Name: Quantitative In vitro Test pour mesurer ladhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Découvrez un test d'adhésion des neutrophiles pour quantifier leur liaison aux cellules endothéliales activées dans des conditions statiques. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de l'inflammation et de développer des stratégies thérapeutiques.

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Ce travail a été soutenu par le ministère de l&#39;UCSF des soins d&#39;anesthésie et de soins périopératoires.

1. Placage et l&#39;entretien des cellules endothéliales microvasculaires <ol><li> Décongeler et faire croître les cellules endothéliales microvasculaires selon les fabricants fournis instructions. Dans ce protocole, les cellules ont été cultivées dans EGM-2 médias MV (Lonza), et il est recommandé que toutes les expériences sont effectuées dans les deux semaines suivant la décongélation de minimiser toute variation due au nombre de passages. Nos expériences avec HMVEC-Lung sont effectués entre les passages 4 à 9. </li><li> Jour 1: Lorsque les cellules atteignent 80-90% de confluence, trypsiniser et remettre à 120.000 cellules par ml. Plate 36.000 cellules (0,3 ml) par puits dans 48 puits, plaque de culture tissulaire en polystyrène (s). Inclure les puits de HMVEC qui ne sera pas mis à incuber avec des neutrophiles afin d&#39;obtenir une lecture de fluorescence de fond. À moins d&#39;utiliser des plaques à 48 puits spécialement conçues pour les essais par fluorescence, des lignes ou des colonnes en alternance permettra de minimiser toute contamination lumière des puits voisins. NOTE: Les puits peuvent être pré-enduit de poly-lysiNE, collagène ou fibronectine. </li><li> Jour 2: Ajouter des milieux frais. </li><li> Jour 3: En microscopie en contraste de phase, confirment les cellules sont en bonne santé (c. apparence &quot;pavé&quot; et peu de débris cellulaires), et ils sont 100% de confluence (Figure 1). Si les cellules ne sont pas 100% de confluence, changer les médias tous les jours jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts. </li><li> Une fois les monocouches HMVEC sont prêts pour le traitement, laver les cellules une fois avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et ajouter 0,3 ml d&#39;EGM-2 médias ou médias MV frais contenant agoniste inflammatoire dans les puits appropriés. Dans ce protocole, le HMVEC-pulmonaire ont été traités avec le TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) pendant 3 heures car il s&#39;agit d&#39;un activateur bien décrit des EC 21. NOTE: Il est recommandé de temps votre expérience afin que vos cellules HMVEC activés (étape 4.1) et calcéine AM neutrophiles marquées (Étape 3.5) sont prêts à utiliser en même temps. Il nous faut environ 2,5 heures pour isoler et étiqueter neutrophILS. </li></ol> 2. Isolement des neutrophiles en utilisant Polymorphprep <ol><li> Isoler les neutrophiles, comme décrit précédemment 22, ou avec une solution de gradient densité ready-made pour isoler les granulocytes neutrophiles dans le sang total. Employant Polymorphprep suivant le protocole par Nuzzi et.al. résultats 2007 des rendements d&#39;environ 2-3 x 10 6 neutrophiles par ml de sang total 23. REMARQUE: Pour éviter la lyse des érythrocytes excessive, une sédimentation dextran pour éliminer les globules rouges peut être effectuée avant la centrifugation de gradient de densité 24. </li><li> Porter la solution à gradient de densité Polymorphprep à RT. </li><li> Recueillir 30 ml de sang total à partir d&#39;un volontaire humain sain, en présence d&#39;un anticoagulant tel que l&#39;héparine, le citrate ou l&#39;EDTA. Le sang doit être utilisé dans les 2 heures et maintenue entre 18-22 ° C. </li><li> Couche 5 ml de sang total plus de 5 ml de la solution à gradient de densité dans un tube conique de 15 ml (Figure 2A). Éviter de modifier les volumes de sang et la solution de gradient de densité, car cela pourrait modifier les conditions de centrifugation ultérieures. </li><li> Centrifuger à 450 g pendant 30 min à 18-22 ° C. Assurez-vous d&#39;accélérer lentement de haut en bas de la centrifugeuse (c.-à désactiver le frein de la centrifugeuse), et d&#39;équilibrer les tubes bien pour éviter les vibrations pour aider à réduire l&#39;activation des neutrophiles et d&#39;empêcher le mélange des couches. Temps de centrifugation ou la force centrifuge plus élevé se traduira par la couche leucocytaire inférieure, qui contient des neutrophiles, de migrer plus loin vers les globules rouges agglomérés. </li><li> Aspirer le plasma et la bande de leucocytes supérieur contenant CMSP pour empêcher la contamination de la couche contenant les neutrophiles (figure 2B). </li><li> Utiliser une pipette sérologique 1-2 ml pour enlever la couche de leucocytes polynucléaires neutrophiles inférieur contenant. Combiner les couches de neutrophiles dans 30 ml de PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) dans un 50 mltube conique. </li><li> Porter le volume à 50 ml avec du PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) et centrifuger à 450 g pendant 10 min à 18-22 ° C. </li></ol> Remarque: Les étapes 2.9 et 2.10 sont facultatives mais fortement recommandées. <ol start="9"><li> Aspirer le surnageant. Reprendre le neutrophiles dans 8 ml d&#39;eau stérile pendant 30 secondes pour lyser les globules rouges, ajouter immédiatement la suspension de cellules à 2 ml de 5x PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) et mélanger délicatement à la main. Ne pas incuber les cellules en l&#39;eau pendant plus de 30 secondes depuis la mort de neutrophiles importante peut se produire. </li><li> Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 18-22 ° C. </li><li> Laver les cellules une fois avec 10 ml de PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) et centrifuger à 250 g pendant 5 min à 18-22 ° C. </li><li> Reprendre les neutrophiles dans 10 ml de RPMI-1640 (sans rouge de phénol) et de compter les cellules vivantes en utilisant le bleu trypanteindre méthode d&#39;exclusion. Éviter les périodes prolongées de fortes densités cellulaires supérieures à 5 x 10 6 par ml, car cela pourrait entraîner une activation des neutrophiles. </li></ol> 3. Neutrophiles étiquetage avec Calcein AM <ol><li> 6 x 10 5 cellules neutrophiles sont utilisés par puits d&#39;une plaque à 48 puits. </li><li> Après le dépouillement, transférer les cellules remises en suspension dans un tube conique de 50 ml et diluer les neutrophiles à 2-4 x 10 6 cellules par ml de rouge de phénol libre RPMI-1640. </li><li> Ajouter calcéine AM solution stock à 3 pm (ie 2,98 ul de calcéine AM stock (1 mg / ml) par ml de milieu) et bien mélanger en tapotant doucement le tube. Plus de 5 uM AM calcéine va entraîner une fuite des neutrophiles. Remarque: non fluorescent calcéine AM est clivée dans les cellules par des estérases endogènes pour produire la molécule hautement fluorescent calcéine (ie les cellules mortes ne fluorescence). </li><li> Couvrez le tube avec du papier d&#39;aluminium et laisser incuber for 30 min à 37 ° C dans l&#39;obscurité. Remarque: des temps d&#39;incubation plus longue peut entraîner une plus calcéine être libérée des neutrophiles au cours de l&#39;essai d&#39;adhésion. </li><li> Centrifugeuse à 450 g pendant 5 min à 18-22 ° C, et laver les neutrophiles 2x avec 10 ml de RPMI-1640 (sans rouge de phénol, préchauffé à 37 ° C). Après remise en suspension des cellules pour le second lavage, d&#39;abord passer les neutrophiles si un filtre stérile de 40 uM à éliminer les agrégats, puis centrifuger une fois de plus à 450 g pendant 5 min à 18-22 ° C. </li><li> Reprendre les neutrophiles dans RPMI 1640 (sans rouge de phénol, préchauffé à 37 ° C) à 2 x 10 6 neutrophiles par ml. </li></ol> 4. Essai de liaison des neutrophiles <ol><li> Laver les monocouches HMVEC 3x avec 0,5 ml de stérilisée par filtration (0,22 um) RPMI 1640 (sans rouge de phénol) contenant 3% de BSA par puits. </li><li> Aspirer les médias et ajouter 6 x 10 5 neutrophiles calcéine marqués (0,3 ml de suspension cellulaire), Soit 0,3 ml de RPMI 1640 (sans rouge de phénol) sans neutrophiles, les puits appropriés de la plaque de 48 puits. Note: Ceci est l&#39;équivalent de 8 x 10 5 neutrophiles par cm 2. </li><li> Incuber pendant 20 min à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Nombre de neutrophiles Fluorescence (prélavage): Mesurer l&#39;intensité de fluorescence de chaque puits avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 485 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 520 nm (jeu de filtres fluorescéine) dans un FLUOstar, ou équivalent, spectrophotomètre. Effectuez cette étape juste avant le point final d&#39;incubation Note: Dans ce protocole, calcéine excitation et la détection de la lumière émise ont été réalisés depuis le sommet des puits découverts, mais les deux peuvent également être effectuées à partir du fond des puits.. </li><li> Laver les puits contenant des monocouches HMVEC et des neutrophiles 5x avec 0,5 ml par puits de PBS (w / Ca 2 + et Mg 2 +). Retirez le papier et les lavagesen inversant la plaque et tapoter délicatement sur du papier absorbant pour enlever le liquide restant. </li><li> Rajouter 0,3 ml de RPMI 1640 (sans rouge de phénol) par puits. </li><li> Adhérent neutrophiles Fluorescence (POST lavage): Mesurer l&#39;intensité de fluorescence de chaque puits comme dans l&#39;étape 4.4. </li><li> Déterminer le respect de pour cent et adhérence relative par puits: </li></ol> Remarque: A ce stade, les images des neutrophiles calcéine-marqués peuvent être obtenus en utilisant un microscope capable fluorescence équipé de filtres fluorescéine standard. Les images de la figure 4 ont été obtenus sur un Olympus IX51 microscope inversé équipé d&#39;une caméra 2000R Retiga (Q Imaging) en utilisant Q-Capture logiciel Pro7 (Q Imaging).

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les étapes les plus importantes pour un neutrophile succès / test d&#39;adhérence des cellules endothéliales microvasculaires sont les suivants: 1) Utilisation de faible nombre de passage (&lt;9), les cellules endothéliales saines; 2) le maintien des neutrophiles isolés à dire &lt;5 x 10 6 cellules de faible densité ( / ml) et de les utiliser dans les deux heures d&#39;isolement, et 3) le lavage fastidieuse des neutrophiles calcéine AM-étiquetés et utiliser des neutrophiles calcéine AM-étiquetés en t...

Depuis l&#39;endothélium vasculaire est en contact direct avec le sang circulant, il est situé de façon unique pour initier une réponse inflammatoire rapide lors de l&#39;infection ou de blessure. Les cellules endothéliales (EC) expriment motif récepteurs de reconnaissance qui reconnaissent une variété de composants bactériens conservés et des molécules de danger, et les récepteurs pour les hôtes médiateurs inflammatoires telles que le TNFa. L&#39;activation de ces récepteurs induit EC de sécréter des cytokines (par exemple IL-6, IL-8, CXCL1 et CCL2), et à réguler à la hausse des molécules d&#39;adhésion (par exemple, E / P-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1) à leur surface cellulaire 1 , 2. Ces molécules tous facilitent la localisation des leucocytes aux sites d&#39;infection et les blessures afin d&#39;effacer l&#39;hôte des agents infectieux et de lancer la réparation des tissus 3,4. La réponse des neutrophiles à l&#39;infection implique une interaction bien coordonnée entre l&#39;endothélium vasculaire et la réponse neutrophiles. Lors de l&#39;activation CE, IL-8 est sécrété et forme un gradient intra-vasculaire sur l&#39;endothélium qui permet neutrophiles à l&#39;accueil au site de l&#39;infection ou de blessure 5,6. E / P-sélectine médiate neutrophiles capture et rouler à travers les associations relativement faibles avec glycomolecules sur la surface des cellules neutrophiles. Ces interactions, avec liaison de l&#39;IL-8 et de ses récepteurs apparentés, facilitent le solide, l&#39;attachement médiée par l&#39;intégrine et arrêt éventuel de neutrophiles à la surface des cellules endothéliales 7-10. Après l&#39;arrestation, les neutrophiles peuvent migrer hors de la vascularisation des sites spécifiques d&#39;infection à éliminer directement les agents pathogènes, de générer des pièges extracellulaires neutrophiles pour prévenir la propagation d&#39;agents pathogènes, de favoriser la guérison des plaies et libérer des facteurs supplémentaires qui recrutent d&#39;autres leucocytes tels que les monocytes, macrophages et dendritiques cellules 11-17. Décrite dans le présent rapport est une méthode in vitro pour quantifier l&#39;adhésion des neutrophiles à microVasculaire ECS après activation par l&#39;hôte médiateur inflammatoire TNF. Ce test est conçu pour évaluer l&#39;activation des EC, et non des neutrophiles. Neutrophiles humains primaires sont d&#39;abord isolés par séparation par gradient de densité, et sont ensuite marquées à la calcéine acétoxyméthylique (AM). Estérases l&#39;intérieur des cellules en direct hydrolyze calcéine AM à la molécule de calcéine hautement fluorescent avec une excitation de 492-495 nm et une émission de 513-516 nm 18. Les neutrophiles marquées par fluorescence sont ensuite incubés avec des monocouches CE et neutrophiles non adhérentes sont ensuite éliminés. La fluorescence des autres, les neutrophiles lié est ensuite mesurée à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre à fluorescence, et calculé en pour cent de l&#39;apport total par fluorescence neutrophiles bien. Cette méthode présente l&#39;avantage supplémentaire que les neutrophiles liés calcéine marqués utilisés en spectrophotométrie peuvent être directement visualisées par microscopie à fluorescence pour donner une plus qualitative lire des CE acvation. Depuis cet essai est effectué dans des conditions statiques, seuls les événements très initiales qui se produisent dans la cascade de l&#39;adhésion des neutrophiles seront évalués. Ceci est confirmé dans ce rapport en utilisant des anticorps bloquants E-sélectine à montrer que l&#39;adhésion des neutrophiles au TNFa humain poumon traité CE microvasculaire (HMVEC-Lung) monocouches est considérablement réduite lorsque l&#39;interaction avec E-sélectine est perturbé. En plus de TNF, nous avons utilisé avec succès ce test pour déterminer l&#39;étendue de la veine activation humaine ombilical CE (HUVEC) par le récepteur Toll-like de 1/2 agonistes lipoprotéine associée à un peptidoglycane (PAL), murein lipoprotéine (MLP) et Pam3Cys et activation HMVEC-Lung par Pam3Cys 19,20. En outre, nous avons utilisé avec succès ce test avec les inhibiteurs de kinases et après knockdown ARNi médiée de surface et protéines cytoplasmiques dans HMVEC-Lung, ce qui suggère que cette méthode est compatible avec une variété de biochimie et screenindosages g 20. En résumé, ce test fournit une interface facile à utiliser, de façon reproductible, plus fonctionnel pour accéder à l&#39;importance de l&#39;activation CE par des médiateurs inflammatoires in vitro.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 48 puits</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sans rouge de phénol)</td><td>Installation de culture cellulaire UCSF</td><td>CCFAL001</td><td>Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>D-PBS (sans Ca2+ et Mg2+ et rouge de phénol)</td><td>Installation de culture cellulaire UCSF</td> CCFAL003 <td>Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 (sans rouge de phénol)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>calcéine AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099(</td><td>0,995 mM) stock soln</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; Filtres M</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Peut être remplacé par n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>FLUOstar OPTIMA Spectrophotomètre</td><td>BMG LABTECH-</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative<em&gt; in vitro</em&gt; test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

L&#39;endothélium vasculaire joue un rôle essentiel dans la réponse inflammatoire. Pendant la phase aiguë de l&#39;inflammation, les cellules endothéliales (EC) sont activés par des médiateurs d&#39;accueil ou directement par des composants microbiens conservés ou molécules de danger dérivées de l&#39;hôte. Activés CEs cytokines express, des chimiokines et de molécules d&#39;adhésion qui mobilisent, activent et conservent leucocytes au site de l&#39;infection ou de blessure. Les neutrophiles sont les premiers leucocytes à arriver, et adhèrent à l&#39;endothélium à travers une variété de molécules d&#39;adhésion présentes sur les surfaces des deux cellules. Les principales fonctions des neutrophiles sont d&#39;éliminer directement les menaces microbiennes, de promouvoir le recrutement d&#39;autres leucocytes à travers la libération de facteurs supplémentaires, et d&#39;initier la cicatrisation des plaies. Par conséquent, leur recrutement et leur attachement à l&#39;endothélium est une étape critique dans l&#39;initiation de la réponse inflammatoire. Dans ce rapport, nous décrivons un test d&#39;adhérence in vitro en utilisant des neutrophilescalcéine AM-étiqueté neutrophiles humains primaires pour quantifier le degré d&#39;activation des cellules endothéliales microvasculaires, en conditions statiques. Cette méthode présente l&#39;avantage supplémentaire que les mêmes échantillons quantifiés par spectrophotométrie de fluorescence peuvent également être visualisés directement par microscopie de fluorescence pour une évaluation plus qualitative de la liaison des neutrophiles.

Afin d&#39;obtenir des résultats fiables et reproductibles en utilisant un test de liaison des neutrophiles, il est essentiel que la santé et la confluence des cellules endothéliales microvasculaires sont optimales le jour de l&#39;essai, comme illustré avec HMVEC-Lung à la figure 1. En outre, il est impératif que nombre passage bas microvasculaire EC sont utilisés (soit moins de 9 passages), et en conséquence, nous conseillons d&#39;effectuer toutes les expériences dans les deux semaines suiva...

L&#39;adhésion des neutrophiles à l&#39;endothélium activé sur les sites d&#39;infection est une partie intégrante de la réponse inflammatoire de l&#39;hôte. Décrite dans le présent rapport est une analyse de liaison des neutrophiles qui permet de<em&gt; In vitro</em&gt; Quantification des neutrophiles humains primaire liaison aux cellules endothéliales activées par des médiateurs inflammatoires dans des conditions statiques.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer le degré d'activation inflammatoire des cellules endothéliales microvasculaires en quantifiant le nombre relatif de neutrophiles qui adhèrent aux cellules endothéliales in vitro dans des conditions statiques. Cela est réalisé en traitant d'abord des monocouches confluentes saines de cellules endothéliales microvasculaires avec le stimulus expérimental souhaité lors de la deuxième étape. Des neutrophiles provenant de donneurs humains sains sont isolés, puis marqués avec du calcium am.Ensuite, les neutrophiles marqués sont ajoutés aux cellules endothéliales et laissés à adhérer pendant 20 minutes, durant lesquelles une mesure préalable au lavage est obtenue par spectrofluorométrie. Dans la dernière étape, les neutrophiles non adhérents sont éliminés par lavage, après quoi une mesure post-lavage est effectuée. En définitive, le pourcentage et l'adhérence relative des neutrophiles marqués au calcium aux monocouches de cellules endothéliales peuvent être déterminés pour chaque condition de traitement.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie inflammatoire humaine, car elle permet de déterminer le degré relatif d'activation inflammatoire endothéliale microvasculaire dans différentes conditions. En outre, ce test pourrait être utilisé comme outil pour étudier les processus pathologiques humains liés à l'endothélium impliquant la liaison des leucocytes à l'endothélium microvasculaire. Le jour du test, utilisez la microscopie en contraste de phase pour confirmer que les cellules présentent un aspect sain en « pavés » avec peu de débris cellulaires et qu'elles sont confluentes à 100 %.Une fois que les monocouches de HM VEC sont prêtes pour le traitement, laver les cellules une fois avec du HBSS, puis ajouter 0,3 millilitre de milieu de croissance frais pour cellules endothéliales microvasculaires, avec ou sans agoniste inflammatoire, dans les puits appropriés. Ici, les HM VEC pulmonaires sont traitées par le TNF alpha pendant trois heures afin d'isoler les neutrophiles. À l’aide de Polymorph prep, porter d’abord la solution de gradient de densité à température ambiante. Ensuite, après avoir prélevé 30 millilitres de sang total chez un volontaire humain en bonne santé en présence d’un anticoagulant, déposer 5 millilitres de sang sur 5 millilitres de Polymorph prep dans un tube conique de 15 millilitres.Séparer le sang total pendant 30 minutes à 450 ×g et à 18 à 22 degrés Celsius avec le frein désactivé, en veillant à ce que les tubes soient bien équilibrés. Ensuite, aspirer les couches jaune plasma et contenant les PBMC afin d'éviter toute contamination par la couche neutrophile rose opaque. Pour prélever les neutrophiles, aspirer la couche neutrophile à l’aide d’une pipette sérologique d’un à deux millilitres, tout en faisant tourner lentement la pipette et le tube.Prélvez les neutrophiles de plusieurs tubes et transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres contenant 30 millilitres de PBS sans calcium ni magnésium. Complétez le volume à 50 millilitres avec du PBS supplémentaire sans calcium ni magnésium. Après avoir centrifugé les cellules, aspirez le surnageant, puis resuspendez le culot.Suspendre les neutrophiles dans huit millilitres d'eau stérile pour lyser les globules rouges après 30 secondes. Ajouter rapidement les huit millilitres de suspension cellulaire à deux millilitres de PBS sans calcium ni magnésium, à 5 x, puis mélanger délicatement. Après centrifugation des cellules, les laver une fois dans du PBS sans calcium ni magnésium, puis resuspendre le culot dans 10 millilitres de RPMI 1640 sans rouge de phénol et dénombrer les cellules viables par exclusion au bleu de trypan.Après le décompte, transférez les cellules resuspendues dans un tube conique de 50 millilitres et diluez les neutrophiles à deux à quatre millions de cellules par millilitre avec du RPMI 1640 sans rouge de phénol. Ajoutez ensuite une solution mère fraîchement préparée de calcium à une concentration de trois micromolaire aux cellules. Mélangez la suspension cellulaire en renversant doucement le tube plusieurs fois, puis incubez le tube recouvert de papier d’aluminium à 37 degrés Celsius.Après 30 minutes, centrifuger les neutrophiles marqués, puis laver le culot deux fois dans 10 millilitres de RPMI 1640 sans rouge de phénol à 37 degrés Celsius, en faisant passer la suspension cellulaire à travers un filtre stérile de 40 microns afin d'éliminer tous les agrégats avant la deuxième centrifugation. Resuspendre les neutrophiles dans 10 millilitres de RPMI 1640 sans rouge de phénol à 37 degrés Celsius.RP MI 1640 sans rouge de phénol. Ensuite, après avoir recompté les cellules, les diluer à 2 millions de cellules par millilitre. Laver maintenant les monocouches HM vec trois fois avec 0,5 millilitre de RP MI 1640 sans rouge de phénol, filtré sur 0,22 micron et stérilisé, contenant 3 % de BSA par puits ; après le troisième lavage, aspirer le milieu et ajouter 600 000 neutrophiles marqués au calcium dans 0,3 millilitre de suspension cellulaire, ou 0,3 millilitre de RP MI 1640 sans rouge de phénol sans neutrophiles, dans les puits appropriés de la plaque 48 puits. Incuber ensuite les cocultures pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, puis juste avant la fin de la période d'incubation, mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits à l'aide d'un spectrophotomètre avec une longueur d'onde d'excitation de 485 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 520 nanomètres.Ensuite, retournez la plaque pour éliminer le milieu et tamponnez-la doucement sur du papier absorbant afin d'éliminer tout liquide résiduel. Lavez les puits contenant les monocouches hm ve et les neutrophiles cinq fois avec 0,5 millimètre par puits de PBS contenant du calcium et du magnésium. Éliminez le PBS de la même manière à chaque fois.Renouvelez le milieu dans chaque puits avec 0,3 millilitre de RPMI 1640 sans rouge de phénol, puis mesurez l'intensité de fluorescence de chaque puits comme vient d'être démontré. Enfin, à l'aide de ces formules, déterminez le pourcentage d'adhérence et l'adhérence relative par puits. Pour obtenir des résultats fiables et reproductibles à l'aide d'un test de liaison des neutrophiles, il est essentiel que la santé et la confluence des cellules endothéliales microvasculaires soient optimales le jour du test. Remarquez l'aspect pavé et la confluence totale des monocouches sur un spectrophotomètre Fluor star Optima.Par exemple, notez que la DO de fluorescence à 520 nanomètres se situe dans la plage linéaire lorsque l'on analyse de 10 000 à 1 million de neutrophiles marqués. Fait intéressant, à mesure que l'on ajoute davantage de neutrophiles aux monocouches pulmonaires HM VEC traitées avec un agoniste inflammatoire, le pourcentage d'adhérence augmente. La protéine kinase p38 MAP a déjà été démontrée comme étant nécessaire à l'expression de l'E-sélectine.Dans les cellules endothéliales humaines traitées par l'alpha-TNF et son inhibition, le nombre de neutrophiles adhérents est réduit, ce qui démontre que le nombre de neutrophiles ajoutés dans les puits est arbitraire, pour autant que le nombre de cellules utilisées se situe dans la plage linéaire du spectrophotomètre. Ici, un test d'adhérence des neutrophiles avec des cellules pulmonaires HMVEC traitées par l'alpha-TNF, en l'absence ou en présence de l'inhibiteur de la P38 MAP kinase BIRB796, est présenté. Ces résultats montrent que la diminution relative de la liaison des neutrophiles après l'inhibition de la P38 MAPK est similaire.Indépendamment du nombre de neutrophiles par puits, la lectine est exprimée à la surface des cellules endothéliales après traitement avec le TNF alpha et capte les neutrophiles de la circulation via des interactions électrostatiques avec les glycomolécules présentes à la surface des neutrophiles. Comme illustré sur ce graphique, une préincubation des cellules endothéliales activées par le TNF alpha avec un anticorps dirigé contre l'E-sélectine entraîne une réduction d'environ 75 % de leur capacité à lier les neutrophiles. Cela démontre que cet essai évalue principalement les tout premiers événements de la cascade d'adhésion des neutrophiles. Sur ces images, des neutrophiles marqués au calcium sont liés à des monocouches de cellules endothéliales pulmonaires HMVEC non traitées ou traitées au TNF alpha, préalablement incubées avec une IgG de contrôle ou un anticorps anti-E-sélectine.Des anticorps polyclonaux sont montrés ; des images en microscopie à contraste de phase sont présentées dans cette colonne, tandis que les images de fluorescence du même champ de référence, obtenues à l’aide d’un jeu de filtres pour la fluorescéine, sont visibles ici dans ces puits. Des images représentatives de la fluorescence totale des neutrophiles avant lavage avec du PBS, tel que vient d’être démontré, sont montrées dans ces puits. Des images représentatives de la fluorescence des neutrophiles adhérents après lavage avec du PBS, tel que vient d’être démontré, sont présentées.Remarquez l'augmentation de l'adhérence après le traitement par TN FFA, laquelle est réduite en présence d'un anticorps polyclonal anti-sélectine s. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'utiliser des cellules endothéliales saines, de bas passage, et d'utiliser le sang total et les neutrophiles isolés dans les deux heures suivant leur prélèvement.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

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Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test utilisant la microscopie à fluorescence pour détecter l’adhésion des cellules cancéreuses aux pièges extracellulaires des neutrophiles (TNE). Dans les puits d’essai, il y a une augmentation notable du nombre de cellules cancéreuses marquées par fluorescence adhérant aux TNE, tandis que les puits traités avec de la DNase présentent une adhésion réduite des cellules cancéreuses aux TNE.

Essai d’adhésion in vitro pour détecter l’adhérence des cellules cancéreuses aux pièges extracellulaires des neutrophiles

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In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

Un procédé de quantification de l'adhésion des neutrophiles est rapporté. Cette méthode permet de créer un environnement dynamique d'écoulement semblable à celle rencontrée dans un vaisseau sanguin. Il permet à l'enquête de l'adhésion des neutrophiles soit à des molécules purifiées d'adhésion (ligand) ou substrat de cellules endothéliales (HUVEC) dans un contexte similaire à l'environnement in vivo avec contrainte de cisaillement.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

Nous rapportons une méthode in vitro qui permet de quantifier le nombre réel de cellules adhésives au sein d’une monocouche de cellules endothéliales.

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

Endothélium vasculaire contrôle étroitement le recrutement des leucocytes. Extravasation de leucocyte inadéquate contribue aux maladies inflammatoires humaines. La recherche de nouveaux éléments régulateurs d’activation endothéliale est donc nécessaire de concevoir des traitements améliorés pour troubles inflammatoires. Nous décrivons ici une méthodologie globale afin de caractériser les nouveaux régulateurs endothéliales qui peuvent de modifier leucocytes traite au cours de l’inflammation.

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Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

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Dynamique adhérence de cellules immunitaires vers la paroi du vaisseau est une condition préalable pour la domiciliation de l’intestin. Nous présentons ici un protocole pour une analyse fonctionnelle in vitro pour l’analyse de l’impact des anticorps anti-intégrine, chimiokines ou d’autres facteurs sur l’adhérence cellulaire dynamique de cellules humaines à l’aide d’enduit de loopbackDans capillaires.

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Découvrez un test d'adhésion des neutrophiles pour quantifier leur liaison aux cellules endothéliales activées dans des conditions statiques. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de l'inflammation et de développer des stratégies thérapeutiques.

Quantitative In vitro Test pour mesurer ladhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques (Vidéo) | JoVE Journal

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