À grande échelle Gene Knockdown dans C. elegans Utilisation ARNdb alimentation bibliothèques pour générer des phénotypes robustes perte de fonction

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer des criblages d’interférence ARN à grande échelle en C elegance à l’aide d’une bibliothèque d’alimentation d’ARN SD bactérien pour inhiber l’expression des gènes. Ceci est accompli en cultivant d’abord des clones bactériens à partir d’une banque d’ARN DS. Dans des conditions de croissance qui empêchent la perte de plasmides, commencez par dupliquer chaque plaque de bibliothèque primaire, puis utilisez la plaque de bibliothèque dupliquée à 96 puits pour générer des tiges temporaires de bactéries sur des plaques omni de gélose.

Les bactéries de ces omniplaques sont cultivées pendant la nuit en culture liquide, puis transférées à la surface des plaques d’alimentation des vers. Chaque clone bactérien de la banque porte un plasmide codant D-S-R-N-A unique qui cible un gène C elgan pour l’inactivation. La deuxième étape consiste à placer des vers synchronisés sur les plaques d’alimentation.

Ensuite, les vers sont cultivés pendant plusieurs jours dans une chambre humidifiée à 20 degrés Celsius. Lorsque les vers se nourrissent des bactéries, les ARN SD induits sont libérés dans l’intestin de l’animal où ils se propagent ensuite aux tissus environnants pour provoquer des effets d’inactivation systémiques. La dernière étape consiste à examiner les animaux nourris à la recherche d’effets phénotypiques causés par l’inactivation spécifique d’un gène.

Ces tests phénotypiques sont utilisés pour identifier les gènes importants pour le processus biologique à l’étude. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la micro-injection d’ARN double brin dans la gonade du ver est qu’elle est à haut débit. À l’aide de bibliothèques d’alimentation, nous pouvons examiner la fonction biologique de presque tous les gènes de l’élgin de mer en quelques semaines seulement.

De nombreux laboratoires ont eu du mal avec cette approche inabattue parce que la plupart des gènes et l’élégance C sont heureusement suffisants. Ainsi, l’inactivation de l’ARN doit diminuer l’expression des gènes de plus de 50 % pour produire des phénotypes de perte de fonction. Pour garantir une neutralisation robuste des gènes, il est essentiel que toutes les bactéries nourries aux vers expriment le plasmide d’ARN double brin.

Pour commencer la procédure de détermination de la perte de plasmide, prélevez un petit échantillon de bactéries comme décrit à chaque étape pertinente et ajoutez-le à 450 microlitres d’eau stérile. Utilisez 100 microlitres de cet échantillon dilué pour créer d’autres dilutions en série à l’aide d’eau stérile. Mélangez soigneusement les solutions entre les dilutions.

Étalez 100 microlitres de chaque dilution sur des plaques LB et LB AMP et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain, identifiez la plaque LB qui contient entre 100 et 500 colonies bactériennes. Comptez le nombre de colonies sur cette plaque et sur la plaque lb amp correspondante contenant la même dilution de bactéries. Déterminez la perte de plasmide à l’aide de cette équation.

Le pourcentage de bactéries qui ne contiennent pas le plasmide est calculé en soustrayant le nombre de colonies sur la plaque d’ampli LB du nombre de colonies sur la plaque LB, en divisant par le nombre de colonies sur la plaque LB et en multipliant par 100 La perte de plasmide est empêchée par la croissance de bactéries dans de fortes concentrations de sellin carbonique Pour une destruction efficace. Vérifiez la perte de plasmide avant de nourrir les animaux et ne continuez que si la perte de plasmide est inférieure à 15 %. Commencez cette procédure en retirant les plaques de bibliothèque en double du congélateur à moins 80 degrés Celsius. Retirez le sceau en aluminium pendant que les cultures sont encore congelées.

Replacez le couvercle en plastique des plaques et placez les plaques de bibliothèque en double sur une surface plane pour les décongeler à température ambiante pendant 30 minutes maximum. Stérilisez le réplicateur buccal à 96 broches. Placez-le dans un bain d’éthanol, puis brûlez l’éthanol.

Enduire les broches à l’aide d’un chignon et d’un brûleur. Laissez la flamme s’éteindre, puis répétez. Les broches d’un réplicateur propre doivent être rincées à l’eau distillée, puis stérilisées avant chaque utilisation.

Placez le réplicateur stérilisé dans les puits de la plaque dupliquée décongelée et utilisez-le pour remuer doucement les cultures. De petits volumes de la culture adhéreront aux broches du réplicateur. Retirez délicatement le réplicateur des puits de la plaque dupliquée et placez-le doucement sur la surface de la plaque omni

Veillez à ne pas percer la surface de la gélose. Laissez le réplicateur sur la surface de l’omniplaque pendant trois à quatre secondes afin que les bactéries des broches du réplicateur soient transférées sur la surface de la gélose. Pour éviter la perte de plasmide sur les milieux solides, l’ate contient deux milligrammes par millilitre.

Carbonic sellin. Retirez le réplicateur et laissez le petit volume de culture bactérienne être absorbé dans la gélose. Une fois que les deux plaques ont été dupliquées.

Incuber les plaques omni inversées pendant 15 à 18 heures à 37 degrés Celsius le lendemain matin. Ces plaques omnidirectionnelles peuvent être utilisées soit pour inoculer des cultures liquides de 96 puits, soit stockées jusqu’à sept jours à quatre degrés Celsius. Les bactéries pour l’alimentation des vers sont préparées sous forme de cultures liquides à l’aide de bactéries provenant des plaques omni à l’aide d’un pipeteur répété et d’un embout combiné de 50 millilitres, distribuez un millilitre de milieu de croissance bactérienne dans chaque deux millilitres.

Puits profond d’une plaque à 96 puits stérilisez le réplicateur et placez-le sur la surface d’une plaque omni contenant des colonies bactériennes, en vous assurant que les broches sont en contact avec chacune des 96 colonies bactériennes. Déplacez avec précaution le réplicateur de la surface de l’omniplaque dans la plaque de puits profonds, en vous assurant que les broches ne raclent pas les côtés des puits profonds jusqu’à ce qu’elles soient immergées dans le milieu de croissance. Pour déloger les bactéries dans le milieu de croissance.

Déplacez le réplicateur lentement dans un mouvement carré en suivant la paroi intérieure de la plaque du puits profond. Veillez à ne pas éclabousser et contaminer les puits. Pour chaque plaque de culture à 96 puits profonds, deux commandes doivent être incluses.

Bactéries exprimant l’ARN SD comme contrôle positif pour l’inactivation attendue, phénotype et bactéries contenant un vecteur d’ARN SD vide comme contrôle négatif. À l’aide d’une anse d’inoculation stérile, prélever une seule colonie bien isolée de la plaque de contrôle positif et inoculer un puits vide dans le puits profond appelé plaque. Notez la position du puits qui a été inoculé.

Répétez l’opération pour le contrôle négatif. Secouez les plaques à puits profonds à plat à 650 tr/min sur un micro-agitateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après une nuit d’incubation des cultures, les bactéries des 96 plaques de puits profonds seront transférées à 12.

Le transfert des plaques d’alimentation de puits peut être effectué quatre puits à la fois. Placez les pointes de pipette sur tous les trois canaux d’une pipette multicanaux à 12 canaux. Retirer 150 microlitres de culture bactérienne de la plaque de puits profonds et éjecter à la surface de quatre puits de la plaque d’alimentation de 12 puits.

Il est important de ne pas percer la surface de la gélose pendant le transfert car les vers s’enfouiront et ne se nourriront pas des bactéries exprimant l’ARN DS. Une fois que chaque ensemble de quatre puits est transféré, remplacez les quatre pointes de pipette par quatre nouvelles pointes de pipette stériles et ensemencez les quatre puits suivants de la plaque d’alimentation, stockez les plaques ensemencées à la verticale dans l’obscurité à température ambiante pendant la nuit afin que les bactéries puissent être absorbées par la gélose. Avant de transférer les larves de L one arrêtées sur des plaques d’alimentation d’ARN SD pour un criblage alimentaire.

La concentration des larves L one arrêtées préalablement préparées doit être déterminée. Mélangez l’erlenmeyer contenant les larves L one arrêtées pour répartir les animaux. Retirez ensuite une aliquote de 10 microlitres et placez-la goutte à goutte sur une plaque NGM de six centimètres décollée.

En quatre à cinq, descendez le centre de l’assiette. Assurez-vous que tout le support est expulsé de la pipette. À l’aide de l’extrémité de la pointe de la pipette, étalez les points de suspension de vis sans fin pour former une seule ligne continue de liquide qui s’étend sur le diamètre de la plaque.

À l’aide d’un microscope à dissection, comptez tous les animaux en commençant à une extrémité de la ligne de liquide et en continuant jusqu’à l’autre extrémité avant que le liquide ne soit absorbé dans la plaque et que les animaux ne se dispersent. Cela peut nécessiter un recentrage constant de la lunette de dissection pour s’assurer qu’aucun animal n’est manqué. Répétez cette procédure de comptage pour trois aliquotes distinctes de 10 microlitres afin de déterminer le nombre moyen de vers par microlitre de suspension de vers et notez ce nombre directement sur l’erlenmeyer.

Pour commencer le criblage d’alimentation, utilisez la suspension de larves L one arrêtées et de l’eau stérile pour préparer une solution contenant 2000 vers par millilitre. Chaque plaque d’alimentation à 12 puits nécessitera 120 microlitres de cette suspension de vers soigneusement mélangés pour assurer une répartition uniforme des animaux et transférer les animaux dans un réservoir stérile pour le pipetage. À l’aide de la pipette multicanaux configurée avec des pointes dans toutes les trois positions, transférez 10 microlitres de la solution de vers de terre directement sur la pelouse bactérienne des plaques d’alimentation.

Veillez à ne pas percer la surface de la gélose car les vers s’enfouiront dans la gélose et ne se nourriront pas des bactéries exprimant le D-S-R-N-A. Après le transfert de la solution de vers de terre toutes les deux rangées de plaques d’alimentation, remélangez la solution de vers dans le réservoir en la secouant doucement pendant que les vers s’installent, examinez rapidement quelques puits dès le début sous la lunette de dissection pour vous assurer que chaque puits reçoit 20 à 30 vers. Une fois que toutes les plaques d’alimentation ont des vers, rangez les plaques à la verticale dans une boîte humidifiée dans un incubateur à 20 degrés Celsius le lendemain après que la suspension de vers ait été absorbée dans la plaque, retournez les plaques et retournez dans l’humidificateur à 20 degrés Celsius.

Les animaux sur ces plaques peuvent être observés après trois jours pour les phénotypes P zéro, puis à nouveau après six jours pour les phénotypes F1. Le protocole décrit ici a été utilisé pour tester quatre gènes pour l’œuf renversé L 30 dumpy 17, PAT 10, et sur quatre œufs, L 30 et quatre sont exprimés dans le système nerveux. Pat 10 est exprimé dans les muscles de la paroi corporelle et dumpy 17 est exprimé dans les cellules épidermiques.

Les mutants Erie one Lin 15 B ont été utilisés dans les cribles en raison de leur sensibilité accrue à l’ARNi en tant que contrôle négatif. Les vers ont été nourris avec des bactéries contenant le plasmide PL 44 40 vide qui n’exprimait pas d’ARN SD comme prévu. RIE un Lin 15 B : des animaux nourris avec des bactéries contenant dans le plasmide vide n’ont montré aucun défaut morphologique ou comportemental.

Cette photographie montre des animaux se déplaçant librement, comme en témoigne leur posture corporelle normale. La flèche noire indique la position d’un jeune animal adulte. La flèche blanche indique la position d’un groupe d’œufs pondus.

Le comportement normal des vers est montré dans ce clip vidéo, l’œuf L 30 code l’ortho log de l’élégance marine de la sous-unité G-protéine G alpha Q.Lorsque L un étage Érié un Lin 15 B, les larves ont été nourries avec des bactéries exprimant l’œuf L 30 DS ARN. Les larves sont devenues des adultes qui ont montré des défauts évidents dans la locomotion et le comportement de ponte. Après trois jours, 100 % des animaux nourris avec de l’ARN SD contre l’œuf L 30 étaient paralysés et incapables de pondre des œufs.

Cette photographie montre que tous les animaux ont adopté une apparence rigide typique des animaux paralysés. L’absence totale d’œufs pondus dans l’assiette doit également être notée. Dumpy 17 code pour une protéine de collagène nécessaire à la formation des cuticules en mer.

Les mutants null Elgan et dumpy 17 sont plus petits et plus gros que les animaux de type sauvage. Dans cette expérience, aucun défaut morphologique n’a été observé chez les animaux nourris avec du P zéro nourri avec du dumpy 17 D-S-R-N-A. Cependant, 98 % des animaux F1 comme le montre cette figure présentaient le phénotype dumpy.

Notez que les animaux adultes sur le terrain, dont l’un est marqué par la flèche, sont plus courts et plus gros que l’animal adulte marqué par la flèche noire. Dans le panneau A.L’absence d’animaux P zéro courts et gras indique que la fonction du gène dumpy 17 est nécessaire aux premiers stades larvaires pour une bonne morphologie corporelle. Pat 10 code pour la protéine CA de troponine musculaire de la paroi corporelle contenant quatre motifs de main EF qui lient le calcium.

Il a été observé dans cette étude que 100 % des animaux Erie one Lin 15 B nourris avec Pat 10 DS ARN sont devenus paralysés dans les trois jours et n’ont pondu aucun œuf, ce qui a conduit à un phénotype mortel. Notez que bien que les animaux soient paralysés, ils peuvent toujours bouger les muscles de leur tête pour se nourrir, comme l’indique l’élimination des bactéries près de la tête marquée par la flèche sur quatre encodages, une protéine du domaine homéo exprimée dans les motoneurones de la moelle ventrale et nécessaire à une entrée synaptique correcte. Le choix sur quatre a été choisi comme gène de test dans cette étude car il s’est avéré résistant aux stratégies précédentes d’alimentation par ARN SD.

Les résultats de cette étude ont montré que 62 % des animaux nourris avec quatre bactéries exprimant l’ARN DS à partir de la préparation de la banque présentaient des défauts de comportement de locomotion par rapport aux animaux de type sauvage qui reculent librement dans un mouvement sinusoïdal lorsqu’ils sont poussés sur la tête, UNC quatre mutants nuls ne reculent pas, mais se contractent plutôt étroitement provoquant un fléchisseur dorsal, qui devient souvent si extrême que la tête et la queue de l’animal se touchent, plaçant le corps dans une position enroulée. Ce tableau montre le pourcentage d’animaux qui présentent des phénotypes nuls lorsqu’ils sont nourris avec de l’ARN SD contre chacun des quatre gènes testés ; 100 animaux ont été examinés pour chaque expérience de knockdown. Ces résultats démontrent l’importance de la rétention plasmidique pour le succès de l’ARN SD.

Des phénotypes de perte de fonction robustes et hautement pénétrants peuvent être observés dans tous les tissus. Une fois maîtrisé, l’ensemble de la bibliothèque d’alimentation peut être examiné par une seule personne en deux mois environ. Pour améliorer le débit, nous ne testons chaque clone bactérien qu’une seule fois dans un tamis d’alimentation.

Tous les gènes identifiés lors du premier passage dans la bibliothèque sont ensuite testés à nouveau. En trois exemplaires, nous insistons sur le fait que le phénotype souhaité est observé dans tous les retests pour que le gène soit mis au carré comme un résultat positif. Le plasmide est ensuite purifié à partir de la bactérie et séquencé pour vérifier l’identité du gène codé.

Une fois qu’un gène est identifié, nous commandons un mutant L s’il est disponible et le testons pour le phénotype souhaité avant d’effectuer toute caractérisation supplémentaire du gène.