Utilisation d’un système de suivi 3D automatisé pour enregistrer les individus et les bancs de poissons-zèbres adultes

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les schémas de mouvement tridimensionnels des poissons zèbres ou d'autres animaux aquatiques et d'analyser leurs caractéristiques cinématiques, spatiales et sociales. Cela permet de détecter les comportements modifiés dus à des mutations génétiques ou à des facteurs chimiques et environnementaux. Ceci est réalisé en calibrant d'abord le système, ce qui corrige également la distorsion d'image importante provoquée par la réfraction.

La deuxième étape consiste à enregistrer des images vidéo avec une résolution temporelle relativement élevée, provenant simultanément d'au moins deux angles différents. Ensuite, le logiciel reconstruit les trajectoires des poissons. Des algorithmes avancés sont appliqués pour réduire l'effet du bruit et déduire la position d'un poisson en cas d'occultation ou d'agglomération.

La dernière étape consiste à analyser les données et à effectuer une analyse statistique portant sur l'accélération de la vitesse, l'angle de virage, la répartition horizontale et verticale dans le récipient d'observation, les distances interindividuelles et d'autres paramètres d'intérêt. En fin de compte, le suivi tridimensionnel calibré à haute vitesse s'avère utile pour étudier les déficits comportementaux chez le poisson-zèbre mutant ainsi que les effets de médicaments sur divers systèmes comportementaux. Dans le but de la découverte de médicaments, un avantage du système est qu'il permet d'étudier le comportement des poissons en 3D.

Ceci est important car les poissons se déplacent naturellement dans les trois dimensions, et lors de l’enregistrement de plusieurs poissons simultanément, un enregistrement en 2D peut être très trompeur lorsqu’on étudie les configurations spatiales du groupe. Un autre avantage du système est qu’il corrige la réfraction de la lumière, laquelle, si elle n’est pas corrigée, peut entraîner des erreurs de mesure importantes dans sa configuration actuelle. Le récipient d’observation contenant les poissons zèbres est positionné dans la chambre d’observation.

La chambre contient également une caméra, un miroir suspendu à environ 45 degrés au-dessus du récipient et des barres lumineuses à LED. Avant l'enregistrement, étalonnez le système afin de déterminer les positions des parois du récipient et de la surface de l'eau, ainsi que le facteur d'échelle des images enregistrées, tout en corrigeant l'erreur générée par la réfraction de la lumière lors de son passage de l'eau à l'air. Une fois l'étalonnage terminé, une prise d'essai doit être effectuée avec un poisson factice.

Un recalibrage doit être effectué si les positions du miroir ou de la caméra sont incorrectes ou s'il y a des problèmes de suivi. Pour commencer une session d'enregistrement, placez le récipient d'observation rempli d'eau jusqu'aux repères dans la chambre d'observation. Les pieds du récipient doivent être insérés dans les trous de positionnement.

Positionner les récipients de manière à ce que les parois translucides ou opaques soient orientées vers le côté éloigné et vers la droite, depuis le point de vue de la caméra. Ensuite, allumer les lumières dans le compartiment, puis introduire les poissons dans le récipient et fermer les rideaux. Ouvrir le module d'enregistrement et l'image des vues frontale et supérieure du récipient apparaîtra à l'écran.

Initialement, l'image acquise peut ne pas être idéale et pourrait donc nécessiter quelques ajustements afin d'obtenir un contraste suffisant entre le poisson et le fond. Pour régler l'image, sélectionnez le contrôle de la caméra, puis dans la fenêtre des paramètres généraux qui s'ouvre, désactivez les cases indiquées ici, et ajustez ensuite l'obturateur et le gain de manière à ce que l'image ne soit pas surexposée. Ensuite, sur le côté gauche de la fenêtre de contrôle de la caméra, sélectionnez l'équilibre des blancs couleur, puis dans la nouvelle fenêtre, désactivez la case « Auto » et réglez les valeurs de rouge et de bleu afin d'obtenir le meilleur contraste de couleur dans les vues frontale et supérieure.

Plusieurs réglages peuvent être nécessaires une fois les ajustements terminés. À partir du menu principal du module d'enregistrement, sélectionnez l'emplacement des données pour créer ou choisir un dossier. Chaque enregistrement doit avoir son propre dossier, qui doit être un sous-dossier du dossier de l'expérience.

Appuyez maintenant sur démarrer l'enregistrement et saisissez un nombre entier correspondant à la durée de l'enregistrement en minutes, puis appuyez sur OK et la session d'enregistrement expérimental commencera. Une fois les enregistrements terminés, copiez et collez les données du conteneur animal et les sous-dossiers de données de correspondance depuis le dossier d'étalonnage vers les dossiers créés précédemment. Pour commencer la reconstruction du trajet, ouvrez le module de trajectoire du logiciel. Ensuite, appuyez sur emplacement des données afin de sélectionner le dossier qui a été créé avec le module d'enregistrement.

Ensuite, appuyez sur le bouton de configuration du système pour ouvrir d'abord la fenêtre des paramètres, puis réglez les seuils de couleur pour la vue supérieure et inférieure. Une valeur initiale appropriée est 1000. Ensuite, sélectionnez les seuils dimensionnels pour la vue supérieure et inférieure.

Une taille de départ appropriée pour un poisson zèbre de taille moyenne est de 10, utilisez 20 pour un grand poisson et 5 pour un petit poisson. Plus ces seuils sont élevés, moins le logiciel risque de détecter du bruit. Toutefois, avec une valeur trop élevée, il se peut qu’il ne puisse pas détecter le poisson.

Il peut devenir nécessaire de réajuster ces seuils ultérieurement au cours de l'expérience. Pour le seuil de taille supérieur, une valeur de 3000 est généralement suffisante. Pour la longueur spécifique, conservez la valeur prédéfinie de 220.

Le nombre de poissons correspond au nombre de poissons présents dans le réservoir d'observation. Le nombre maximal de points fait référence au nombre total d'images ; enregistrez ou retenez ce nombre, puis appuyez sur OK. Ensuite, sélectionnez l'acquisition du fond.

La fenêtre suivante demandera de remplir les champs « de » et « à ». Après avoir chargé l'arrière-plan, ajustez les trois boîtes rouges à l'aide de la souris ; ces boîtes indiquent les zones dans lesquelles le logiciel recherche le poisson. Réduisez au minimum la boîte située à gauche.

Étant donné que la vue latérale est utilisée uniquement pour l'étalonnage, appuyez maintenant sur le bouton démarrer la génération des trajectoires et la reconstruction du trajet commencera. Idéalement, l'étiquette doit être placée sur l'image du poisson ; si elle est souvent mal positionnée, ouvrez la fenêtre d'information. Ici, nous observons un cas idéal où seuls les contours du poisson sont visibles.

Dans le cas d'un bruit excessif, appuyez sur arrêter dans le menu principal et choisissez de nouveaux seuils de couleur et de taille. Vérifiez également si les cadres rouges peuvent être légèrement réduits. Par exemple, en haut, afin d'exclure le bruit généré par les mouvements de l'eau, observez la trajectoire sur l'écran 3D.

En cliquant avec le bouton droit de la souris, le chercheur peut choisir entre la rotation et les translations de la configuration 3D. Pour commencer le traitement des données, ouvrez le module de traitement des données, sélectionnez le projet dans la barre d'outils, puis dans le menu déroulant, choisissez nouveau et saisissez un nom d'expérience. Ensuite, sélectionnez modifier le projet.

Ensuite, ajouter au projet suivi d'un nouveau groupe et indiquer un nom pour le groupe expérimental. Sélectionner maintenant le groupe expérimental dans la fenêtre de droite. Remarquer que la barre d'outils va changer.

Sélectionnez le groupe d'édition, puis ajoutez au groupe, puis de nouvelles mesures. Une fenêtre de navigateur s'ouvrira. Ensuite, ouvrez le dossier créé lors de l'enregistrement et sélectionnez le sous-dossier trajectoires, puis le fichier de points lissés.

Dans l'exemple présenté ici pour le groupe A, six fichiers ont été chargés et pour le groupe B, quatre fichiers. Pour commencer l'analyse, sélectionnez le fichier lissé par point dans la fenêtre de droite. Ensuite, sélectionnez le traitement des données et les paramètres uniques dans le menu déroulant.

À titre d'illustration, sélectionnez le gel de durée. Une fenêtre s'ouvrira pour spécifier le gel en fonction du seuil de vitesse et du seuil de durée, afin de vous familiariser avec le programme. Essayez d'autres exemples tels que la distribution de la distance parcourue en profondeur, qui permet de déterminer le nombre de niveaux de profondeur et la fréquence d'explosions.

Lorsque vous sélectionnez cette option, le traitement par lots utilisant un seuil par défaut d'environ 200 extrémités sera calculé dans ce contexte. Par défaut signifie que des délimiteurs ont été définis. Par exemple, la distribution en profondeur est actuellement calculée pour trois niveaux de profondeur et la distribution angulaire est calculée pour quatre sections.

Après la génération des paramètres, une nouvelle fenêtre s'ouvre pour demander l'emplacement et le nom du fichier à créer. Ces données seront enregistrées au format CSV et peuvent être importées dans d'autres logiciels. Ici, la figure A montre un exemple typique de cadre de contrôle.

Poissons-zèbres, tandis que la figure B montre un cadre type pour des poissons-zèbres traités au MK 801, enregistré durant une session matinale. Remarquez que les poissons-zèbres témoins se trouvaient près du fond et proches les uns des autres. En revanche, les poissons-zèbres traités au MK 801 se situaient près de la surface et nageaient à une distance appréciable les uns des autres.

Ici, deux trajectoires représentatives de poissons-zèbres contrôles et de poissons-zèbres traités avec 10 micromolaire de MK 801 sont présentées pour une session matinale et pour une session après-midi. Sur cette figure, les distances sociales moyennes pour les témoins et les poissons traités avec 10 micromolaire de MK 801 sont présentées pour les deux sessions, et ici les chronologies des distances interindividuelles moyennes sont affichées pour les deux groupes.

Ici, à la figure A, on observe la répartition des poissons zèbres sur 10 niveaux de profondeur égaux durant la session du matin, et en B, la répartition lors de la session de l'après-midi. On voit ici la répartition temporelle au sein des quatre zones radiales des groupes expérimentaux. L'encart montre la position de ces zones du centre vers la périphérie, et ici nous observons la répartition temporelle dans les quatre quadrants des groupes expérimentaux.

L'encart montre l'emplacement des quadrants. Les lignes doubles représentent les murs blancs, les lignes simples représentent les murs transparents. La caméra se trouve à gauche de l'encart IE, la plus proche des quadrants un et quatre.

Les astérisques noirs indiquent les comparaisons entre les groupes de la session du matin et les astérisques gris pour celles de l'après-midi. Enfin, les composantes X, Y, Z de la distance parcourue par le poisson zèbre pendant les sessions du matin et de l'après-midi sont présentées ici. La moyenne et l'erreur type de la moyenne sont indiquées.

Lorsque vous travaillez avec le système, souvenez-vous que les données ne sont pas meilleures que l'enregistrement lui-même ; assurez-vous donc que le système est correctement étalonné et que les paramètres de la caméra sont optimaux. Le reste est simple et ne demande qu'à se familiariser avec les différentes étapes.