Name: Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation dun solvant organique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: Découvrez un essai de microplaques par fluorescence pour évaluer les effets du triclosan sur la dégranulation des mastocytes RBL-2H3 sans solvant organique. Cette méthode permet de quantifier rapidement la libération de bêta-hexosaminidase.

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LMW et RHK sont pris en charge par la Graduate School UMaine des sciences et de génie (GSBSE) biomédical; RHK a également été soutenue par le Maine Agricultural Experiment Station &amp; Forêt. Un financement supplémentaire a été fourni par l&#39;Institut national des sciences médicales générales (NIH P20-GM103423), le Maine et agricole Experiment Station Forest (Nombre Grant ME08004-10, JAG), l&#39;Université du Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) , et un démarreur de subventions de recherche en pharmacologie / toxicologie de la fondation PhRMA (JAG). Nous remercions les Drs. David Holowka et Barbara Baird pour l&#39;antigène et les cellules. Nous sommes reconnaissants envers Hina Hashmi, Alejandro Velez, et Andrew Abovian de l&#39;aide avec l&#39;équipement et les commandes. C&#39;est Maine agricole et forestier Experiment Station numéro de publication 3311.

Nous n&#39;avons rien à révéler.

En 2004, Naal et al. 1 développé un biocapteur des mastocytes de test à haut débit de la dégranulation. Il s&#39;agit d&#39;un test robuste que nous avons adapté à nos études TCS et détaillées dans cette vidéo. Avant la Naal et al. 1 essai, la dégranulation des mastocytes a été évaluée régulièrement par β-hexosaminidase 59-61, mais ces premières méthodes utilisées fluoromètres dont un échantillon a été lue à la fois. Surtout, Naal et al. concordance directe établie entre leur métho...

Les mastocytes sont très granulé cellules immunitaires effectrices qui servent de médiateurs clés dans l&#39;asthme, les allergies, parasite de la défense et la carcinogenèse 13-16. Ils résident dans presque tous les tissus vascularisés 15, où ils stockent en toute sécurité médiateurs inflammatoires et allergiques dans les granules cytoplasmiques avant d&#39;être activée à dégranuler. Dégranulation est l&#39;exocytose des granules liés à la membrane, ce qui entraîne la libération de médiateurs pharmacologiquement actives telles que l&#39;histamine, la tryptase, et leucotriènes 15. Ce procédé conduit à l&#39;initiation de type I des réactions d&#39;hypersensibilité qui sont essentiels à la défense de montage contre les parasites ainsi que le lancement des réactions allergiques, asthmatiques, et cancérigène 15. Les mastocytes et les basophiles expriment des récepteurs FceRI, les récepteurs de haute affinité pour les immunoglobulines E (IgE) 17. L&#39;exposition à un allergène ou antigène provoque l&#39;agrégation de multiples récepteurs FceRI IgE liés 17, et c&#39;est ce so-disant «réticulation» de récepteurs Fc des IgE liés qui déclenche le processus de dégranulation: une cascade d&#39;événements tyrosine phosphorylation, l&#39;activation de la phospholipase C, flux de calcium dans les magasins internes, et l&#39;afflux de calcium dans la cellule 18. Cet afflux de calcium est nécessaire à la dégranulation, et, en outre, les signaux de fusion des granules avec la membrane avant de provoquer l&#39;exocytose des granules 15. Expérimentalement, un ionophore du calcium peuvent être utilisés pour faire la navette calcium directement à travers la membrane de la cellule 19, ce qui évite pratiquement tout transduction du signal étapes avant l&#39;étape de l&#39;influx de calcium 20, permettant l&#39;identification d&#39;une cible de la voie par un produit toxique comme étant en amont ou en aval de signalisation de calcium 20. Dégranulation peut être mesuré rapidement et efficacement en surveillant la libération de β-hexosaminidase dans un surnageant de cellules, qui est libéré à partir des granulés linéairement le long d&#39;histamine 6, mais is beaucoup plus facile à détecter à l&#39;aide d&#39;une simple réaction enzyme-substrat, et un lecteur de microplaque pour doser le produit fluorescent. Ce dosage en microplaque, tel que décrit dans la section du protocole, est basée sur une méthode robuste développé à l&#39;origine par Naal et al. 1, qui quantifie le clivage du substrat fluorogénique 4-méthylumbelliféryl-N-acétyl-β-D-glucosaminide par β- hexosaminidase. Nous avons modifié l&#39;analyse des effets des essais de médicaments et de substances toxiques, avec triclosan a mis en évidence ici. Cette méthode quantifie de manière fiable la dégranulation, est une alternative peu coûteuse pour, par exemple, les méthodes de détection par cytométrie en flux offre 21, et a le potentiel pour se prêter gentiment de criblage à haut débit d&#39;une grande variété de médicaments anti-allergiques, ainsi que immunotoxiques ou de produits chimiques allergènes. Ce dernier point est particulièrement important à la lumière du rapport de 2007 du Conseil national de recherches &quot;Tests de toxicité au 21ème siècle: une vision et une Stratgie &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), qui milite pour le développement de tests de toxicologie à haut débit qui utilisent la culture cellulaire pour réduire l&#39;utilisation coûteuse des animaux de laboratoire traditionnels tels que la souris. Le protocole mis au point par la dégranulation Naal et al. 1 et modifié par nous 2, utilise la lignée de cellules RBL-2H3 qui est un modèle bien accepté homologue à mastocytes des muqueuses de l&#39;homme ou des basophiles 5.3. (Méthodes de culture de cellules RBL-2H3 sont détaillés dans Hutchinson et al. 22). Ce test pourrait probablement être adapté à tout type de mastocytes ci-joint. Triclosan (TCS) est un antimicrobien à large spectre qui a été utilisé pendant plus de 30 ans dans les hôpitaux, les produits de soins personnels et des biens de consommation 23,24. Le mode d&#39;action pour caractéristique antimicrobienne de TCS est l&#39;inhibition de la biosynthèse des acides gras, probablement en inhibant énoyl-acylréductase protéine porteuse 25,26. Il se trouve dans le monde entier dans une vaste gamme de produits de consommation tels que gel douche, lotion pour les mains, dentifrice, rince-bouche, et savons pour les mains à des concentrations allant jusqu&#39;à 0,3% ou de 10 mm 24. L&#39;utilisation généralisée du TCS a donné lieu à des niveaux détectables chez l&#39;homme et 27-29 dans les rivières et les ruisseaux 30. Une étude réalisée par Allmyr et al. 27 a démontré que TCS et ses métabolites sont présents à la fois dans le plasma et le lait des mères qui allaitent. Surtout, TCS est facilement absorbé par la peau 31-37. Queckenberg et al. 37 ont trouvé ~ absorption de 10% d&#39;une ~ 70 mM crème TCS dans la peau de l&#39;homme dans les 12 heures, aboutissant à une concentration significative dans la peau, où les mastocytes résident. TCS a été cliniquement prouvé pour gérer la maladie allergique de la peau humaine 7-11, mais le mécanisme par lequel TCS soulage les maladies allergiques de la peau a été inconnue 38. Utilisation de la detaile de dosage en microplaque fluorescentd Dans cette vidéo, nous avons récemment démontré que TCS, à des concentrations aussi faibles que 2 pm, atténue considérablement la fonction des mastocytes et la dégranulation, fournissant une explication possible de ces données cliniques 2. En plus de fournir une explication à ces données cliniques, nos résultats à Palmer et al. 2 suggèrent que TCS vise molécules de signalisation en aval de l&#39;afflux de calcium. En raison de l&#39;importance de la signalisation dans de nombreux immunologique et d&#39;autres processus biologiques calcium, TCS pourrait avoir des effets négatifs sur une grande variété de processus biologiques nécessaires. En fait, Udoji et al. 39 a montré que TCS supprime l&#39;activité des cellules tueuses naturelles humain lytique, une autre fonction immunitaire innée importante. Au-delà de son potentiel comme une aide thérapeutique dans la maladie allergique de la peau (ou, au contraire, comme un immunotoxique), TCS peut aussi être un perturbateur endocrinien 40-49. Ainsi, une procédure claire sur la façon de préparer ce produit chimique en solution is d&#39;intérêt pour les toxicologues. Parce que TCS est une petite molécule hydrophobe, les véhicules organiques sont souvent utilisés pour le rendre plus soluble dans l&#39;eau. Dans la plupart des études de toxicité où TCS a été testé, la préparation a impliqué dissolution dans l&#39;eau à l&#39;aide d&#39;un solvant organique tel que l&#39;éthanol, l&#39;acétone, ou de l&#39;huile 2,50,51. Toutefois, il arrive souvent ces solvants sont biologiquement actifs eux-mêmes, ce qui complique l&#39;interprétation de la substance d&#39;essai données 51. En fait, selon Rufli et al. 52 et 53 autres, il est recommandé que des solutions de test pour les expériences de toxicité aquatique sont préparés en utilisant des méthodes physiques par rapport aux méthodes chimiques, en raison du potentiel de solvants chimiques pour créer des artefacts de toxicité. Nous avons précédemment montré que TCS dissous dans 0,24% éthanol / eau (vol / vol) et traitée aux ultrasons pendant 30 min amortit RBL dégranulation des mastocytes 2. L&#39;éthanol à des concentrations supérieures à 0,24% a été montré pour freiner la dégradation des mastocytesnulation 54,55-exemples des effets potentiellement confondants de solvants organiques sur les études de toxicité. Non seulement il est important de considérer l&#39;effet de solvants sur l&#39;organisme ou de cellules utilisées pour l&#39;étude, mais il est aussi important de surveiller l&#39;effet d&#39;un solvant sur le produit chimique d&#39;essai lui-même. Par exemple, Skaare et al. 51 ont constaté que la dissolution de TCS en polyéthylène glycol (on trouve couramment dans les dentifrices et les rince-bouche) affaibli effets anti-bactériennes et anti-plaque chez les femmes femelles en bonne santé tout en dissolution dans les huiles causé une perte complète de la fonction. Par conséquent, la capacité des différents solvants pour moduler toxiques et de drogues, y compris TCS, les effets doivent être pris en compte dans la conception des essais. L&#39;utilisation des huiles ou des additifs de saveur peut interférer avec les effets de TCS dans divers produits 50,51. Dans un effort pour éliminer la nécessité d&#39;utiliser des solvants organiques, nous avons amélioré notre méthode pour dissoudre TCS 2 en éliminant l&#39;utilisation d&#39;un sol organiquedéfouler. Dans le présent protocole, on dissout granules TCS directement dans le tampon aqueux à chaleur (≤ 50 ° C), puis vérifiez la concentration de ce stock TCS par spectrophotométrie UV-Vis. Ces améliorations sont possibles parce que TCS est soluble dans l&#39;eau jusqu&#39;à 40 pm ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) et a été montré pour résister à la dégradation lorsqu&#39;il est chauffé à 50 ° C ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Nous avons également l&#39;avantage supplémentaire de la spectrophotométrie UV-Vis, comme TCS est également connu pour absorber fortement à 280 nm 58 avec un coefficient d&#39;extinction molaire de 4,200 L / mol / cm 12. Ce protocole fournit un moyen simple, mais efficace pour dissoudre granules TCS dans un tampon sans l&#39;aide d&#39;un solvant organique, notamment le faible coût et la vérification rapidede la concentration, et décrit un dosage de la microplaque fluorescente puissant pour surveiller les effets chimiques sur la dégranulation des mastocytes.

<table><tbody><tr><td> RBL-2H3 Cellules </td><td>ATCC</td><<td>p align="center">CRL-2256</td><td> Les cellules que nous avons utilisées étaient un cadeau, mais elles sont également disponibles chez ATCC </td></tr><tr><td> Triclosan/Irgasan </td><td>Sigma</td><td>72779 CAS# 3380-34-5</td><td> Doit être stocké dans un environnement à faible humidité </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td>Gibco</td><td>25300-054 CAS# 3380-34-5</td><td> </td></tr><tr><td> EMEM </td><td>Lonza</td><td>12-611F</td><td> </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</p</td><td>> </td></tr><tr><td> Sulfate de gentamycine </td><td>Lonza Biological Sciences</td><td>17-518</td><td> </td></tr><tr><td> Albumine, sérum bovin </td><td>Calbiochem</td><td>12659 CAS# 9048-46-8 </td><td> </td></tr><tr><td> Surfact-Amps X-100 (Triton X-100 ; solution à 10 %) </td><td>Pierce</td><td>28314 CAS# 9002-93-1</td><td> </tr><tr><td> > HEPES </td><td>J.T Baker</td><td>4153-01 CAS# 75277-39-3</td><td> </td></tr><tr><td> Chlorure de magnésium </td><td>VWR</td><td>BDH0244-500G CAS# 7791-18-6</td><td> </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucose </td><td>Biomedicals</td><td>152527 CAS# 50-99-7</td><td> </td></tr><tr><td> Chlorure de potassium </td><td>J.T Baker</td><td>3046-01 CAS# 7447-40-7</td><td> </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium dihyrdate </td><td>Acros Organics</td><td>207780010 CAS# 10035-04-8</td><td> </td></tr><tr><td> Glycine </td><td>Sigma</td><td>G8898 CAS# 56-40-6</td><td> </td></tr><tr><td> 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-&beta ;-D-glucosaminide (4-MU) </td><td>EMD Biosciences</td><td>474502-250MG CAS # 37067-30-4</td><td> L’enveloppe dans une feuille &ndash ; est sensible à la lumière </td></tr><tr><td> Anti-DNP Mouse IgE </td><td>Sigma</td><td>D8406</td><td> Le réactif a une concentration de 1 mg/ml. Aliquote 25 & micro ; l&nbsp ; du réactif dans des microtubes à centrifuger séparés et du Parafilm. Stocker les aliquotes à -20 &deg ; C qui ne sont pas utilisés et stockent l’aliquote utilisée à 2-8 ° & ° C pour pas plus de 1 mois. </td></tr><tr><td> DNP-BSA </td><td>Don du Dr David Holowka et du Dr Barbara Baird, Université Cornell</td><td></td><td> Suggest : life technologies DNP-BSA catalog# <a href="http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018">A23018</a> </td></tr><tr><td> Calcium Ionophore A23187 </td><td>Sigma</td><td>C75-22-1mg</td><td> Ionophore a été fabriqué à partir d’une poudre en ajoutant 400 &micro ; l&nbsp ; de DMSO frais à 100 % dans le flacon d’ionophore et est conservé à -20 &deg ; C Remarque : nous avons utilisé l’ionophore après sa date d’expiration de 3 mois avec succès </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>Sigma</td><td>D2650 CAS# 67-68-5</td><td> </td></tr><tr><td> Acide acétique </td><td>VWR</td><td>BDH3094-2 CAS# 64-19-7</td><td> </td></tr><tr><td> Carbonate de sodium anhydre </td><td>Sigma</td><td>222321 CAS# 497-19-8</td><td> </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td>Sigma</td><td>71376 CAS# 7647-14-5</td><td> </td></tr><tr><td> Acide chlorhydrique </td><td>VWR</td><td>BDH3026 CAS# 7647-01-0</td><td> </td></tr><tr><td> Tampon de référence, pH 7 </td><td>VWR</td><td>BDH5046</td><td> </td></tr><tr><td> , pH 10 </td><td>VWR</td><td>BDH5072</td><td> </td></tr><tr><td> Tampon de référence, pH 4 </td><td>VWR</td><td>BDH5018</td><td> </td></tr><tr><td> électrode de pH solution de stockage </td><td>VWR</td><td>14002-828</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Equipment :</td></tr><tr><td> DU 7500 Spectrophotometer </td><td>Beckmann</td><td>N’est plus vendu <</td><td>p align="> </td></tr><tr><td> Lecteur de plaques Synergy 2 Utilise le logiciel de collecte et d’analyse de données de microplaques Gen5 </td><td>BioTek</td><td>Module S</td><td> </td></tr><tr><td> Hématocytomètre </td><td>Hausser Scientific</td><td> 3110</td><td> </td></tr><tr><td> 7 x&nbsp ; 7 CER HOT/STIR 120 V Combinaison plaque chauffante/plaque d’agitation magnétique </td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td> </td></tr><tr><td> Bain d’eau de culture tissulaire </td><td>VWR</td><td>Model# 89032-206</td><td> </td></tr><tr><td> Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood) </td><td>The Baker Company</td><td>Model# SG403A-HE</td><td> </td></tr><tr><td> Incubateur de culture tissulaire </td><td>ThermoScientific</td><td>Model# 3598</td><td> </td></tr><tr><td> Pipetman </td><td>VWR</td><td></td><td> Gamme : P2-P1000 </td></tr><tr><td> Balance </td><td>Mettler Toledo</td><td>Model# AG204</td><td> </td></tr><tr><td> pH-mètre </td><td>Symphony/VWR</td><td>Model# SB70P</td><td> </td></tr><tr><td> Pipet-Aid </td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-100</td><td> </td></tr><tr><td> Distributeur Combitip </td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Recipes :</td></tr><tr><td> Tampon d’acétate, pH 4,4 </td><td>Produisez 0,12 M d’acide acétique et titrez à pH 4,4 avec 10 N de NaOH. Il s’agit de 5,3 ml d’acide acétique glacial dans 1 L d’eau MilliQ : (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml car la densité glaciaire est de 1,37 g/ml</td><td>Filtre stérile dans une bouteille en verre autoclave</td><td></td></tr><tr><td> Substrat (4-MU) </td><td>Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Stocker en -20&deg ; Stock C : 0,12 M dans le DMSO (46 mg dans 1 ml de DMSO), chaud à 37 &deg ; C, vortex, sonicate 10 min. dans un sonicateur à bain d’eau avec de l’eau tiède, vortex à nouveau</td><td>Pour chaque expérience, faire une solution fraîche de substrat dans un tampon d’acétate (dilution 100x), pour une concentration finale de 1,2 mM dans un tampon d’acétate</td><td></td></tr><tr><td> Tampon de carbonate de glycine, pH 10 </td><td>26,7 g de glycine 47,1 g de carbonate de sodium anhydre Ajouter de l’eau désionisée pour 1 L, et ajuster le pH à 10</td><td>Filtre stérile dans un flacon en verre autoclave</td><td></td></tr><tr><td> Tyrodes (2 L), pH 7,4 </td><td>135 mM NaCl : 15,78 g (ou 270 ml de 1 M) 5 mM KCl : 10 ml de 1 M stock 1,8 mM CaCl2 : 7,20 ml de pâte 0,5 M 1 mM de MgCl2 : 4,00 ml de pâte 0,5 M 5,6 mM de glucose : 2,02 g (11,2 ml de 1 M) 20 mM HEPES : 40 ml de 1 M de pâte Utilisation du HCl concentré pH de ~9,7-7,4</td><td>Filtre stérile dans un flacon en verre autoclave</td><td></td></tr><tr><td> Milieu cellulaire RBL </td><td>décongélation du sérum fœtal bovin (FBS, stocké à -20 &deg ; C) pendant environ 4 heures à 37 &deg ; C Bain d’eau Suivre la technique stérile standard Extraire 1 L de milieu essentiel minimum (MEM) avec de la L-glutamine (avec Earle' Versez un peu de MEM pour avoir 800 ml de MEM, ajoutez 200 ml de FBS chaud Ajoutez 1 ml d’antibiotique au sulfate de gentamicine à 1 L de milieu avec une pipette stérile N’utilisez que des flacons de milieu qui ont été autoclavés et marqués pour une utilisation en culture cellulaire uniquement.</td><td>Filtre stérile (0,2 mm) dans une bouteille en verre autoclave</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Matière plastique utilisée :</td></tr><tr><td> 200 &micro ; l&nbsp ; Pointes de pipette stériles jetables avec graduations en 96 rack </td><td>VWR</td><td>53509-009</td><td> polypropylène </td></tr><tr><td> 1,000 &micro ; l&nbsp ; Pointes de pipette aérosol stériles avec HighRecovery </td><td>VWR</td><td>89003-420</td><td> polyéthylène </td></tr><tr><td> 10 &micro ; l&nbsp ; micro-embout à faible liaison stérile </td><td>VWR</td><td>14217-704</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> Jetables/coniques Microtubes à centrifuger pour force G élevée </td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td> polypropylène </td></tr><tr><td> Jetable/gradué/conique/stérile 50 ml&nbsp ; tubes à centrifuger avec bouchons à vis </td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td> polypropylène </td></tr><tr><td> Jetable/gradué/conique/stérile 15 ml&nbsp ; tubes à centrifuger avec bouchons à vis </td><td>VWR</td><td>21008-103</td><td> polypropylène </td></tr><tr><td> CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap </td><td>Greiner Bio One</td><td>690175</td><td> polystyrène </td></tr><tr><td> CELLSTAR Flacon T-75 traité pour la culture tissulaire avec capuchon filtrant </td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td> polystyrène </td></tr><tr><td> CELLSTAR 10 ml&nbsp ; Pipette sérologique emballée dans du papier/plastique </td><td>Greiner Bio One</td><td>607180</td><td> polystyrène </td></tr><tr><td> CELLSTAR 2 ml&nbsp ; Pipette sérologique emballée dans du papier/du plastique </td><td>Greiner Bio One</td><td>710180</td><td> polystyrène </td></tr><tr><td> CELLSTAR 5 ml&nbsp ; Pipette sérologique emballée dans du papier/du plastique </td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td> polystyrène </td></tr><tr><td> CELLSTAR 25 ml&nbsp ; Pipette sérologique en papier/plastique </td><td>Greiner Bio One</td><td>760180</td><td> polystyrène </td></tr><tr><td> 1 cm cuvettes </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> polystyrène </td></tr><tr><td> CELLSTAR, Microplaque 96W, Traitée par culture tissulaire, Noir, avec couvercle Plaque à 96 puits </td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td> polystyrène </td></tr><tr><td> Combitips </td><td>Eppendorf</td><td> 022266501 <</td><td>p align="centre">Polypropylène/ polyéthylène </td></tr></tbody></table>

un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur rbl-2h3 mât dégranulation: effets de triclosan sans utilisation d&#39;un solvant organique

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Les mastocytes jouent un rôle important dans la maladie allergique et de défense immunitaire contre les parasites. Une fois activé (par exemple, par un allergène), ils dégranulent, un processus qui aboutit à l&#39;exocytose des médiateurs de l&#39;allergie. Modulation de la dégranulation des mastocytes par les drogues et les substances toxiques peuvent avoir des effets positifs ou négatifs sur la santé humaine. Fonction des mastocytes a été disséqué en détail l&#39;utilisation des mastocytes de leucémie basophiles de rat (RBL-2H3), un modèle largement accepté de mastocytes des muqueuses de l&#39;homme 3-5. Mât composant de cellules granulaires et le médiateur allergique β-hexosaminidase, qui est libéré linéairement parallèlement à l&#39;histamine à partir de mastocytes 6, peuvent facilement et de façon fiable être mesurées par réaction avec un substrat fluorogène, ce qui donne l&#39;intensité de fluorescence mesurable dans un essai de micro-plaque qui se prête à études à haut débit 1. Initialement publié par Naal et al. 1, nous avons adapté ce test de dégranulation pour le dépistage oles médicaments et les substances toxiques F et démontrer son utilité ici. Le triclosan est un agent antibactérien à large spectre qui est présent dans de nombreux produits de consommation et a été trouvé pour être une aide thérapeutique dans la maladie allergique de la peau humaine 7-11, bien que le mécanisme de cet effet est inconnue. Ici, nous démontrons une analyse de l&#39;effet du triclosan sur la dégranulation des mastocytes. Nous avons récemment montré que le triclosan affecte fortement la fonction des cellules de mât 2. Dans un effort pour éviter l&#39;utilisation d&#39;un solvant organique, le triclosan est dissous directement dans un tampon aqueux avec la chaleur et l&#39;agitation, et la concentration résultante est confirmée par spectrophotométrie UV-Vis (avec ε = 4,200 280 L / M / cm) 12. Ce protocole a le potentiel pour être utilisé avec une variété de produits chimiques afin de déterminer leurs effets sur la dégranulation des mastocytes, et plus largement, leur potentiel allergique.

Lorsqu&#39;il est chauffé à 50 ° C pendant 90 min, le spectre d&#39;absorption UV-Vis pour TCS produit une forte courbe lisse entre ~ 260 et 300 nm, avec un pic à 280 nm, comme le montre la figure 1. Spectrophotométrie UV-Vis est donc un outil important qui peut être utilisé pour calculer la concentration, puisque le coefficient d&#39;absorption molaire publié à 280 nm est 4,200 L / mol / cm 12. Nous avons constaté que TCS ne tombe pas de solution au cours de la période de toute l&#39;expérience de dégranulation,...

Dégranulation des mastocytes, la libération de médiateurs de l&#39;allergie, est important dans les allergies, l&#39;asthme et la défense parasite. Ici, nous démontrons techniques 1 pour évaluer les effets des médicaments et des substances toxiques sur la dégranulation, la méthodologie utilisée récemment pour exposer l&#39;effet inhibiteur puissant agent antibactérien triclosan de 2.

Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d&#39;un solvant organique

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser un test de microplaque de fluorescence pour évaluer les effets chimiques sur la dégranulation des mastocytes. Dans ce protocole, les effets inhibiteurs de l’agent antimicrobien triclosan sont démontrés sans l’utilisation d’un solvant organique. Ceci est réalisé en plaquant d’abord les mastocytes dans une plaque de 96 puits pour leur permettre de se fixer pendant la nuit et en préparant le triclosan dans une solution aqueuse sans utiliser de solvants organiques par chauffage.La concentration de la solution trienne est ensuite rapidement déterminée à l’aide de la spectroscopie visible dans l’ultraviolet. Dans un deuxième temps, les cellules sont stimulées par l’antigène IgE slash ou un ionophore calcique en présence ou en l’absence de trian, ce qui provoquera la libération du marqueur de dégranulation des mastocytes bêta hexosaminidase dans le surnageant. La libération de la bêta-hexosaminidase dans le surnageant cellulaire est quantifiée à l’aide d’un substrat de bêta-hexosaminidase dont le produit fluorescent est quantifié dans un lecteur de microplaques.Afin de mesurer l’effet du triclosan ou d’autres produits chimiques d’e

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode in vitro pour évaluer le potentiel allergique d’un antigène à induire la dégranulation du basophile. La β-hexosaminidase est utilisée comme indice de libération de médiateurs chimiques, et l’activité enzymatique de la β-hexosaminidase est mesurée à l’aide d’un substrat fluorogène.

Essai de libération d’enzymes médiateurs humanisés : une méthode immunochimique pour dépister le potentiel allergique de l’antigène testé en surveillant la réponse de dégranulation des basophiles in vitro

Cette vidéo présente un test colorimétrique pour déterminer l’activité de dégranulation des mastocytes. L’enzyme libérée par les mastocytes hydrolyse le substrat et produit un produit coloré. L’activité de dégranulation des mastocytes a été mesurée comme le pourcentage de libération d’enzymes à l’extérieur de la cellule normalisé avec la teneur totale en enzymes dans la cellule.

Essai de dégranulation des mastocytes pour étudier l’effet d’un produit chimique cible

Cette vidéo illustre un test cellulaire impliquant des cellules de glioblastome exprimant les récepteurs de chimiokines CXCR4. Le test utilise un colorant sensible au calcium pour mesurer les changements de fluorescence lors de l’interaction de l’agent, offrant ainsi un aperçu de la dynamique de la signalisation cellulaire.

Un test cellulaire pour l’identification d’agents interagissant avec CXCR4

Cette vidéo présente un test permettant de surveiller l’activation des neutrophiles et l’exocytose des granules grâce à un test de dégranulation. Lors de l’activation par des composés pro-inflammatoires, les granules cytoplasmiques des neutrophiles contenant de la gélatinase fusionnent avec la membrane cellulaire, déchargeant leur cargaison. La présence de gélatinase dans le surnageant est évaluée par l’hydrolyse d’un substrat de gélatine conjugué à un fluorophore, confirmant l’activation et la...

Un test de dégranulation pour surveiller l’activation des neutrophiles et la libération de gélatinase

L’étude de la migration précoce des cellules endothéliales (EEC) est importante pour comprendre la physiopathologie de certaines maladies et pour identifier potentiellement de nouvelles stratégies d’intervention thérapeutique. Le protocole suivant décrit les techniques d’évaluation de la migration cellulaire qui ont été adaptées pour l’étude de l’EEC.

Évaluation de la migration des cellules endothéliales après une exposition à des produits chimiques toxiques

Ici, nous présentons des protocoles pour cribler et caractériser rapidement l’activité antimicrobienne des enzymes. Le test de diffusion sur microlames et le test de libération de colorant utilisent des substrats bactériens cibles pour l’évaluation qualitative et quantitative de l’activité enzymatique.

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Nous présentons ici un protocole visant à isoler et à cultiver des mastocytes péritonéaux murines. Nous décrivons également deux protocoles pour leur caractérisation fonctionnelle : une imagerie fluorescente de concentration2 + Ca libre intracellulaire et un test de dégranulation issu de dosage colorimétrique de la β-hexosaminidase libéré.

Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation

Nous avons développé un test multipuits format polyacrylamide pour sonder l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur une infection bactérienne de cellules adhérentes. Ce dosage est compatible avec la cytométrie en flux, immuno-coloration et microscopie de force de traction, ce qui permet des mesures quantitatives des biomécaniques interactions entre cellules, leur matrice extracellulaire et des bactéries pathogènes.

Un test multipuits Format Polyacrylamide pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’Infection bactérienne de cellules adhérentes

Nous présentons ici le test de libération du médiateur, utilisant une lignée cellulaire de leucémie basophile de rat transfectée avec le récepteur IgE humain, pour simuler la dégranulation des cellules effectrices généralement observées dans les réactions allergiques de type 1. Cette méthode étudie l’activité biologique des allergènes d’une manière très sensible, reproductible et personnalisable.

Test humanisé de libération du médiateur comme lecture de la puissance des allergènes

Ici, nous présentons un protocole de test de chimiotaxie amélioré. L’objectif de ce protocole est de réduire les étapes et les coûts des méthodes traditionnelles de chimiotaxie bactérienne et de servir de ressource précieuse pour comprendre les interactions plantes-microbes.

Un test de chimiotaxie amélioré pour l’identification rapide des chimioattractifs rhizobactériens dans les exsudats racinaires

Découvrez un essai de microplaques par fluorescence pour évaluer les effets du triclosan sur la dégranulation des mastocytes RBL-2H3 sans solvant organique. Cette méthode permet de quantifier rapidement la libération de bêta-hexosaminidase.

Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation dun solvant organique (Vidéo) | JoVE Journal

Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d'un solvant organique

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