Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

L'objectif général de cette procédure est de disséquer et de monter des embryons de poisson zèbre afin d'obtenir une visualisation microscopique optimale de la moelle épinière. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, une microdissection permet d'isoler et de retirer le « oak ball » ; deuxièmement, les débris résiduels sont éliminés et les embryons sont transférés à l'aide d'une pipette sur une lame de microscope.

Ensuite, l'excès de liquide est soigneusement éliminé à l'aide d'un essuie-tout Kim, puis on ajoute le milieu de montage. La dernière étape consiste à orienter les embryons sur la lame à l’aide d’un stylet à embryons, puis à poser la lamelle de couverture. Enfin, une microscopie en fluorescence ou en champ clair est utilisée pour visualiser la distribution des corps cellulaires post-mitotiques et la trajectoire des axones en développement.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de la neurobiologie, comme quelles sont les mécanismes responsables du balayage, de la différenciation et du guidage des axones. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur de nombreux aspects du développement du système nerveux, elle peut également être appliquée à d'autres tissus, tels que le muscle en développement. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car une dissection au microscope est nécessaire avant de commencer l'expérience.

Préparez un pique-embryon en collant une pointe de pipette sur une pipette usagée, puis en collant un fil de pêche sur la pointe de pipette. Pour commencer la dissection de l’embryon, placez jusqu’à 30 embryons de poisson zèbre âgés de 24 heures après la fécondation dans une boîte de Pétri de 35 millimètres remplie de PBS.

Sous un microscope stéréo, fixez la tête d’un embryon à l’aide d’une pince tout en tirant le chêne avec une aiguille à insecte. Ensuite, utilisez le stylet à embryons pour déplacer les embryons vers une zone de la boîte de Pétri qui ne contient pas beaucoup de débris de vitellus. Puis, aspirez les embryons dans une pipette Pasteur en verre en aspirant le moins de liquide possible.

Ensuite, prélevez délicatement jusqu'à 21 embryons à la pipette et déposez-les sur une lame. Éliminez soigneusement l'excès de liquide à l'aide d'un essuie-tout de laboratoire en évitant de toucher les embryons, puis ajoutez une goutte de milieu de montage sur les embryons. Ensuite, utilisez le stylet à embryons pour positionner les embryons sur leur flanc en deux à trois rangées.

Maintenant, appliquez une petite quantité de vaseline dans chaque coin d'un lamelle. Retournez la lamelle de manière à ce que la face recouverte de vaseline soit orientée vers le bas, puis placez la lamelle au-dessus des embryons. La vaseline empêche les embryons d'être endommagés par une compression excessive.

Tapotez doucement la lame à couvrir sur chaque coin jusqu'à ce que le milieu de montage touche la lame, si nécessaire, à l'aide d'une pipette de 20 à cent microlitres. Ajoutez davantage de milieu de montage à côté de la lame et laissez-le pénétrer par capillarité sous celle-ci. Utilisez ensuite un chiffon de laboratoire pour nettoyer complètement la zone autour de la lame à couvrir.

Ne pas appliquer de pression sur la lame couvre-objet, car cela peut endommager les embryons. Une fois la zone correctement nettoyée, elle doit être sèche et ne pas contenir de vaseline ni de milieu de montage. Terminer en scellant les bords de la lame couvre-objet avec du vernis à ongles. Après le montage des embryons de poisson zèbre, plusieurs segments HEMI situés au-dessus de l'extension du sac vitellin ont été visualisés.

Cette figure montre l'expression de NK X 6.1 dans la moelle épinière ventrale de l'embryon de poisson zèbre. L'ARNm de NK X 6.1 est distribué approximativement dans la moitié ventrale de la moelle épinière à 24 heures post-fécondation. Au sein du domaine des progéniteurs, les cellules progénitrices se distinguent des cellules post-mitotiques en raison de la présence de la plaque du plancher, située dans la partie médiale de la moelle épinière.

Observé avec une optique DIC. Les cellules individuelles sont clairement distinguables et une limite définie entre les cellules exprimantes et non exprimantes est apparente. La sortie des cellules progénitrices du cycle cellulaire s'accompagne de changements dans l'expression génique.

Cette image montre l'expression de robo three dans les neurones postmitotiques. La famille de récepteurs robo correspond à des récepteurs de guidage axonal dont l'expression permet des dénombrements précis de neurones postmitotiques. Remarquez que la plaque du plancher et la zone de progéniteurs ne sont pas visibles dans ce plan de focalisation plus latéral.

La microscopie confocale a été utilisée pour imager l'immunofluorescence de znp1, qui marque les axones moteurs comme le montre cet embryon monté latéralement. Les neurones moteurs quittent la moelle épinière par la partie ventrale à 24 heures post-fécondation pour innervater la musculature en développement environnante. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de préserver l'intégrité des tissus par une microdissection soigneuse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser des techniques de microdissection pour enlever le vitellus des embryons de poisson zèbre afin de les monter et de les visualiser au microscope.