Name: Transplantations faciales Xenopus laevis Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez la transplantation de tissu facial EAD entre embryons Xenopus laevis pour étudier le développement craniofacial. Cette méthode révèle les interactions de signalisation et les mécanismes génétiques impliqués.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Radek Šindelka pour son aide, et Cas Bresilla pour aider avec la grenouille élevage et la préparation de l&#39;embryon. Ce travail a été financé par le NIH via le R01DE021109 de subvention à HLS Laura Jacox a été financé par le Herschel Smith bourse d&#39;études supérieures à l&#39;Université de Harvard et une subvention F30 bourse individuelle F30DE022989-01 à la NIDCR.

Une. Réactifs Préparation <ol><li> 10x MBS: Préparer 1 L de 10x modification Saline de Barth (MBS) de la solution 17. Reportez-vous au tableau 1, les réactifs, les ingrédients et les instructions. Utilisez de l&#39;eau distillée pour toutes les solutions. Mélanger dans un bol, à l&#39;aide d&#39;une barre d&#39;agitation, jusqu&#39;à complète dissolution. Toutes les solutions doivent être effectuées à température ambiante. </li><li> 1x MBS: Diluer 100 ml de solution 10x MBS dans 900 ml d&#39;eau distillée pour obtenir 1 L de 1x MBS. Ajouter 0,7 ml de solution M CaCl 2 1. </li><li> 0,1 x MBS: Diluer 1x MBS pour préparer 1 L de solution 0.5x MBS et 2 L de 0,1 x MBS solution. Pour 1 L de 0,1 x MBS solution, ajouter 1 ml de 10 mg / ml solution de gentamicine. La solution de MBS de 0,1 x la gentamicine sera utilisé pour la culture d&#39;embryons à long terme. </li><li> Ficoll / MBS: Ajouter 15 g de Ficoll 400 à 500 ml d&#39;une solution 0,5 x MBS. Mélanger vigoureusement. Ajouter une barre d&#39;agitation et mélanger jusqu&#39;à dissolution complète du Ficoll (plusieurs heures). </li><li> 70% d&#39;éthanol: Diluer à 100% d&#39;éthanol à 70% d&#39;éthanol à l&#39;aidede l&#39;eau distillée. </li></ol> 2. Préparation de verre Outils d&#39;exploitation <ol><li> préparation de l&#39;aiguille: Charge tube capillaire dans un extracteur d&#39;aiguilles. <ol><li> Tirez les aiguilles selon les paramètres indiqués dans le tableau 2: les paramètres de traction aiguilles. Les réglages sont pour une micropipette extracteur Sutter Instrument Co. Modèle P-80/PC et tubes capillaires, comme décrit dans le tableau de réactifs et d&#39;équipements spécifiques. Cependant, ces paramètres sont spécifiques à l&#39;aiguille extracteur Sutter, et devront être ajustés pour les autres machines. Les paramètres peuvent être déterminées en utilisant un test de rampe, comme spécifié par le fabricant de la machine. </li><li> Tirer 4-6 aiguilles en vue de la procédure. Les aiguilles doivent être répartis de telle sorte que la partie flexible, les cheveux en forme de l&#39;embout de verre est complètement retiré, ce qui est typiquement de 2 à 3 mm de long. La pointe doit être relativement rigide, mais tout de même suffisamment étroit pour être utilisé comme un outil de coupe. Voir photo d&#39;une aiguille idéal à la figure 1A. </li&gt; <li> Stocker les aiguilles dans une boîte de Pétri avec une bande de terre le long du centre. Appuyez sur l&#39;arbre de chaque aiguille dans l&#39;argile, pour le maintenir en place et de tenir le bout pointu fragile loin du fond et les côtés. </li></ol></li><li> Pour les outils supplémentaires, obtenir une couverture lames de verre, une paire de longues pinces standards de modèle, d&#39;un bec Bunsen, et 3-4 pipettes Pasteur en verre (taille 5 ¾ po). </li><li> outil Pipette: Pour faire un outil de pipette, allumer le brûleur Bunsen et placer la pointe d&#39;une pipette Pasteur en verre dans la partie bleue de la flamme tout en le tournant, de telle sorte que la pointe fond et complètement le trou joints, formant une, extrémité fermée arrondie . Le arrondie, pointe scellée est ensuite utilisé pour faire des dépressions dans le plat en argile qui contient les embryons pendant l&#39;opération. Voir la figure 1B. </li><li> ponts en verre: Pour faire des ponts en verre, utiliser des pinces de modèle à long standard pour rompre avec précaution 3 mm par 3 mm des morceaux de verre lamelle. Tout en maintenant le morceau de lamelle avec tweezers, placer le verre dans la flamme jusqu&#39;à ce que tous les quatre bords et adoucir la courbe vers le bas, formant un dôme de verre minuscule. Les bords ne doivent plus être pointu. Voir la figure 1C. </li><li> Conserver les ponts de glissement de couverture de verre en les insérant, bords vers le bas, en pâte à modeler, recouvrant le fond d&#39;une boîte de Pétri. Insérer les ponts de telle sorte que la partie supérieure du pont reste au-dessus de la surface de l&#39;argile. Ne poussez pas trop dur de sorte que les ruptures de pont, et ne pas intégrer totalement le pont dans l&#39;argile, parce qu&#39;il peut être difficile à enlever. Après la stérilisation à la flamme ou à l&#39;éthanol 70%, les ponts peuvent être réutilisées d&#39;une expérience à. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;opération d&#39;embryons <ol><li> Tapisser un petit 60 mm boîte de Petri en plastique de pâte à modeler. Entre deux utilisations, la surface de la boîte et de l&#39;argile est soigneusement lavé avec de l&#39;eau distillée, puis avec 70% d&#39;éthanol. REMARQUE: Utilisez le rouge, blanc ou jaune, Van Aken Plastalina pâte à modeler, qui peut être acheté à un localy ou magasin d&#39;art. Argile noire n&#39;est pas recommandé, car il libère un résidu. </li><li> Remplissez le plat avec 3% de solution de Ficoll 0.5x MBS. La concentration en sel plus élevée empêche la dissociation du tissu, et le Ficoll polysaccharide permet d&#39;épaissir la solution, ce qui contribue à la face de fixation en position. </li><li> Utilisez l&#39;outil de pipette Pasteur flambé (voir la figure 1) de faire peu profondes, 2-3 mm dépressions dans l&#39;argile, de la profondeur d&#39;un corps stade 20 de l&#39;embryon. Assurez 20-30 dépressions, 1-2 mm, de chaque côté de la boîte, il ya donc un total de 40-60 dépressions. Étiqueter un côté LOF / GOF, et l&#39;autre de type sauvage de côté, par la sculpture initiales dans l&#39;argile avec une pince. </li></ol> 4. Préparation Preoperation d&#39;embryons <ol><li> Obtenir et de la culture de Xenopus laevis embryons utilisant des méthodes standards 17. Pour une description détaillée de la grenouille élevage, s&#39;il vous plaît voir Sive et al. 17 <ol><li> Quarante-huit heures avant l&#39;expérimentation bénéficier du droit d&#39;dans les œufs de grenouilles femelles et effectuer la fécondation in vitro. </li><li> Injecter 0,5-1 ng de membrane coiffé GFP ARNm, ainsi que toute l&#39;ARNm désiré ou anti-sens oligonucléotides antisens morpholino modifié (&quot;Morpholinos») au stade d&#39;une cellule ou dans deux cellules au stade 2 cellules. L&#39;un stade cellulaire dure environ 70-90 min. Injecter un volume total de 1-3 nl. A la place de l&#39;ARN codant pour une protéine fluorescente (GFP tel que l&#39;ARN ou DP), on peut injecter FITC dextran marqué ou morpholino marqué par fluorescence. La fluorescence est important pour déterminer si la transplantation de tissus et guérit reste dans la tête. </li><li> Plafonné de l&#39;ARNm peut être préparé à partir d&#39;un plasmide linéarisé à l&#39;aide d&#39;un SP6 mMessage mMachine ou kit T7. Morpholinos peut être conçu et commandé par Gene Tools LLC. La quantité de morpholino requise pour un effet désiré doit être déterminée pour chaque gène 18. </li><li> Stocker les embryons injectés à 15 ° C pendant 48 heures, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade 19-20. (Fou toutes les étapes ultérieures, des embryons de stade selon la table normale de Xenopus laevis par Nieuwkoop et Faber 19.) NOTE: Le jour de la chirurgie, les deux embryons donateurs et bénéficiaires doivent être dans un stade de l&#39;autre pour les greffes de travailler de manière optimale. Cependant, les embryons injectés avec morpholinos (&quot;morphants») développent parfois plus lentement que le type sauvage ou contrôlent embryons morphant, ce qui rend nécessaire de coordonner les expériences afin que les deux morphant et embryons de type sauvage sont au même stade. Peuvent avoir besoin d&#39;être maintenue à une température plus élevée pendant 12 à 24 heures avant la procédure morphants. Pour augmenter la probabilité que les embryons peuvent être trouvés à des stades correspondants, les embryons peuvent être maintenus à différentes températures. Vingt-quatre heures avant l&#39;expérience, il faut diviser les embryons dans une plusieurs plats, et placer morphants à 18-20 ° C et les embryons de type sauvage à 15-18 ° C. </li></ol></li><li> Le jour de l&#39;expérience de transplantation, remOve les embryons de the15 ° C incubateur et organiser eux selon Nieuwkoop et Faber 19. Si elles sont plus jeunes que la fin neurula (étape 19), les laisser à température ambiante pendant 1-2 heures, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade 19. </li><li> Tamiser les embryons injectés sous un microscope à fluorescence. Sélectionner des embryons qui montrent uniforme, vive fluorescence pour l&#39;expérience. </li><li> Supprimer l&#39;encombrement et les contaminants possibles à proximité de la zone d&#39;exploitation. Essuyez la surface d&#39;exploitation, stéréoscopique et tous les outils avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Une fois que les embryons sont au stade 19, retirer la membrane vitelline utilisant # 5/45 pince Dumont sous un stéréomicroscope. <ol><li> Retirer la membrane vitelline de 20 à 30 de chacun des donneurs et des embryons hôtes. </li><li> Pour les premières expériences de transplantation de visage, il faut pratiquer avec quelques embryons pour chaque condition. La méthode est difficile et exige de la pratique prudent avant il peut être utilisé sur une plus grande échelle, rapidement et avec succès. On peut u travailp pour faire 20 greffes / expérience. </li></ol></li><li> Déplacer embryons hôtes dans le plat de fonctionnement en utilisant une pipette de transfert en plastique gradué avec l&#39;extrémité coupée de telle sorte que l&#39;ouverture est bien plus large que l&#39;embryon (au moins quelques millimètres). Soyez prudent pour éviter de toucher les embryons de bulles ou de la surface de l&#39;eau, comme les embryons vont exploser dans la tension de surface. </li><li> Utilisation # 5/45 une pince pour insérer les embryons dans les creux en argile, avec la partie postérieure de l&#39;embryon dans l&#39;argile. Fermez doucement l&#39;argile autour des bases de l&#39;embryon à l&#39;aide des pinces, laissant le quart supérieur de l&#39;embryon, la tête, dépassant de la dépression. </li><li> Une fois que tous les embryons hôtes sont fixées dans leurs renfoncements, se déplacer vers l&#39;autre côté de la plaque et commence à insérer les embryons donneurs dans leurs cavités. Répétez le processus de fixation des embryons dans leurs puits. </li></ol> 5. Exécution de la chirurgie de greffe de visage <ol><li> Couteau de coupe: En tant que lame de coupe pour l&#39;enlèvementdu tissu EAD donateurs, utiliser une aiguille capillaire de verre brisé de manière appropriée (voir l&#39;étape 2.3 et la figure 1). NOTE: On peut détenir directement le capillaire entre les doigts (ce qui fonctionne bien pour les personnes ayant de petites mains) ou l&#39;on peut monter l&#39;aiguille dans un porte-broche insecte. Des aiguilles de tungstène Electrosharpened 17 chargés dans un support de broche peuvent être utilisés à la place d&#39;une aiguille de tube capillaire. S&#39;il vous plaît voir supports de quilles proposées et les aiguilles de tungstène dans le tableau des réactifs et des équipements spécifiques. </li><li> Sous un microscope stéréoscopique, insérer l&#39;aiguille dans la tête de l&#39;embryon à la gauche de la glande de ciment. L&#39;aiguille doit être insérée en profondeur, de sorte qu&#39;il passe à l&#39;extérieur à partir de l&#39;embryon, à travers la tête, et dans l&#39;intestin antérieur. Pour transplanter l&#39;ensemble EAD, coupes devraient s&#39;étendre à l&#39;extérieur de l&#39;embryon à l&#39;intestin antérieur. Pour les transplantations de l&#39;ectoderme seule, coupes devraient être moins profonde et étendre seulement par l&#39;ectoderme. <ol><li> Flick l&#39;aiguille à partir de la gauche à la droite de l&#39;diriger, sur toute la largeur de la glande de ciment. La pichenette est important que le mouvement donne une coupe nette. Reportez-vous à la figure 2A pour un résumé de la technique et la figure 2B pour une démonstration des réductions. La glande de ciment et les yeux sont des repères importants pour les coupes. L&#39;ordre des coupes n&#39;affecte pas le résultat et peut varier en fonction de la préférence ou l&#39;impartialité de l&#39;utilisateur. </li></ol></li><li> Placer l&#39;aiguille au début de la coupe précédente, à la frontière gauche de la glande de ciment, et actionner le pointeau vers le haut jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le fond de l&#39;oeil gauche. Ceci créera une coupe verticale de la bordure gauche de la glande de ciment vers le bas de l&#39;oeil gauche. </li><li> Placer l&#39;aiguille à la frontière droite de la glande de ciment, et actionner le pointeau vers le haut jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le fond de l&#39;oeil droit. Ceci créera une coupe verticale de la bordure droite de la glande de ciment vers le bas de l&#39;oeil droit. </li><li> Pour exciser complètement le tissu, flick l&#39;aiguille à partir du fond de l&#39;oeil gauche de la partie inférieure de l&#39;oeil droit, la création d&#39;une coupure horizontale qui va libérer le tissu. Coupes peuvent s&#39;étendre à l&#39;extérieur de l&#39;embryon à l&#39;intestin antérieur, y compris à la fois l&#39;ectoderme et l&#39;endoderme dans l&#39;expiant EAD. Sinon, des coupes peu profondes peuvent être utilisés pour ectoderme uniquement greffes EAD. Une fois que le tissu est enlevé EAD, il devrait y avoir un trou rectangulaire de l&#39;extérieur de l&#39;embryon dans l&#39;intestin antérieur, qui s&#39;étend à partir de la glande de ciment à juste au-dessous des yeux (de haut en bas). Le trou devrait s&#39;étendre de la frontière à l&#39;intérieur de l&#39;œil gauche à la frontière à l&#39;intérieur de l&#39;œil droit (côté à l&#39;autre). Voir la figure 2Bb. </li><li> Poussez délicatement le tissu excisé à la pointe de l&#39;aiguille, et soulever à travers le tampon de la partie de la boîte contenant les embryons d&#39;accueil. Ne pas exposer le tissu à l&#39;air à la surface ou il sera endommagé. </li><li> Exciser le même tissu à partir de l&#39;embryon hôte, comme pour le donneur. Jeter l&#39;expiant EAD hôte ou l&#39;enregistrer sur insertiont dans la face des bailleurs de fonds, pour les transplantations réciproques. </li><li> Insérez le explantation des bailleurs de fonds dans le trou de l&#39;hôte résultant en utilisant # 5/45 forceps. </li><li> Une fois le tissu du donneur est correctement positionné et bien insérée, placer soigneusement un pont de verre (voir la figure 1 et la figure 2bc) sur le visage de l&#39;embryon de tenir la greffe en place. Les extrémités du pont doivent insérer dans l&#39;argile, le maintenant en place. Le pont devrait appliquer doucement pression sur le tissu transplanté, tels que la greffe se trouve au ras de la tête de l&#39;hôte, sans coller sur la tête ou se trouvant au fond de la tête. La tête peut être légèrement aplatie par la lamelle, mais attention de ne pas endommager l&#39;embryon avec trop de pression. Greffes doivent être effectués dans les 5 minutes. REMARQUE: Un enquêteur expérimenté peut effectuer une vingtaine de greffes par expérience, plus de 2-3 heures. Pendant cette période, les embryons vont progresser du stade 20-22. Fin de la greffe du visages à l&#39;étape 21 ou 22 n&#39;affecte pas les résultats. Greffes plus tard (aux stades 22-26) peuvent être faites mais sont plus difficiles que la région médiane EAD libre-crête est restreinte comme mouvements de la crête neurale crânienne dans le visage. Cohérence entre les greffes est critique. </li></ol> 6. Greffe du visage de récupération post-opération <ol><li> La guérison prend généralement 2-3 heures. Laissez les embryons à la température ambiante sans être dérangés dans leurs dépressions d&#39;argile avec les ponts de verre tenant le tissu du donneur en place. </li><li> Une fois les greffes ont guéri, retirer soigneusement les ponts en verre, enlever l&#39;argile autour de la base des embryons aide de pinces, et d&#39;utiliser un plastique diplômé pipette de transfert pour aspirer délicatement les embryons de leurs dépressions. </li><li> Mettez les embryons dans une boîte de Petri étiquetés de manière appropriée, à moitié rempli d&#39;MBS 0.1x propres gentamicine. </li><li> Cultiver les embryons à 15 ° C ou 18 ° C pendant plusieurs jours jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent l&#39;alimentation stade de têtard à l&#39;étape 40, wpoule phénotypes faciaux peuvent être marqués. <ol><li> La solution de MBS de 0,1 x la gentamicine doit être changé tous les jours, et les embryons morts doivent être retirés rapidement pour éviter la contamination et de la mort d&#39;autres embryons. </li><li> La bouche s&#39;ouvre à l&#39;étape 40. Au stade 40-41, il faut vérifier que le tissu transplanté reste guérie à la place en regardant sa fluorescence. Greffes de temps en temps tomber, donc il faut veiller à ce que tous les embryons marqués ont le tissu du donneur en place. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGorlin%2C+RJ+%22Syndromes+of+the+head+and+neck%22">Syndromes of the head and neck</a>. , Oxford University Press. UK. (1990).</li>
<li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniofacial+birth+defects%3A+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Gen.+A%22%5BJournal%5D)">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus%3A+cement+gland%2C+primary+mouth+and+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Dev. 136, 1071-1081 (2009).</li>
<li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilbert%2C+SF+%22Developmental+Biology%22">Developmental Biology</a>. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).</li>
<li>Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).</li>
<li>Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoiogenetic+neural+inducing+activity+of+the+presumptive+neural+plate+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeogenetic+neural+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Homeogenetic neural induction in Xenopus.</a> Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).</li>
<li>Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triple+origin+of+skull+in+higher+vertebrates%3A+a+study+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras.</a> Dev. 117, 409-429 (1993).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+%3A+I%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+relationships+between+placodes%2C+facial+ectoderm%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I.</a> Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+II.+The+prosencephalic+neural+plate+and+neural+folds%3A+Implications+for+the+genesis+of+cephalic+human+congenital+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities.</a> Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).</li>
<li>Lievre, A. L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li>
<li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis%3A+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).</li>
<li>Trainor, P., Tam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+of+the+mouse+embryo-+codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+the+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches.</a> Dev. 121, 2569-2582 (1995).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%22">Early Development of Xenopus laevis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpholino+injection+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morpholino injection in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing. New York. (1994).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Étapes critiques et les limites: La procédure de greffe du visage EAD est temps et un travail intensif. Il exige de la pratique, les mains stables, et la dextérité pour se perfectionner. Le protocole de greffe de la face repose sur la capacité des chercheurs à éliminer efficacement et le tissu de greffe. Si l&#39;on prend trop de temps pour insérer la greffe dans le visage de l&#39;hôte, le visage de l&#39;hôte va commencer à se contracter et à guérir. Pinces peuvent être utilisés pour étendre délicatement la rég...

Pour comprendre les mécanismes sous-jacents des défauts cranio-faciales congénitales 1-2, tissus importants et leurs contributions de signalisation au cours du développement cranio-facial doit être identifié. Dans la grenouille Xenopus laevis, une partie du visage, y compris la bouche et les narines forme de la &quot;Extreme antérieure de domaine&quot; (EAD), où l&#39;ectoderme et l&#39;endoderme sont directement juxtaposés 3-4. L&#39;EAD agit également comme un centre de signalisation pour influencer les tissus environnants, y compris la crête neurale crânienne, qui forme des mâchoires et d&#39;autres régions du visage 5. Pour identifier les gènes qui contribuent à la fonction de l&#39;EAD, une technique «visage de transplantation» a été développé, où le tissu est transplanté d&#39;un donneur dans un embryon hôte, après le retrait de la région d&#39;hôte correspondant. Après la greffe, ce qui entraîne le développement du visage est évaluée. Ainsi, les effets de la perte de fonction (LOF) ou gain de fonction (GOF) pour un gène spécifique dans la EAD sont analysées localement, où le reste de l&#39;hLire et corps est composé de tissus de type sauvage. La transplantation réciproque peut être effectuée, où le type sauvage tissu est transplanté dans des embryons avec LOF mondiale ou GOF dans les gènes spécifiques. Transplantation a été fréquemment utilisé dans Xenopus et étudie poussin 6. Par exemple, la transplantation de Xenopus a traité homogenetic induction neurale, la lentille et de la compétence de neurones, et la migration de la crête neurale 7-10. Caille-poulet greffe chimère a analysé le développement de la plaque neurale antérieure, crête neurale antérieure, la crête neurale, et les os crâniens 11-14. C&#39;est la première technique de greffe pour l&#39;étude du développement cranio-facial chez Xenopus. Cette technique a démontré un nouveau rôle pour les inhibiteurs de Wnt Frzb1 et du Croissant dans la régulation de la formation de la membrane basale dans la bouche présomptif 5. Xenopus laevis est un modèle idéal pour l&#39;étude du développement cranio-facial que les embryons sont grandes, développer l&#39;extérieur, une le visage est bien visible, ce qui permet la micromanipulation et de l&#39;imagerie de développement. Mécanismes sous-jacents du développement du visage semblent conservés, ce qui indique que les constatations faites dans la grenouille permettent de mieux comprendre le développement humain 4,15-16.

<table><tbody><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-400</td><td>Verre à chaux&nbsp ;</td></tr><tr><td>Taille 5 3/4 po Pipette</td> de transfert <td>graduée bouchée</td><td></td><td></td>en coton</tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td>jetable.</td></tr><tr><td>#5/45 Pince</td><td>Fine Science Tools de Dupont medical</td><td>11251-35</td><td>Angled 45&deg ;</td></tr><tr><td>Pince à motif standard</td><td>Outils de science fine</td><td>11000-20</td><td>Droit ; pointe dentelée ; tube capillaire en acier inoxydable</td></tr><tr><td>(pour aiguilles)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Fiber</td></tr><tr><td>Cover slip&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>48393 252</td><td>24 x 60 mm&nbsp ; micro verre de protection ;</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille&nbsp ;</td>Extracteur d’aiguille <td>Sutter Instrument Co</td><td>: abandonné Filament : FB300B</td><td>L’extracteur d’aiguille le plus similaire, actuellement disponible, est le P-97. Pour les filaments, utilisez des filaments carrés Sutter de 3,00 mm de large.</td></tr><tr><td>Modèle P-80</td> Extracteur <td></td><td></td><td>de micropipettes flamboyant / brun</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éclairage par Fostec</td><td>Fostec</td><td></td><td>Utilisez une boîte à lumière avec 2 bras à fibre optique.&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Porte-goupille nickelé</td><td>Outils de sciences fines</td><td>26018-17</td><td>Diamètre de l’ouverture de la mâchoire : 0-1 mm Porte-goupille</td></tr><tr><td>nickelé Moria</td><td>Outils de sciences fines</td><td>26016-12</td><td>Diamètre de l’ouverture de la mâchoire : 0-1 mm</td></tr><tr><td>Aiguilles en tungstène</td><td>Outils de sciences fines</td><td>10130-05</td><td>Diamètre de la tige de 0,125 mm</td></tr><tr><td>Van Aken Plastalina</td><td>Blick</td><td>#33268-2981</td><td></td></tr><tr><td>Pâte à modeler - blanche, rouge ou jaune</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMashine SP6 ou T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantations faciales<em&gt; xenopus laevis</em&gt; embryons

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Malformations congénitales cranio-faciales se produisent dans 1 sur chaque 700 naissances vivantes, mais l&#39;étiologie est rarement connus en raison de la compréhension limitée de développement cranio-facial. Pour déterminer où les voies de signalisation et les tissus agissent pendant la structuration de la face en développement, une technique «visage de transplantation» a été développé dans les embryons de la grenouille Xenopus laevis. Une région de tissu facial présomptif (le «extrême antérieure de domaine&quot; (EAD)) est retiré d&#39;un embryon donneur à l&#39;étape du bourgeon caudal, et transplanté dans un embryon hôte de la même scène, à partir de laquelle la région équivalente a été éliminée. Ceci peut être utilisé pour générer une face chimérique où le tissu de l&#39;hôte ou d&#39;un donneur a subi une perte ou gain de fonction dans un gène, et / ou comprend une étiquette de lignage. Après la guérison, le résultat du développement est surveillé, et indique les rôles de la voie de signalisation dans le donateur ou tissus de l&#39;hôte environnantes. Xenopus est un modèle précieux pour le développement de visage, comme la région du visage est large et facilement unccessible pour la micromanipulation. De nombreux embryons peuvent être analysés, sur une courte période de temps puisque le développement se fait rapidement. Les conclusions de la grenouille sont pertinents pour le développement humain, car les processus cranio-faciales semblent conservés entre Xenopus et les mammifères.

Tissu transplanté doit être complètement insérée dans la tête de l&#39;hôte après transplantation, comme indiqué sur la figure 3A, et avoir un pont de verre placée de façon appropriée sur le visage de l&#39;embryon, comme le montre la Figure 2bc. Le tissu du donneur transplanté doit être correctement dimensionné pour l&#39;ouverture de l&#39;hôte, pour la transplantation, pour réussir. Le tissu EAD ne doit pas dépasser de la tête, en aucune façon, comme on le voit sur ​​les figu...

Une technique de transplantation de &quot;Extreme antérieur domaine&quot; mouchoirs entre les embryons de Xenopus laevis a été développé. Tissu peut être déplacé d&#39;un gène expression fond dans un autre, ce qui permet l&#39;étude des besoins locaux pour le développement cranio-facial et d&#39;interactions entre les régions du visage de signalisation.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

L'objectif général de cette procédure est de transplanter un tissu facial correspondant au domaine antérieur extrême, ou EAD, entre des embryons de Xenopus laevis. Cette opération s'effectue tout d'abord en retirant le tissu EAD d'embryons donneurs et d'embryons receveurs possédant des fonds génétiques différents. Ensuite, les explants EAD provenant des embryons donneurs sont insérés dans les faces des embryons receveurs.Dans l'étape finale, les embryons transplantés sont maintenus pendant 60 à 70 heures après la fécondation afin d'être observés. En fin de compte, la microscopie en champ clair et en fluorescence peut être utilisée pour observer les changements dans le développement crâniofacial des animaux transplantés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine du développement crâniofacial afin d'améliorer notre compréhension des déformations crâniofaciales, telles que de nouveaux signaux requis pour le développement oral provenant du domaine antérieur extrême. Avant l'opération, charger un tube capillaire dans un tireur d'aiguilles, puis tirer quatre à six aiguilles en les cassant, de sorte que la portion souple de la pointe en verre, de deux à trois millimètres, ressemblant à un cheveu, soit entièrement retirée.La pointe doit être relativement rigide, mais suffisamment étroite pour être utilisée comme outil de coupe. Ensuite, allumez un bec Bunsen et placez l'extrémité d'une pipette Pasteur en verre dans la partie bleue de la flamme. Faites tourner la pipette afin que la pointe fonde et que l'orifice se scelle complètement, formant une extrémité arrondie fermée. Pour fabriquer des ponts en verre, utilisez des pinces de modèle standard longues afin de détacher soigneusement des morceaux de verre de lamelle de 3 millimètres sur 3 millimètres.Ensuite, tenez le morceau de lamelle avec des pinces et placez le verre dans la flamme jusqu'à ce que les quatre bords s'assouplissent et s'incurvent vers le bas, formant une petite coupole de verre. Ensuite, tapissez un plat de Petri en plastique de 60 millimètres avec de l'argile à modeler rouge, blanche ou jaune. Puis remplissez le plat avec du 3 %phi.Appeler la solution XMBS 0,5 X. Ensuite, utiliser la pâtére flambée, votre outil de pipette, pour réaliser de 40 à 60 petites dépressions peu profondes de deux à trois millimètres, d'une profondeur équivalente à celle du corps d'un embryon au stade 20, dans l'argile 48 heures avant l'expérience. Obtenir les œufs à partir de grenouilles femelles et les féconder in vitro.Ensuite, après avoir injecté les embryons avec un ARNm de membrane coiffé, de l'ARNm GFP et tout autre ARNm, les conserver à 15 degrés Celsius pendant 48 heures jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade 19 à 20. Le jour de l'expérience de transplantation, utiliser un microscope fluorescent pour sélectionner les embryons injectés présentant une fluorescence uniforme et intense. Après avoir nettoyé la surface de travail, le microscope stéréo et les outils avec de l'éthanol à 70 %, utiliser une pince Dumont n°5 45 pour retirer la membrane de Vitelline de chaque embryon sélectionné sous microscope stéréo.Ensuite, utilisez une pipette plastique graduée de transfert dont la pointe a été coupée pour déplacer les embryons hôtes dans la boîte de dissection. Veillez à ne pas mettre les embryons en contact avec l'interface air-eau. Insérez les embryons côté postérieur vers le bas dans les dépressions en argile et utilisez la pince pour refermer délicatement l'argile autour de la base de chaque embryon, en laissant la tête dépasser de la dépression. Pour retirer le donneur face la première, insérez l'une des aiguilles étirées dans la tête de l'embryon à gauche de la glande à ciment, suffisamment profondément pour qu'elle traverse l'extérieur de l'embryon, passe par la tête et pénètre dans le précurseur de l'intestin antérieur.Faites passer l’aiguille rapidement du côté gauche au côté droit de la tête, sur toute la largeur de la glande cimentaire, afin d’effectuer une coupe nette. Ensuite, placez l’aiguille au début de la coupe, à la limite gauche de la glande cimentaire, puis faites-la glisser vers le haut jusqu’à atteindre le bas de l’œil gauche, afin de réaliser une coupe verticale allant de la bordure gauche de la glande cimentaire au bas de l’œil gauche. Puis, positionnez l’aiguille à la bordure droite de la glande cimentaire et faites-la remonter rapidement jusqu’au bas de l’œil droit pour créer une coupe verticale allant de la bordure droite de la glande cimentaire au bas de l’œil droit.Ensuite, pour exciser complètement le tissu, déplacer rapidement l'aiguille du bas de l'œil gauche au bas de l'œil droit, créant ainsi une incision horizontale qui libérera le tissu. Maintenant, pousser délicatement le tissu excisé sur la pointe de l'aiguille et le soulever à travers le tampon vers la partie de la boîte contenant les embryons hôtes. Exciser le tissu de l'embryon hôte comme vient de l'être démontré, en éliminant l'hôte, l'explant EAD, et en insérant l'explant donneur dans l'ensemble hôte obtenu.Une fois que le tissu donneur est correctement positionné et entièrement inséré avec précaution, placez l'un des ponts en verre préparés précédemment au-dessus du visage de l'embryon afin de maintenir la greffe en place, en insérant les extrémités du pont dans l'argile pour assurer sa stabilité. Après l'intervention, laissez les embryons au repos, sans perturbation, à température ambiante pendant deux à trois heures. Ensuite, une fois que les greffes ont cicatrisé, retirez délicatement les ponts en verre des embryons ainsi que l'argile située autour de la base des embryons.Ensuite, utilisez une pipette plastique graduée pour aspirer délicatement les embryons hors de leurs alvéoles. Transférez les embryons dans une boîte de Pétri correctement étiquetée, remplie à moitié avec du 0,1 XMBS propre supplémenté en gentamicine, et faites développer les embryons à 15 à 18 degrés Celsius pendant plusieurs jours jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade 40. Changez la solution de MBS quotidiennement et observez le tissu transplanté en fluorescence pour confirmer que l’explant reste cicatrisé en place.Les tissus transplantés doivent être entièrement insérés dans la tête de l'hôte après la greffe, comme vient de l'être démontré, et doivent présenter une taille adaptée à l'ouverture de l'hôte pour que la greffe soit un succès. Le tissu EAD ne doit en aucun cas dépasser de la tête, comme on peut l'observer sur ces deux images montrant des explants mal positionnés. Par ailleurs, la greffe du visage ne doit pas être tournée par rapport à sa position dans le corps donneur, comme illustré ici.Après plusieurs heures, le tissu transplanté et la région faciale environnante devraient être cicatrisés, et dès le lendemain, l'embryon devrait présenter l'aspect illustré dans ces images, où la microscopie par fluorescence, comme vient de l'être démontré, peut être utilisée afin de confirmer que la greffe est restée en place durant le processus de cicatrisation. Au stade 42, le tissu témoin transplanté contribuera à la formation de la bouche et restera fluorescent vert. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la technique de transplantation de tissu EAD d'un embryon à un autre.Faciliter l'utilisation de cette méthode pour identifier quelle couche germinale ou région de l'EAD est la plus cruciale pour le développement facial.

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zebrafish transplantation de cellules permet la combinaison de la génétique et l'embryologie de générer des chimères tissulaires spécifiques. Cette vidéo montre gastrula scène transplantations de cellules qui ont permis à notre laboratoire pour étudier les rôles des populations astrogliales et les indices des directives précises lors de la formation commissure dans le prosencéphale.

Tissu ciblé chimères embryonnaires: Zebrafish cellulaire Gastrula transplantation

Animaux bouchons surexprimant le produit du gène (s) sont transplantées dans le flanc de...

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Ce protocole vidéo montre une méthode pour générer des...

La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Cartilages craniofaciale développent en contact étroit avec d'autres tissus et sont difficiles à manipuler des animaux vivants. Nous utilisons l'électroporation pour offrir des outils moléculaires lors de la croissance du squelette cranio-facial tout en contournant les premiers effets embryonnaire. Cette approche nous permettra de tester efficacement des molécules...

Electroporation de Mesenchyme craniofaciale

Ce protocole décrit comment disséquer la crête neurale crânienne prémigratoire (NC) de Xenopus laevis neurulas. Ces explants peuvent être étalées sur la fibronectine et cultivées in vitro, ou greffés retour dans des embryons hôtes. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de la NC transition épithélium-à-mésenchyme, la migration et la différenciation.

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

Procédé pour quantifier la taille et la forme de orofaciale embryons de Xenopus laevis a été développé. Dans ce protocole, les mesures traditionnelles de taille sont combinés avec la morphométrie géométrique pour permettre des analyses plus poussées de développement oro-faciale et des anomalies.

Quantification de Orofacial phénotypes dans Xenopus

Dans les embryons de xénope, les cellules du toit du blastocèle sont pluripotentes et peuvent être programmées pour générer divers tissus. Ici, nous décrivons des protocoles permettant d’utiliser des explants de toit de blastocèle d’amphibiens comme système de test pour étudier les principales caractéristiques in vivo et in vitro du développement neuronal précoce.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonnaires explants à étudier les caractéristiques du développement précoce Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

Gènes essentiels à la survie posent des obstacles techniques pour créer des lignées mutantes. Saute-mouton contourne la létalité en combinant génome édition avec la transplantation de cellules germinales primordiales pour créer des animaux sauvage porteurs de mutations germinales. Brûler les étapes permet également la génération efficace des homozygotes mutants null dans la génération de1 F. Ici, l’étape de la transplantation est démontrée.

Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus

Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d'embryons de Xenopus laevis d'un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Cet article décrit une technique de transplantation de tissus conçue pour tester les propriétés de signalisation et de structuration du cerveau antérieur basal au cours du développement craniofacial.

Création de chimères du cerveau antérieur aviaire pour évaluer le développement facial

Les manipulations embryologiques telles que la disparition et la transplantation de cellules sont des outils importants pour étudier le développement précoce. Ce protocole décrit un dispositif de transplantation simple et efficace pour effectuer ces manipulations chez des embryons de poisson zèbre.

Un dispositif de transplantation simple et efficace pour les embryons de poisson zèbre

Découvrez la transplantation de tissu facial EAD entre embryons Xenopus laevis pour étudier le développement craniofacial. Cette méthode révèle les interactions de signalisation et les mécanismes génétiques impliqués.

Transplantations faciales

Explorer plus de vidéos