent à remercier Malinda Spry pour l&#39;assistance technique. Nous reconnaissons également les sources de financement actuelles et passées: l&#39;Institut national du cancer (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), le Fonds de recherche Wendy Will cas du cancer, la Fondation Markey Cancer, le Réseau de l&#39;enfance et la Jennifer et Dickens Research Foundation mélanome David.

Une. Préparation de la forskoline pour l&#39;administration topique d&#39;un extrait de racine de brut de l&#39;usine de Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) <ol><li> Protocoles pour expériences murines ont suivi les lignes directrices pour la conduite éthique dans le soin et l&#39;utilisation des animaux et ont été approuvés par la institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux Comité à l&#39;Université du Kentucky (Protocole # 00768M2004). L&#39;extrait de racine est constituée à 40% poids / volume dans une base dermatologique norme de 70% d&#39;éthanol, 30% de propylène glycol. </li><li> Peser 200 g de forskoline brut extrait de racine et le transférer dans un bêcher. Pour faire 500 ml de 40% (p / v) de solution, remettre en suspension 200 g de forskoline brut extrait de racine par l&#39;ajout de la plupart, mais pas la totalité du volume du véhicule (70% éthanol, 30% de propylene glycol) et porter la solution à environ 450 ml. </li><li> Agiter pendant une heure à température ambiante. La solution sera un peu visqueux et peut nécessiter une agitation manuelle de «lever» l&#39;extrait en solution avantla barre d&#39;agitation est en mesure de prendre le relais. </li><li> Après une heure d&#39;agitation, verser le mélange dans un cylindre gradué et porter le volume à 500 ml en utilisant un véhicule qui a été utilisé à &quot;rincer&quot; le bêcher qui a été utilisé pour agiter la bouillie (pour maximiser la récupération de la forskoline à partir du bécher) . </li><li> Transférer la suspension de tubes de 50 ml à centrifuger en polypropylène. Centrifugeuse (1500 xg, la température ambiante, 15 min) à l&#39;aide d&#39;une centrifugeuse de table. A ce moment, la matière insoluble sera assez compacté, ce qui permet au surnageant d&#39;être facilement déversé. </li><li> Filtrer la solution à travers une membrane d&#39;acétate de cellulose de 0,22 um pour éliminer toute matière insoluble résiduelle à partir de l&#39;extrait. On utilise un système de haut-bouteille conçue pour la culture cellulaire, ainsi que l&#39;utilisation des pré-filtres qui viennent avec l&#39;appareil pour éviter un colmatage prématuré de la membrane à partir de composants insolubles de l&#39;extrait de racine. Lors de grands volumes de l&#39;extrait, un filtrage d&#39;environ 100 ml à la fois, en changeant le pari préfiltreween chaque volume ajouté. </li><li> Lorsqu&#39;elles sont stockées à la température ambiante, l&#39;extrait maintient l&#39;activité biologique pour jusqu&#39;à un an. </li></ol> 2. Préparation de C57BL / 6 K14-Scf souris pour des traitements topiques <ol><li> Retirer dorsale fourrure des animaux par cisaillement électrique. Anesthésier brièvement les animaux avec de l&#39;isoflurane inhalation pour faciliter la tonte de dorsale fourrure avec des ciseaux électriques équipés d&#39;une tête préparatoire chirurgicale 0,25 mm (Fisher Scientific). De préférence, utiliser un seul type d&#39;anesthésie (par exemple, la kétamine / xylazine) pour minimiser les risques de surdose d&#39;anesthésique. La chambre d&#39;inhalation saturé comporte des risques au travail lorsqu&#39;il est utilisé en dehors d&#39;une hotte et fournit des quantités inconnues de l&#39;anesthésie des animaux. Idéalement, un vaporisateur de précision doit être utilisé. </li><li> Pour supprimer résiduelle chaume de cheveux, traiter les animaux avec un dépilatoire chimique. Administrer une anesthésie à l&#39;animal par une injection ip de la kétamine à 40 mg / kg de xylazine et 4 mg / kg </li&gt; <li> Lorsque les animaux sont anesthésiés de façon adéquate (à en juger par pincement de l&#39;orteil), appliquer une quantité doigt de taille de crème dépilatoire à cisaillé peau du dos à l&#39;aide d&#39;un doigt ganté. Frottez la crème dans la peau pendant 30-60 secondes ou jusqu&#39;à ce que les poils sont clairement visibles dans la crème comme il est déplacé. Laissez la crème sur que pour le montant minimum de temps nécessaire pour l&#39;épilation comme l&#39;exposition prolongée conduit à la combustion chimique de la peau, l&#39;éclatement de l&#39;épiderme et de la mort de la perte de l&#39;intégrité de l&#39;épiderme. </li><li> Essuyez la peau du dos avec des tampons de gaze imbibée d&#39;eau jusqu&#39;à ce que toutes les crèmes a été supprimé. Animaux à sec utilisant des serviettes en papier doux, et leur permettront de récupérer dans un endroit isolé chaud (par exemple cages propres placés sur un coussin chauffant). Épiler les animaux un par un et suivre de près tout au long de la procédure. </li></ol> 3. L&#39;administration topique de la forskoline ou de contrôle des véhicules <ol><li> Les animaux doivent être traités un à la fois. Anesthésier brièvement à inhalerd isoflurane en plaçant la souris au-dessus d&#39;un filtre en nylon perméable à l&#39;air de forme équipée en vertu de laquelle a été placé un papier essuie-isoflurane saturé dans un bocal en verre avec couvercle clair isoflurane saturé dans une hotte. Exposer la souris à l&#39;isoflurane pendant un temps suffisant pour supprimer les mouvements musculaires volontaires mais aussi pour préserver la respiration spontanée (typiquement 10-20 sec). Laissant l&#39;animal dans l&#39;isoflurane trop longtemps se traduira par la suppression respiratoire et la mort. Il est préférable de pécher par excès de «lumière qui&quot; et d&#39;avoir à ré-exposer la souris brièvement plus isoflurane plutôt que de sur-exposer l&#39;animal à la mort de la drogue et les risques. </li><li> Retirer l&#39;animal de la chambre de l&#39;isoflurane et le placer sur un tapis de banc absorbant propre. </li><li> Avec une micropipette 1000 pi équipé d&#39;une pointe de polypropylène à usage unique, établir 400 ul de 40% d&#39;extrait de forskoline brut (animaux de contrôle du véhicule recevront 70% d&#39;éthanol, 30% de propylène glycol seul). </li><li> Transvaser l&#39;extrait sur ledos de l&#39;animal par égouttement il sur la peau, puis, à l&#39;aide du côté de la pointe de la pipette, appliquer l&#39;extrait sur la peau du dos jusqu&#39;à ce que toute la peau a été couvert. Il n&#39;est pas nécessaire d&#39;effacer la peau après application. </li><li> Retour de la souris dans sa cage, et observer attentivement jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère de l&#39;anesthésie. </li><li> Afin que les effets de l&#39;AMPc non pigments ne doivent pas confondre expériences de sensibilité UV, arrêter tous les traitements topiques deux jours avant l&#39;exposition aux UV (effet de pigment dure plusieurs jours au-delà dernier traitement topique). </li></ol> 4. Couleur de la peau de mesure par colorimétrie réfléchissant <ol><li> Anesthésier brièvement la souris avec de l&#39;isoflurane en inhalation (voir ci-dessus). </li><li> Calibrer un colorimètre Minolta en plaçant la tête portable sur la surface blanche standard fourni avec le colorimètre. </li><li> Placez la tête de mesure portable de la chasse du colorimètre avec la peau du dos de l&#39;animal assurer que le cycle apertur 1 cm 2e est complètement enfoncé sur la peau. Prenez au moins trois mesures distinctes dans différents domaines de la peau du dos. </li><li> Calculer moyenne L * Partition ± SD par animal et par groupe de traitement. Colorimétrie réfléchissante peut se faire à n&#39;importe quel moment dans l&#39;expérience. </li></ol> 5. Détermination de la sensibilité aux UV par calcul de &quot;Minimal érythémateuse Dose&quot; (MED) <ol><li> Utiliser des animaux qui ont été pré-traitées avec le véhicule ou la forskoline comme décrit ci-dessus. Anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale d&#39;un mélange standard de kétamine et de xylazine (voir ci-dessus). </li><li> Préparer un morceau de ruban adhésif occlusif-UV pour les tests MED. Pour générer des trous dans la bande, utilisez une perforatrice de grande puissance avec une découpe circulaire 1 cm 2 (Figures 2A et B). Ayant des trous d&#39;une taille définie et la disposition symétrique dans la bande facilite la reconnaissance de modifications de la peau après irradiation. Sur chaque trou dans la bande, appliquer une petite mais facilement détachable pièce<html> de ruban qui peut être retiré à des instants définis pendant l&#39;exposition aux UV pour permettre l&#39;administration de différentes doses d&#39;UV. </li><li> Lorsque les animaux sont suffisamment sédation, placez le ruban sur la surface dorsale. lubrifiant des yeux doit toujours être utilisée sous anesthésie. </li><li> Allumez la source UV composé de deux Westinghouse F15T8UV-B lampes avec une puissance de pointe de 313 nm et une gamme de 280-370 nm. Laissez la lampe à s&#39;équilibrer à une sortie d&#39;UV constante telle que mesurée par un photomètre UV avec un capteur de rayons UVB (faut généralement quelques minutes pour les lampes à réchauffer). </li><li> Sur la base de la vitesse de transmission des UV, tel que mesuré par le photomètre UV, UV calculer le temps d&#39;exposition pour chaque dose désirée. Par exemple, UVB mesures de sortie de notre lampe de 2,4 mW / cm 2. Par conséquent, l&#39;administration de 5 kJ / m 2, la peau aurait besoin d&#39;être exposé à 208 sec (qui est de 3 min et 28 s) de rayonnement UVB, tel que calculé ci-dessous: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Placez les animaux sous sédation (chacune avec bande occlusif en place) ventrale de surface vers le bas pour assurer une exposition même UV. Pour administrer les doses choisies de rayonnement UV, retirer successivement les petites bandes occlusifs couvrant les trous d&#39;exposer 1 cm 2 zones de peau à des doses correctes de rayonnement. Par conséquent, en utilisant l&#39;exemple ci-dessus, si 40 kJ / m 2 est la plus grande dose dans l&#39;expérience, alors que l&#39;animal serait sous la lampe à 27 min et 47 sec total de la peau et dans la condition de 40 kJ / m 2 n&#39;aurait pas d&#39; bande recouvrant tout le temps. Cependant, la bande recouvrant la condition 5 kJ / m 2 serait supprimé quand il ya 208 sec restant dans l&#39;exposition. Moment de retrait de la bande doit être fait pour que chaque état se termine en même temps. </li><li> Après l&#39;exposition aux UV, ôtez la pellicule de la peau du dos, en prenant soin de ne pas déchirer la peau avec des mouvements brusques ou trop énergiques. Placer les animaux dans un endroit calme au chaud pour permettrerécupération de l&#39;anesthésie. </li><li> Surveillance de la souris pendant 24-48 heures à chercher des zones discrètes de l&#39;érythème (rougeur) ou œdème (gonflement) correspondant à des sites anatomiques exposés à la dose spécifique de l&#39;irradiation UV. Documenter les résultats de la peau photographiquement. </li><li> MED valeur correspond à la dose minimale d&#39;UV qui provoque une inflammation telle que définie par un érythème et / ou d&#39;œdème de l&#39;ensemble du cercle de peau exposée. Notez que la pigmentation de la peau peut contester la détermination de MED, cependant, un érythème et un oedème peuvent encore généralement être évalués avec précision, grâce en partie à la forme définie des ouvertures dans la bande pendant l&#39;exposition aux UV. </li></ol> 6. Analyse statistique Analyser les données entre les cohortes de souris par une ANOVA avec post-test de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Des valeurs de p &lt;0,05 sont considérées comme statistiquement significative.

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

En utilisant un modèle animal de l&#39;être humain à la peau claire, nous constatons que l&#39;application topique d&#39;un extrait brut racine forskoline riche s&#39;assombrit robuste l&#39;épiderme en stimulant la production de mélanine dans la peau. Mélanisation épidermique est dépendante de l&#39;expression du facteur de cellules souches dans l&#39;épiderme basales, comme cela se produit dans la peau humaine, mais pas dans la peau non modifiée génétiquement souris. La peau dorsale de souris génétiquement non-modifié...

L&#39;incidence du mélanome, la forme la plus mortelle de cancer de la peau, a considérablement augmenté au cours des dernières décennies aux États-Unis, en particulier chez les personnes à peau claire. Preuve moléculaire et épidémiologique forte implique rayonnement UV comme un facteur causal majeur de l&#39;environnement 2-5. L&#39;exposition aux UV renforcée sous forme d&#39;exposition au soleil et l&#39;utilisation des lits de bronzage est susceptible d&#39;être responsable de la plupart des augmentations de mélanome incidence 6-7. risque de mélanome semble particulièrement liée à des coups de soleil 8, en particulier ceux au début de la vie 9-10. Le risque de coup de soleil est liée non seulement à la dose et l&#39;intensité de l&#39;exposition aux UV, mais aussi par des facteurs héréditaires qui influencent la réponse cutanée à un rayonnement UV. pigmentation de la peau est l&#39;un des déterminants les plus importants de la sensibilité aux UV, le risque de coups de soleil et le risque de cancer. Le mélanome se produit environ vingt fois plus souvent chez les personnes à peau claire par rapport à individua peau foncéels 11-13. La mélanine, un pigment produit par les mélanocytes de l&#39;épiderme, est le principal déterminant de teint de la peau. La mélanine est disponible en deux variétés principales: (1) l&#39;eumélanine, un pigment brun / noir foncé efficace pour absorber l&#39;énergie du rayonnement UV, et (2) phéomélanine, un rouge / pigment blond moins efficace pour prévenir la pénétration de photons UV dans la peau. couleur de la peau, la sensibilité aux UV et le risque de mélanome sont en grande partie déterminées par le contenu épidermique eumélanine 14-15. Le plus eumélanine dans l&#39;épiderme, les photons UV moins peut pénétrer dans la peau. En raison de faibles niveaux innées de l&#39;eumélanine, les personnes à la peau claire sont beaucoup plus sujettes à des effets aigus et chroniques du rayonnement UV 16-18. la pigmentation de la peau, le mélanome et le risque de la capacité de &quot;bronzage&quot; après l&#39;exposition aux UV tout en corrélation avec la capacité de signalisation du récepteur de la mélanocortine 1 (Mc1r), une s-G à sept domaines transmembranaires couplés srécepteur de urface sur les mélanocytes 19-22. Lorsque Mc1r se lie à son ligand apparenté à haute affinité, α-mélanocyte stimulating hormone (α-MSH), il est l&#39;activation de l&#39;adénylcyclase et la production de la deuxième camp de messager 23. La réponse physiologique normale de la peau après exposition aux UV comprend la production de l&#39;épiderme de α-MSH par les kératinocytes 24-29. Nous émettons l&#39;hypothèse que d&#39;autres et de kératinocytes dérivées de α-MSH se lie à Mc1r sur les mélanocytes épidermiques, s&#39;engageant dans la production en aval du second messager AMPc par l&#39;activation de l&#39;adénylcyclase 30. taux d&#39;AMPc contrôlent de nombreux aspects de la différenciation des mélanocytes, y compris les voies de survie, réparation de l&#39;ADN et de la synthèse du pigment. signalisation de l&#39;AMPc Mc1r et induisent clairement les niveaux de l&#39;enzyme de pigments et de la production de l&#39;eumélanine. Lorsque la signalisation Mc1r est intacte et les taux d&#39;AMPc mélanocytaires sont robustes, l&#39;eumélanine est produite et la peau s&#39;assombrit. Toutefois, si la signalisation Mc1r est défectueux etles taux d&#39;AMPc cytoplasmiques restent faibles, pheomelanin est produite à la place 1. synthèse de eumélanine peut être stimulé pharmacologiquement par des agents qui augmentent le taux d&#39;AMPc 1,14,31-35. Depuis la protéine Mc1r est un régulateur majeur du risque de mélanome chez l&#39;homme 36-46, nous sommes intéressés aux mécanismes par lesquels Mc1r protège les mélanocytes contre la carcinogenèse induite par les UV. En tant que fondation pour nos études, nous avons généré un Mc1r-modèle murin transgénique variante sur un pur C57BL / 6 génétique 1. Dans ce modèle, facteur des cellules souches (SCF) est constitutivement exprimé dans l&#39;épiderme basaux et des mélanocytes épidermiques interfolliculaires sont retenus dans la peau tout au long de la vie 47, contrairement aux souris non-transgénique, dans lequel mélanocytes localiser au derme dans les follicules pileux. Avec le transgène K14-Scf incorporé, l&#39;épiderme devient pigmenté avec notamment la caractéristique de la mélanine de pigments de pigmentsouche de l&#39;animal 1. souris K14-SCF sur le fond génétique C57BL / 6 de type sauvage signalisation Mc1r ont la peau noire de jais caractérisé par des niveaux très élevés de l&#39;eumélanine pigment. Sans surprise, ces animaux sont très résistants aux UV. En revanche, génétiquement adaptés K14-SCF C57BL / 6 animaux qui abritent un inactif Mc1r mutant n&#39;ont presque pas d&#39;eumélanine dans l&#39;épiderme. Au lieu de cela, ces animaux «d&#39;extension» (Mc1r e / e) ont un teint de peau juste causée par le dépôt de pheomelanin pigment (figure 1A) et sont beaucoup plus sensibles aux UV 48-49. Composés pharmacologiques ayant des propriétés chimiques qui permettent la pénétration dans la peau ont été montré pour induire puissamment eumélanine dans le prolongement (Mc1r e / e) modèle animal K14-Scf en manipulant directement les taux d&#39;AMPc dans les mélanocytes de l&#39;épiderme de la peau. La mélanine régulation à la hausse dans ce modèle a été reported par adénylylcyclase activation 1 ainsi que de la phosphodiestérase 4 inhibition 35. Dans cet article, nous démontrons la préparation et l&#39;application topique de la forskoline en extension (Mc1r e / e) animaux K14-SCF qui modèle la sensible aux UV humain à la peau claire. Nous montrons que l&#39;application deux fois par jour du médicament favorise la mélanisation accélérée, ce noircissement de la peau est due au dépôt de l&#39;épiderme de mélanine et qui induit la mélanine épidermique protège contre les coups de soleil induite par les UV à travers la mesure de la &quot;dose minimale érythémateuse&quot; (MED) 48.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>Réactifs</fort></td></tr><tr><td>Extrait de Coleus Forskoli 20 %</td><td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>n/a</td><td>Princeton, NJ</td></tr><tr><td>Isothesia, Isoflurane , USP</td><td>Butler Schein</td><td>NCD 11695-6776-1</td><td>Dublin, OH, États-Unis</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Anased Injection</td><td>LA04612</td><td>Shenandoah, Iowa, États-Unis</td></tr><tr><td>Kétamine HCl, USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>St. Joseph, MO, États-Unis</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>Propylène glycol</td><td>Adesco</td><td>05751L</td><td>Solon, OH, États-Unis</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire, Nair</td><td>Church Dwight</td><td>JF-11 4381322</td><td>Priceton, NJ</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Germicide Hg Lamp UV-B</td><td>Westinghouse</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>Radiomètre photomètre</td><td>International light</td><td>1LT400A</td><td>Peabody, MA, USA</td></tr><tr><td>Chromamètre</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr><tr><td>Processeur de données pour chromamètre CR-400</td><td>Konica Monilta</td><td>DR-400</td><td>Ramsey, NJ, États-Unis</td></tr></tbody></table>

induction pharmacologique de mélanine épidermique et la protection contre les coups de soleil dans un modèle humanisé de souris

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Équité de la peau, la sensibilité aux UV et le risque de cancer de la peau tout en corrélation avec la fonction physiologique du récepteur de la mélanocortine 1, une protéine de signalisation G s couplé trouve à la surface des mélanocytes. Mc1r stimule l&#39;adénylyl cyclase et la production d&#39;AMPc qui, à son tour, régule à la hausse la production de mélanine dans les mélanocytes de la peau. Afin d&#39;étudier les mécanismes par lesquels la signalisation Mc1r protège la peau contre les dommages UV, cette étude s&#39;appuie sur un modèle de souris avec &quot;peau humanisé&quot; basé sur l&#39;expression épidermique du facteur de cellules souches (SCF). Souris transgéniques K14-SCF conservent mélanocytes dans le épiderme et ont donc la possibilité de déposer la mélanine dans l&#39;épiderme. Dans ce modèle animal, type sauvage résultats de l&#39;état Mc1r en dépôt solide de pigment noir de l&#39;eumélanine et un phénotype anti-UV. En revanche, les animaux K14-SCF avec signalisation défectueux Mc1r capacité présentent une pigmentation rouge / blonde, très peu d&#39;eumélanine dans la peau etun phénotype sensible aux UV. Raisonnement que le dépôt de l&#39;eumélanine pourrait être renforcée par des agents topiques qui imitent signalisation Mc1r, nous avons constaté que l&#39;application directe de l&#39;extrait de la forskoline sur la peau de souris à la peau claire Mc1r défectueux a entraîné robuste induction de l&#39;eumélanine et la protection UV 1. Nous décrivons ici la méthode pour la préparation et l&#39;application d&#39;un extrait de racine naturelle contenant la forskoline à des souris à la peau claire K14-SCF et signaler une méthode pour mesurer la sensibilité aux UV par déterminer la dose érythémateuse minimale (DEM). En utilisant ce modèle animal, il est possible d&#39;étudier comment épidermique AMPc induction et la mélanisation de la peau affectent les réponses physiologiques à l&#39;exposition aux UV.

Souris C57BL / 6 ont été générées sur un fond eumelanotic, pheomelanotic ou amélanotiques intégrant le transgène K14-SCF comme décrit (figure 1A). Cohortes d&#39;extension à la peau claire (Mc1r e / e, Tyr + / +) souris ont été traitées par voie topique avec deux doses quotidiennes de véhicule (70% d&#39;éthanol, 30% de propylène glycol) ou 40% d&#39;extrait de coleus brut forskohlii racine (80 uM par dose) pendant 5 jours (Figure 2B). Ef...

Mélanine épidermique est induite par l&#39;application topique de la forskoline dans un modèle murin de la sensible aux UV humain à la peau claire. Manipulation pharmacologique du taux d&#39;AMPc dans la peau et l&#39;épiderme assombrissant fortement protéger contre l&#39;inflammation médiée par les UV (coups de soleil), telle que mesurée par la dose érythémateuse minimale (DEM) de dosage.

Induction pharmacologique de mélanine épidermique et la protection contre les coups de soleil dans un modèle humanisé de souris

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer la sensibilité aux UV en déterminant la dose érythémateuse minimale chez des souris à peau claire prétraitées avec quatre types de peau. Cela est réalisé en préparant d'abord la peau dorsale des souris à être irradiée par épilation et ablation. Ensuite, des traitements topiques de forskoline sont appliqués sur la peau dorsale.Ensuite, les souris sont exposées à différentes doses d'irradiation UV afin de déterminer les effets du mélon intermédiaire sur l'inflammation induite par les UV. Les résultats obtenus montrent qu'une application topique de forline augmente fortement la pigmentation cutanée, et que les animaux dont le mélanine a été pharmacologiquement renforcée sont résistants aux UV, comme déterminé par la DME (dose érythémateuse minimale). Il s'agit d'études de principe démontrant qu'il est possible d'induire pharmacologiquement un bronzage chez un individu incapable de bronzer en raison d'un défaut dans un gène très important des mélanocytes appelé récepteur de la mélanocortine 1 ou MC1R. Dans les populations humaines, la perte de fonction de MC1R est corrélée à une sensibilité accrue aux UV, à une tendance aux coups de soleil, à l'incapacité de bronzer, et plus tard dans la vie, à un risque accru jusqu'à quatre fois de développer un mélanome.Nous avons choisi la sculline comme médicament pour ces études car elle est capable de contourner une voie de signalisation déficiente du récepteur de la mélanocortine et d'induire les mélanocytes à croire qu'ils possèdent une voie de signalisation mc1r fonctionnelle, ce qui entraîne une forte production de mélanine, dépôt de celle-ci dans la peau et protection des animaux contre les radiations UV. Bien que nous sachions que cette méthode offre des aperçus sur la peau capable et sobre, elle pourrait également être importante pour la prévention du cancer.Étant donné que nous savons que le rayonnement UV est le principal carcinogène pour la grande majorité des cancers de la peau et que le renforcement de la mise en œuvre de la protection cutanée prévient les lésions dues aux UV, une fois les injections intrapéritonéales effectuées. Veillez à faire une aspiration après le positionnement de l'aiguille et avant l'injection du contenu afin de vous assurer que l'aiguille n'a pas pénétré un vaisseau sanguin, l'intestin ou la vessie urinaire. Les injections intrapéritonéales doivent être administrées du côté droit pour éviter la rate. Après avoir préparé l'extrait de forline et anesthésié brièvement la souris à l'isoflurane.Par inhalation, selon le protocole décrit, administrer un anesthésique supplémentaire à l’animal par injection intrapéritonéale de kétamine et de xylazine. Effectuer une pression sur l’orteil afin de vérifier la sédation. Utiliser des ciseaux électriques équipés d’une tête chirurgicale de préparation de 0,25 millimètre pour raser le pelage dorsal.Utilisez une crème dépilatoire pour éliminer les poils ras. Ensuite, afin d'éviter de brûler ou d'endommager la peau, utilisez immédiatement des compresses de gaze imbibées d'eau pour essuyer doucement la peau dorsale jusqu'à ce que toute la crème soit retirée. Utilisez des essuie-tout doux pour sécher l'animal avant de le placer dans une cage propre sur un tapis chauffant afin qu'il se remette.En général, les souris doivent être anesthésiées brièvement afin de faciliter l'administration topique de forskoline ou de solutions témoins par inhalation d'isoflurane sous hotte. Commencez par placer une serviette en papier saturée en isoflurane dans un bocal en verre transparent rempli de litière saturée en isoflurane. Après avoir fixé un filtre en nylon ajusté perméable à l'air, anesthésiez la souris en la plaçant au-dessus du filtre pendant un temps suffisant pour supprimer les mouvements musculaires volontaires, avec l'animal sédaté posé sur un tampon absorbant propre. Après avoir effectué une pression sur l'orteil, transférez 400 microlitres d'extrait brut de forline sur le dos de l'animal en le déposant goutte à goutte sur la peau. Ensuite, utilisez le côté de la pipette pour étaler l'extrait sur toute la surface de la peau dorsale exposée. Replacez la souris dans sa cage et observez-la attentivement jusqu'à ce qu'elle se réveille de l'anesthésie afin d'éviter toute dépigmentation.Les effets du AMP cyclique à partir d'expériences de sensibilité UV biaisées. Interrompre tous les traitements topiques deux jours avant l'exposition aux UV afin d'effectuer la colorimétrie réfléchie. Après avoir anesthésié brièvement la souris par inhalation d'isoflurane.Étalonnez un colorimètre en plaçant la tête de mesure portable sur la surface blanche normalisée fournie avec l'appareil. Placez la tête de mesure portable à fleur de la peau dorsale de l'animal, en veillant à ce que l'ouverture ronde d'un centimètre carré soit complètement appuyée contre la peau. Effectuez au moins trois mesures distinctes dans différentes zones de la peau dorsale.Calculez le score L moyen, plus ou moins l'écart type par animal et par groupe de traitement. Pour déterminer la dose érythémateuse minimale ou DEM, chaque animal sera exposé à diverses doses d'UV. Commencez par préparer un morceau de ruban occlusif UV en utilisant un perforateur robuste avec une découpe circulaire d'un centimètre carré afin de percer des trous dans le ruban au-dessus de chaque orifice.Sur le ruban. Appliquez un petit morceau de ruban facilement détachable qui peut être retiré. Pour l'exposition aux UV, placez le ruban sur la surface dorsale de la souris anesthésiée.Si les yeux de l'animal sont ouverts, appliquer des larmes artificielles afin de prévenir les lésions dues au dessèchement et à l'exposition aux UV. Allumer la source UV composée de deux lampes UVB ayant une émission maximale à 313 nanomètres et une plage de 280 à 370 nanomètres. Laisser le bélier s'équilibrer à un flux UV constant, puis utiliser un photomètre UV muni d'un capteur UVB pour vérifier le flux en fonction du taux de transmission UV mesuré par le photomètre ; calculer ensuite la durée d'exposition aux UV pour chaque dose souhaitée.Par exemple, la sortie UVB de vos lampes mesure 2,4 milliwatts par centimètre carré. Par conséquent, pour administrer cinq kilojoules par mètre carré, la peau devrait être exposée à 208 secondes de rayonnement UVB, comme calculé ici. Ensuite, placez l'animal anesthésié avec la surface ventrale vers le bas afin d'assurer une exposition uniforme aux UV et d'administrer la dose choisie de rayonnement de manière séquentielle.Retirez les petits morceaux de ruban adhésif recouvrant les trous au moment approprié. Par exemple, si la dose la plus élevée est de 40 kilojoules par mètre carré, la souris restera sous la lampe pendant 27 minutes et 47 secondes, et le trou correspondant à cette dose sera exposé dès le début. En revanche, pour la condition à cinq kilojoules par mètre carré, le ruban sera retiré après 208 secondes d'exposition.Une fois l'exposition aux UV terminée, retirez soigneusement le ruban adhésif et placez les animaux dans un endroit chaud et calme afin qu'ils se remettent de l'anesthésie avant de les replacer dans leurs cages. La dose érythémateuse minimale, ou valeur DEM, correspond à la dose minimale d'UV provoquant une inflammation définie par un érythème et/ou un œdème sur l'ensemble du cercle de peau exposé. Surveillez la souris pendant 24 à 48 heures afin de détecter d'éventuelles zones localisées d'érythème ou d'œdème dans les régions exposées aux UV.Parfois, le duvet résiduel peut entraver l'interprétation du test de DME en masquant une érythème ou un œdème cutané sous-jacent ; humidifier la peau avec de l'éthanol à 70 % rend la peau beaucoup plus facile à interpréter. Documenter photographiquement toute manifestation cutanée, puis ramener les souris au vivarium. Dans ces expériences, des souris C57BL/6 noires ont été générées sur des fonds génétiques anodiques ou anodiques, intégrant le transgène du facteur de croissance des cellules souches K14, ce qui permet aux souris de conserver des mélanocytes dans l'épiderme et, par conséquent, de déposer de la mélanine.Dans l'épiderme illustré ici, des groupes de souris à peau claire de la lignée extension ont été traités pendant cinq jours par voie topique, deux fois par jour, soit avec le véhicule, soit avec un extrait brut à 40 % de racine de colus fors coly. Les effets des traitements topiques sur la pigmentation épidermique ont été évalués à la fois par inspection visuelle et par imagerie de couleur réfléchie. L'application de l'extrait de racine a entraîné un assombrissement épidermique marqué chez les souris transgéniques K14-SCF, mais pas chez les animaux non transgéniques génétiquement apparentés, suggérant que la présence de mélanocytes épidermiques interfolliculaires est nécessaire pour que la mélanine induite pharmacologiquement puisse être déposée.Dans l'épiderme, bien que l'extrait de racine soit fortement coloré en raison de la présence de phytochimiques végétaux en plus de la galine-4, l'assombrissement de la peau ne peut pas être attribué uniquement à un effet de coloration du médicament. Comme les animaux non transgéniques ne présentent pas d'assombrissement cutané avec l'extrait de racine, tel qu'illustré ici lors d'une application topique deux fois par jour, les effets de la forskoline sur la mélanine ont été observés en aussi peu que deux jours. Bien qu'un assombrissement maximal soit apparu après plusieurs jours supplémentaires, comme le montre cette figure par la coloration au font mason et la coloration de la mélanine sur des coupes de peau dorsale.Le degré de mélanisation dépend de la dose : les animaux traités avec quatre applications cutanées par jour pendant 15 jours ou deux fois par jour pendant cinq jours présentent des quantités comparables d'assombrissement cutané. De plus, aucune toxicité évidente n'a été observée après l'exposition à quatre applications cutanées dans l'un ou l'autre groupe de traitement. Ainsi, nous avons conclu que le traitement accéléré sur cinq jours induit une mélanisation sûre de la peau dorsale aussi efficacement que le traitement standard appliqué une fois par jour.Cette figure montre que, mesurée par le test de DME, l'induction d'un mélan dans l'épiderme par la forline a entraîné une protection UV importante, tandis que la DME moyenne chez les souris K14 SCF transgéniques traitées deux fois par jour pendant cinq jours avec le véhicule était de 5,0 ± 0,0 kilojoule par mètre carré. La DME moyenne chez les cohortes traitées avec la fourgaline topique était supérieure à 30,0 ± 0,0 kilojoule par mètre carré. En effet, une dose de 30,0 kilojoules par mètre carré s'est révélée insuffisante pour induire un érythème. Dans cette expérience utilisant une administration topique standard de force Glen, la DME moyenne chez les souris K14 SCF transgéniques traitées était de 50,0 ± 7,1 kilojoules par mètre carré.Importamment, les applications de la fourrure de Kline n'ont pas affecté le DME des animaux incapables de produire du mélanin, soit en raison de l'absence de mélanocytes épidermiques médiés par le SCF K14, soit en raison d'une déficience en tyrosinase. Étant donné que les applications de la fourrure de Kline ont été interrompues deux jours avant l'exposition aux UV et n'ont pas été poursuivies après cette exposition, nous concluons que les effets non pigmentaires des CAMP n'ont pas joué de rôle dans les résultats du DME. Plutôt, les données suggèrent que le mélanin épidermique était le mécanisme par lequel la fourline induisait une protection contre les UV dans ce modèle.Une fois maîtrisée, cette technique permet une évaluation facile et reproductible de la réponse de la pigmentation cutanée et de la sensibilité aux ultraviolets. Chez le modèle animal, l'application du forland prend seulement quelques minutes par jour, et la majeure partie du temps expérimental est en réalité consacrée à l'irradiation UV et aux tests de DME. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la peau retrouve progressivement sa couleur claire de base par voie pharmacologique.L'induction de la mélanine est très similaire à la réponse nain en ce sens que la peau restera foncée tant qu'elle est stimulée, puis ce bronzage s'estompera progressivement de la peau au cours des quelques semaines suivantes lorsque le stimulus est retiré.

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