Name: Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules immunitaires du tissu adipeux par digestion au collagénase et centrifugation différentielle. Cette méthode permet de quantifier macrophages et lymphocytes T par cytométrie en flux pour étudier les maladies immunométaboliques.

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JSO est soutenu par une NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de l&#39;American Diabetes Association (7-10-MI-05), et AHH est soutenu par une bourse de chercheur de l&#39;American Heart Association Établi (12EIA8270000). expériences de cytométrie de flux ont été réalisées dans le MVC cytométrie en flux ressource partagée. Le MVC cytométrie en flux ressource partagée est soutenue par la Digestive Disease Research Center Vanderbilt (DK058404).

1. Réactifs et Consommables Avant de lancer ce protocole expérimental, préparer les réactifs suivants: <ol><li> Éthanol à 70% </li><li> PBS 1X </li><li> 1X DPBS (sans Ca et Mg) supplémenté avec 0,5% de BSA </li><li> FACS tampon: 1X DPBS (sans Ca et Mg), EDTA 2 mM, et 1% de SVF </li><li> Tampon ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 et 0,1 mM Na 2 EDTA dans l&#39;eau </li></ol> 2. La récolte et la préparation du tissu adipeux <ol><li> Euthanasier les souris selon des procédures IACUC approuvées propres à chaque institution. </li><li> Bien mouiller le pelage avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Faire une incision au niveau de l&#39;appendice xiphoïde (partie inférieure du sternum) et ouvrir la cage thoracique pour exposer le cœur, en prenant soin de ne pas couper tous les principaux vaisseaux sanguins. </li></ol> Remarque: À ce stade, il est également utile de laisser le diaphragme intact autant quepossible et à faire une entaille sur le côté droit de la cage thoracique pour permettre au sang et perfusat de s&#39;écouler hors de la cavité thoracique. <ol start="4"><li> Coupez l&#39;oreillette droite pour permettre au sang et perfusat d&#39;échapper au système circulatoire. </li></ol> Remarque: Lorsque vous traitez avec des souris obèses, l&#39;excès de péricardiques AT devra peut-être être enlevé pour permettre l&#39;accès au cœur. <ol start="5"><li> Saisir le cœur avec une pince et insérer doucement une aiguille dans le ventricule gauche par le sommet. Perfuser lentement la souris avec 15 ml de PBS stérile. </li></ol> Note: réduire le taux de perfusion si les poumons commencent à se remplir et se développer. <ol start="6"><li> Ouvrez la cavité péritonéale et retirer les coussinets adipeux perigonadal utilisant soin d&#39;éviter les tissus gonadiques. </li><li> Placez coussinets adipeux dans un bateau pèse sur la glace contenant 2 ml 1X DPBS (sans Mg, Ca) complémenté avec 0,5% de BSA, et émincez l&#39;AT en petits morceaux. </li></ol>Note: Limitez la quantité d&#39;AT par bateau pèse 1,2 g. Si le montant de AT dépasse 1,2 g, diviser uniformément entre deux pesées bateaux. <ol start="8"><li> Conserver à des échantillons sur la glace et préparer la solution 3 ml de collagénase digest par AT échantillon constitué de 1X DPBS complété avec 0,5% de BSA, 10 mM CaCl 2 et 4 mg / ml de collagénase de type II. </li></ol> 3. digestion à la collagénase <ol><li> Transfert AT à 50 ml tubes coniques en versant le broyat et le rinçage du bateau peser avec 1 ml de DPBS (BSA à 0,5%) et la solution 3 ml de collagénase II digest. </li><li> Incuber à broyat dans un shaker rotatif (200 rpm) à 37 ° C pendant 20 min. </li><li> Ajouter 10 ml (DPBS 0,5% BSA) à tubes coniques et les placer sur la glace. </li><li> Triturer homogénat de nombreuses fois à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique 10 ml, et de passer des suspensions cellulaires à travers le filtre 100 um dans un nouveau tube conique de 50 ml. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant 10 min à 4 &amp; Dpar exemple; C. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension SVF culot cellulaire dans 3 ml de tampon ACK lyse contaminer les érythrocytes. </li><li> Ajouter 12 ml de tampon FACS et la suspension cellulaire par centrifugation à 500 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension SVF culot cellulaire dans un tampon FACS. </li></ol> Remarque: Utilisez la taille du culot cellulaire comme un guide pour combien de tampon FACS pour remettre po Si le culot cellulaire recouvre le fond du tube conique de 50 ml, utiliser un tampon FACS 0,5-1 ml, sinon, remettre en suspension dans 0,25-0,5 ml. <ol start="9"><li> Placer les échantillons sur la glace et préparer les portions de dilution 1:10 de chaque échantillon pour le comptage des cellules en mélangeant 40 pi de tampon FACS, solution de bleu trypan 50 pi (0,2%), et 10 suspension cellulaire ul. </li><li> Compter les cellules viables sur la base exclusion du bleu trypan et diluer les suspensions cellulaires à une concentration finale de 5-10 x 10 6 cellules / ml. </li></ol> 4. La coloration des antigènes de surface cellulaire <ol&gt; <li> Ajouter anti-souris CD16/CD32 anticorps (bloc Fc) à une concentration finale de 0,5-1 μg/10 6 cellules et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> échantillons de transfert (≥ 10 6 cellules) à 12 x tubes à fond rond de polystyrène de 75 mm. Préparer des tubes séparés si l&#39;analyse des cellules T et DAB, et de combiner des cellules supplémentaires pour préparer un nombre suffisant de tubes pour accueillir la compensation requise et la fluorescence modifié Minus One (FMO) contrôles. </li></ol> Note: Par exemple, lors de la quantification de la proportion de guichets automatiques basé sur F4/80 et CD11b, la rémunération suivante et contrôles FMO devra être préparé: - Non marqué (cellules) - DAPI ou l&#39;iodure de propidium (PI) taches simples (cellules; n&#39;ajoutent pas de colorant de viabilité jusqu&#39;à l&#39;étape 5.1) - F4/80 APC (cellules ou des perles de compensation) simples tache - CD11b FITC cellules ou simples tache (perles de compensation) - FMO 1 (cellules): Rat IgG2a κ isotype contrôle APC + CD11b FITC + colorant de viabilité (ajouté à l&#39;étape 5.1) - FMO 2 (cellules): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotype contrôle FITC + colorant de viabilité (ajouté à l&#39;étape 5.1) <ol start="3"><li> Ajouter anticorps primaires fluorophores conjugués et / ou contrôles isotypiques à la concentration appropriée (voir le tableau des réactifs et du matériel). </li><li> Protéger les échantillons de la lumière et incuber à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Ajouter 2 ml de tampon FACS et la suspension cellulaire par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension SVF culot cellulaire dans un tampon FACS 2 ml. </li><li> Centrifugeuse cellule suspension 500 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension SVF culot cellulaire chez ≥ 400 pi de tampon FACS. </li><li> Transférer des échantillons de 12 x 75 tubes à fond rond de polystyrène mm équipé d&#39;un 35 um cellule passoire bustiers tubulaires.</li><li> Protéger de conserver les échantillons lumière, et à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse FACS. </li></ol> Note: Pour des résultats optimaux cellules doivent être analysées immeadiately; toutefois, l&#39;analyse FACS avec ce protocole a été menée avec succès sur des cellules marquées stockées dans un tampon FACS pendant 1-2 heures à 4 ° C. Si les cellules doivent être fixés pour augmenter le temps de stockage, les cellules marquées peuvent être fixés à 2% de paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 24 heures avant l&#39;analyse FACS. sociétés d&#39;anticorps suggèrent que les cellules marquées peuvent être stockées pendant une semaine, mais cela n&#39;a pas été testé dans le cadre de cette procédure. 5. Analyse FACS <ol><li> Avant l&#39;analyse FACS, ajouter colorant de viabilité des échantillons et des contrôles appropriés pour permettre la discrimination de cellules vivantes / mortes. </li></ol> Note: De nombreux colorants de viabilité sont disponibles dans le commerce, mais DAPI et PI sont recommandées en fonction de l&#39;excitation / émission profiles de l&#39;anticorps conjugué à un fluorophore étant utilisés. DAPI et iodure de propidium sont ajoutés à chaque échantillon à une concentration finale de 0,2 mg / ml. <ol start="2"><li> Utilisez un échantillon de contrôle négatif sans tache, de préférence des cellules isolées à partir du même tissu que les échantillons expérimentaux, pour ajuster la diffusion latérale (SSC) et diffusion vers l&#39;avant (FSC) de sorte que la population cellulaire (s) d&#39;intérêt sont sur la balance. </li></ol> Note: Pour l&#39;analyse des AT cellules de la FSV, il est recommandé de SSC être affiché dans une échelle logarithmique en fonction de FSC dans une échelle linéaire. L&#39;utilisation d&#39;une échelle logarithmique pour SSC est particulièrement important lorsque l&#39;on analyse les guichets automatiques, qui sont souvent très importantes et granulaire. <ol start="3"><li> Dessiner une grille de diffusion de la lumière initiale basée sur le type de cellule (s) en cours d&#39;analyse, et d&#39;ajuster le tube photomultiplicateur (PMT) gain de sorte que les cellules non colorées sont à l&#39;extrême gauche d&#39;un histogramme à un seul paramètre (environ centrée sur 10 2) pour les voies appropriées. &lt;/ Li&gt; </ol> Note: Il est recommandé que les lymphocytes et les macrophages (ou d&#39;autres cellules myéloïdes) être analysés séparément en raison de différences dans les auto-fluorescence. <ol start="4"><li> Utilisez des commandes simples ou colorés capture anticorps perles de compensation pour effectuer une compensation multi-couleur. </li></ol> Note: L&#39;utilisation de billes d&#39;indemnisation est recommandée; toutefois, la compatibilité de chaque anticorps doit être assurée. Par exemple, des perles de compensation peuvent pas de réaction croisée avec des anticorps de lapin, dans ce cas, les cellules isolées sont nécessaires pour obtenir un contrôle tache unique approprié. <ol start="5"><li> Réglez portes expérimentales basées sur les contrôles FMO modifiés. </li><li> Réglez le cytomètre de flux pour recueillir le nombre approprié d&#39;événements basés sur la prévalence de la population d&#39;intérêt et enregistrer des données expérimentales. </li><li> Les fichiers de données exportation FCS pour l&#39;analyse hors ligne. Il existe de nombreux programmes disponibles pour cytometr de débitl&#39;analyse des données y. Nous recommandons Cytobank, une plate-forme basée sur le Web qui permet aux investigatores pour stocker et analyser les données et de générer des chiffres depuis n&#39;importe quel ordinateur avec accès internet 18. En outre, Cytobank offre la possibilité de rendre accessible données publiques ou restreindre l&#39;accès à des collaborateurs. </li></ol>

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

L&#39;intérêt croissant pour le rôle du système immunitaire dans les conséquences métaboliques de l&#39;obésité a conduit à l&#39;utilisation généralisée de la cytométrie en flux pour caractériser les cellules immunitaires de l&#39;AT. Bien que le protocole exact variera entre laboratoires basés sur leur propre expérience et de l&#39;équipement disponible, les étapes essentielles comprennent digestion à la collagénase, centrifugation différentielle, et la surface des cellules antigène étiquetage. L&#39;objectif du prése...

Historiquement, le tissu adipeux (AT) a été considéré comme un organe inerte de stockage des lipides, qui se dilate et se contracte en réaction à l&#39;équilibre énergétique. Nous comprenons maintenant que AT représente un organe endocrine qui sécrète dynamique activement un certain nombre d&#39;hormones, qui influent directement sur le comportement alimentaire et l&#39;homéostasie du glucose systémique. En outre, au cours de la dernière décennie, il ya eu une appréciation croissante pour les nombreuses populations de cellules immunitaires résidant dans l&#39;AT fraction stroma vasculaire (SVF), ainsi que leur contribution à AT homéostasie. La capacité de séparer le AT adipocyte et SVF en utilisant une collagénase digest suivie par centrifugation différentielle a d&#39;abord été décrit par Rodbell en 1964 1. Collagénase II est le plus souvent utilisé pour la séparation des adipocytes et SVF pour cause de maintenance de récepteurs de l&#39;insuline des adipocytes 1. Dès le début, le fractionnement enzymatique de AT a été principalement utilisé pour étudier adipoCyte métabolisme et d&#39;isoler les pré-adipocytes. Plus récemment, cette technique, combinée avec la large disponibilité des cytomètres et le nombre sans cesse croissant d&#39;anticorps conjugué à un fluorophore disponibles dans le commerce, a facilité la caractérisation des cellules immunitaires AT. Bien que la présence de cellules immunitaires dans enflammée AT avait été décrit précédemment 2, les articles fondateurs de Weisberg et al. et Xu et al. publié en 2003 furent les premiers à documenter l&#39;accumulation de macrophages AT (GAB) dans l&#39;obésité, qui sécrètent des cytokines inflammatoires et en corrélation avec la résistance à l&#39;insuline AT-spécifique et systémique 3,4. Ces observations ont servi de base d&#39;un nouveau champ d&#39;investigation récemment inventé, &quot;immunometabolism,&quot; 5 et ont été suivies par des études impliquant différentes populations de cellules immunitaires, dont les cellules dendritiques, les mastocytes 6 7, 8 cellules T -10, les cellules B, les cellules NKT 11 12 13, les éosinophiles, les neutrophiles et 14,15 dans le développement de l&#39;obésité associée à une résistance à l&#39;insuline. Le but de cet article est de fournir une description détaillée de la technique digest collagénase utilisée pour isoler les cellules de la SVF AT et de caractériser les guichets automatiques et AT cellules T via la cytométrie de flux. Ce protocole a été optimisé pour les souris AT; toutefois, les téléspectateurs peuvent bénéficier de la lecture d&#39;un excellent article fournissant de nombreux détails sur l&#39;optimisation de cette technique pour l&#39;homme à 16 ans. Le public cible de cet article comprend des enquêteurs ayant une expérience limitée de travail avec la souris à effectuer et cytométrie de flux. Plusieurs considérations pratiques pour équilibrer le rendement et la viabilité cellulaire avec le temps et les ressources sont présentées ainsi que des contrôles de cytométrie de flux optimales pour caractériser les populations de cellules immunitaires. En plus de notre protocole, les lecteurs sont referred à un article de JoVE récente par Basu et al. pour une excellente discussion de quelques-uns des aspects techniques de cytométrie en flux pour inclure des contrôles et des compensations adéquates 17.

<table><tbody><tr><td>DPBS (sans Ca ni Mg) 10 x 500 ml</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>collagénase</td><td>Sigma</td><td>C6885-5G</td><td></td></tr><tr><td>solution d’iodure de propidium</td><td>Sigma</td><td>P4864-10 ml</td><td></td></tr><tr><td>pile stable 20 microlitres</td><td>Rainin</td><td>SS-L10</td><td></td></tr><tr><td>20 pointes filtrantes microlitres</td><td>Rainin</td><td>SRL10F</td><td></td></tr><tr><td>pile stable 250 pointes microlitres</td><td>Rainin</td><td>SS-L250</td><td></td></tr><tr><td>pointes 1000 microlitres</td><td>pointes Rainin</td><td>GPS-L1000</td><td></td></tr><tr><td>1000 pointes filtrantes microlitres</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>250 pointes filtrantes microlitres</td><td>Rainin</td><td>SR-L200F</td><td></td></tr><tr><td>FC Block</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>fisher 100mn passoires</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>plat de poids moyen</td><td>Fisherbrand</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>feuille d’aluminium</td><td>Fisherbrand</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>ciseaux de hachage</td><td>Fisherbrand</td><td>089531B</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Tube FACS</td><td>BD Falcon 352235</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Étui à pipette de 10 ml 200</td><td></td><td></td> Tubes à fond rond BD Falcon 1367520 <td></td></tr><tr><td>Seringue de 5 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td> Falcon 309646 <td></td></tr><tr><td>V Bottom Plates</td><td>Costar</td><td>07-200-107</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette à bulbe de transfert</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>11 676 071</td><td></td></tr><tr><td>Tapis adhésif</td><td>Thermo Scientific</td><td>1368750</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de culture cellulaire</td><td>Sorvall</td><td>75253839</td> Adaptateurs Sorvall 75003723 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Concentration : 0,5 - 1 &mu ; g/ 106 cellules</td></tr><tr><td>anti-souris Rat F4/80</td><td>eBioscience</td><td>17-4801</td><td>Conjugué fluorophore : APC Concentration : 0,2 &mu ; g/ 106 cellules Numéro de catalogue de contrôle d’isotype : 17-4321</td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Conjugué fluorophore : FITC Concentration : 0,5 &mu ; g/ 106 cellules Numéro de catalogue de contrôle d’isotype : 11/1/4031</td></tr><tr><td>Hamster arménien anti-souris CD11c</td><td>eBioscience</td><td>12-0114</td><td>Conjugué fluorophore : PE Concentration : 0,8 &mu ; g/ 106 cellules Numéro de catalogue de contrôle d’isotype : Dec-88</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris MGL1/2</td><td>R& D Systems</td><td>FAB4297P</td><td>Conjugué fluorophore : PE Concentration : 0,1 &mu ; g/ 106 cellules Numéro de catalogue de contrôle d’isotype : IC108P</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris CD206</td><td>R& D Systems</td><td>FAB2535P</td><td>Conjugué fluorophore : PE Concentration : 0,1 &mu ; g/ 106 cellules Numéro de catalogue de contrôle d’isotype : IC108P</td></tr><tr><td>Rat anti-souris CCR2</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5538P</td><td>Conjugué fluorophore : PE Concentration : 0,1 &mu ; g/ 106 cellules Numéro de catalogue de contrôle d’isotype : IC013P</td></tr><tr><td>hamster arménien anti-souris TCR&#946 ;</td><td>BD Biosciences</td><td>553174</td><td>Conjugué fluorophore : APC Concentration : 0,2 &mu ; g/ 106 cellules Numéro de catalogue de contrôle d’isotype : 553956</td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>552877</td><td>Conjugué fluorophore : PE-Cy7 Concentration : 0,8 &mu ; g/ 106 cellules Numéro de catalogue de contrôle d’isotype : 552784</td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>557956</td><td>Conjugué fluorophore : Alexa Fluor 700 Concentration : 0,2 &mu ; g/ 106 cellules Numéro de catalogue du contrôle d’isotype : 557963</td></tr><tr><td colspan="4">Table 1. Liste des matériaux et réactifs.</td></tr></tbody></table>

isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

La découverte de l&#39;augmentation de l&#39;infiltration des macrophages dans le tissu adipeux (AT) de rongeurs obèses et les humains a conduit à une intensification de l&#39;intérêt de la contribution des cellules immunitaires à l&#39;insulino-résistance locale et systémique. L&#39;isolement et la quantification des différentes populations de cellules immunitaires dans minces et obèses AT est maintenant une technique couramment utilisée dans les laboratoires de immunometabolism; soins encore extrême doit être pris à la fois dans l&#39;isolement des cellules vasculaires stromales et dans l&#39;analyse de cytométrie en flux de sorte que les données obtenues sont fiables et interprétables . Dans cette vidéo, nous démontrons comment mâche, digérer, et d&#39;isoler la fraction vasculaire enrichie en cellules stromales immunitaire. Par la suite, nous montrons comment les macrophages de l&#39;étiquette d&#39;anticorps et des lymphocytes T et la manière de porte correctement sur eux des expériences de cytométrie en flux. Représentant parcelles de cytométrie de flux de matières grasses nourris gras nourris obèses souris maigres et élevé sont fournis. Un élément essentiel de cette analyse est l&#39;utilisation d&#39;anticorps qui nepas de fluorescence dans les canaux où AT macrophages sont naturellement autofluorescente, ainsi que l&#39;utilisation des contrôles de compensation appropriées.

Collagénase digestion d&#39;AT suivie par centrifugation différentielle a été utilisée pour isoler le SVF de coussinets adipeux épididymaires de souris C57BL/6J mâles nourris avec une faible teneur en gras (10% kcal provenant du gras) ou riche en graisses (60% kcal provenant du gras) régime (LFD et HFD , respectivement) pendant 16 semaines. Les cellules de la FSV ont ensuite été marquées avec des anticorps primaires fluorophore conjugué à quantifier la proportion de guichets automatiques viable (figure 1)</stron...

Le tissu adipeux (AT) est un site d&#39;activation intense des cellules immunitaires et de l&#39;interaction. Presque toutes les cellules du système immunitaire sont présents dans A et leurs rapports sont modifiés par l&#39;obésité. Une bonne isolation, la quantification et la caractérisation des AT populations de cellules immunitaires sont essentielles pour la compréhension de leur rôle dans la maladie immunometabolic.

Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules immunitaires du tissu adipeux. Ceci est accompli en retirant d’abord les coussinets adipeux de l’épiderme. Dans la deuxième étape, le tissu adipeux est digéré avec de la collagénase.Ensuite, la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux est isolée par centrifugation différentielle. Dans la dernière étape, les cellules immunitaires du tissu adipeux sont marquées avec des anticorps primaires conjugués au fluoro quatre. En fin de compte, la proportion de macrophages et de lymphocytes T viables résidant dans le tissu adipeux peut être quantifiée par cytométrie en flux.Bonjour, je m’appelle Alyssa Hasty. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment isoler et quantifier les cellules immunitaires du tissu adipeux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunométabolisme, telles que la façon dont les populations de cellules immunitaires dans le tissu adipeux changent à la suite d’une manipulation génétique, pharmacologique ou nutritionnelle.La démonstration de la procédure aujourd’hui sera assurée par Arian Kennedy et Jeb, ou par des boursiers postdoctoraux de mon laboratoire. Après avoir soigneusement mouillé la fourrure de l’animal euthanasié avec de l’éthanol à 70 %, faites une incision au niveau du processus xiphoïde et ouvrez la cavité thoracique pour exposer le cœur en prenant soin de ne pas sectionner les principaux vaisseaux sanguins. Ensuite, coupez l’oreillette droite pour permettre au sang et au perfu huit de sortir du système circulatoire.Ensuite, utilisez une paire de pinces pour saisir le cœur et insérez doucement une aiguille à travers l’apex dans le ventricule gauche. Maintenant, perfrez lentement la souris avec 15 millilitres de PBS stérile. Ouvrez ensuite la cavité péritonéale et retirez les coussinets adipeux gonadiques en prenant soin d’éviter tout tissu gonadique.Placez les coussinets adipeux dans un bateau de lactosérum sur de la glace contenant deux millilitres de DPBS sans magnésium et sans calcium complétés par 0,5 % BSA, puis émincez le tissu adipeux en petits morceaux. Voici à quoi devrait ressembler la graisse à la fin du hachage. Versez maintenant l’homogénat de tissu adipeux haché dans un tube conique de 15 millilitres.Rincez le webo avec un millilitre de DPBS complété par BSA et versez le nettoyant dans le tube conique. Ensuite, rincez le bateau WHE avec trois millilitres de solution de collagénase et versez le nettoyant dans le tube. Incuber l’homogène dans un agitateur rotatif pendant 20 minutes à 200 tr/min et 37 degrés Celsius.Ajoutez ensuite 10 millilitres de DPBS supplémenté en BSA à l’homogénat à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres. Ensuite, itérez plusieurs fois l’homogénat digéré et placez le tube sur de la glace. Faites passer la suspension cellulaire à travers un filtre de 100 micromètres dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.Après avoir fait tourner les cellules, décantez le snat, puis licenciez les érythrocytes contaminants dans la pastille cellulaire de la fraction vasculaire stromale. Avec trois millilitres d’un tampon CK. Ajoutez rapidement une mémoire tampon de télécopie pour neutraliser la mémoire tampon A CK.Après le lavage et la remise en granulés, les cellules remettent le granulé en suspension dans le tampon de télécopie. Comptez ensuite les cellules viables par exclusion du bleu trian et diluez davantage la suspension cellulaire jusqu’à une concentration finale de cinq à 10 fois 10 à six cellules par millilitre. Commencez la coloration en incubant les cellules avec des anticorps bloquants anti-US CD 16, CD 32 FC à une concentration finale de 0,5 à un microgramme par 10 cellules pendant 10 minutes sur glace.Divisez ensuite les cellules en une quantité supérieure ou égale à 10 aux six aliquotes et transférez les aliquotes dans des tubes à fond rond en polystyrène de 12 x 75 millimètres. Combinez toutes les cellules supplémentaires dans un nombre suffisant de tubes pour permettre la compensation requise et la fluorescence modifiée moins un contrôle. Ajoutez ensuite des anticorps primaires conjugués au fluoro quatre et des contrôles d’isotypes dans les tubes appropriés aux concentrations appropriées.Après avoir incubé les échantillons dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, lavez les échantillons deux fois dans deux millilitres de tampon de fax en suspendant les granulés dans plus de 400 microlitres de tampon de fax Après le deuxième lavage, transférez les échantillons dans de nouveaux tubes à fond rond en polystyrène de 12 x 75 millimètres équipés de tubes de crépine de 35 micromètres. Juste avant l’analyse, ajoutez une matrice de viabilité pour la discrimination des cellules mortes vivantes aux échantillons appropriés. Utilisez ensuite une commande négative non colorée pour ajuster la diffusion latérale sur une échelle logarithmique et la diffusion directe sur une échelle linéaire.Ensuite, dessinez une porte de diffusion de la lumière initiale basée sur le type de cellule analysée et ajustez le gain du tube photomultiplicateur de sorte que les cellules non colorées soient à l’extrême gauche d’un histogramme à paramètre unique approximativement centré sur la tendance des deux marques pour les canaux appropriés. À l’aide de billes de compensation de capture d’anticorps, effectuez la compensation multicolore, puis réglez les portes expérimentales en fonction des contrôles de fluorescence modifiés moins un préalablement préparés. Enfin, recueillir le nombre approprié d’événements en fonction de la prévalence de la population d’intérêt et consigner les données expérimentales.Dans cette première série de graphiques de densité, des cellules de fraction vasculaire stromale isolées du tissu adipeux épidermique urinaire ont été colorées pour F quatre 80 et CD 11 B pour l’identification des macrophages du tissu adipeux. Ces trois premiers panneaux illustrent la stratégie de déclenchement initiale, y compris la discrimination du doublet de diffusion de la lumière et les portes de viabilité. Dans ces deux panneaux suivants, on peut observer des contrôles représentatifs de fluorescence modifiée moins un utilisés pour définir les portes expérimentales.Dans cet exemple, les anticorps F quatre 80 et CD 11 B ont été remplacés par des contrôles d’isotypes appropriés pour tenir compte de l’autofluorescence et de la liaison non spécifique. Les portes quadrantes ont ensuite été dessinées pour identifier les macrophages de tissu adipeux viables F quatre 80 CD 11 B positifs. La proportion de macrophages de tissu adipeux F quatre 80 positifs CD 11 B positifs isolés de souris nourries à faible teneur en matières grasses et à haute teneur en matières grasses a ensuite pu être comparée, comme le montrent ces graphiques de densité représentatifs.Dans cette série suivante de panneaux, la porte initiale de diffusion de la lumière a été limitée à la population lymphocytaire afin d’éviter d’inclure des cellules myéloïdes autofluorescentes. Dans ces deux dernières paires de panneaux, un contrôle représentatif des lymphocytes T du tissu adipeux CD quatre positifs et CD huit positifs est mis en évidence. Les lymphocytes viables du tissu adipeux ont d’abord été contrôlés pour TCR R bêta tcr.Les lymphocytes T du tissu adipeux R bêta positif ont ensuite été contrôlés pour l’expression de CD quatre et de CD huit. La proportion de lymphocytes T bêta positifs TCR et de lymphocytes T CD quatre positifs et CD huit positifs isolés dans le tissu adipeux de souris nourries à haute teneur en graisses et à faible teneur en graisses a ensuite pu être comparée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules immunitaires du tissu adipeux.

Research

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique d’isolement et de culture de cellules souches dérivées du tissu adipeux de l’arc périaortique murin marquées par fluorescence à partir de tissus adipeux murins de l’arc périaortique. Après l’isolement, les NCADCs sont détectés, triés à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence, puis cultivés sur une plaque, favorisant ainsi la prolifération cellulaire.

Isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux périortique murin

En 2001, des chercheurs de l'UCLA ont décrit l'isolement d'une population de cellules souches adultes, les cellules appelé ou CSA souches du tissu adipeux, du tissu adipeux. Cet article décrit l'isolement des CSA de lipoaspirates utilisant un protocole de digestion enzymatique manuel à l'aide de la collagénase.

Isolation Manuel des cellules souches du tissu adipeux de Lipoaspirates humaines

Grâce à la connexion drastique et négative entre l'obésité et d'autres comorbidités, la recherche sur le rôle adipeux joue dans la maladie et la santé globale est justifiée. Nous présentons un protocole pour l'isolement et l'excision de dépôts adipeux permettant l'étude du tissu adipeux à l'aide in situ et des procédés in vitro.

Localisation, identification, et l&#39;excision des dépôts adipeux murin

Nous présentons les techniques nécessaires pour isoler la fraction vasculaire stromale (SVF) des dépôts de tissu adipeux inguinal (sous-cutané) et périgonadique (viscéral) de souris afin d’évaluer leur expression génique et leur activité collagénolytique. Cette méthode comprend l’enrichissement de cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC)Sca1 à haute teneur en utilisant la séparation cellulaire immunomagnétique.

Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique<sup&gt; haute</sup&gt; Cellules souches adipeuses (CSA)

Cette publication décrit un protocole pour l’isolement des noyaux des adipocytes matures, la purification par le tri activé par fluorescence, et la transcriptomique de niveau unicellulaire.

Isolement des noyaux de tissus adipeux pour applications génomiques unicellulaires

Ce protocole décrit l’approche technique permettant d’isoler des sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts de tissu adipeux blanc (WAT) intra-abdominal murin par tri cellulaire activé par fluorescence ou séparation immunomagnétique des billes.

Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Ce protocole fournit une méthode efficace de digestion de la collagénase pour isoler des adipocytes viables et des cellules stromales de fraction vasculaire-SVF de la graisse viscérale humaine en un seul processus, y compris une méthodologie pour obtenir un ARN de haute qualité à partir d’adipocytes et la phénotypification des macrophages SVF par coloration de plusieurs marqueurs membranaires pour analyse par cytométrie en flux.

Isolement d’adipocytes viables et d’une fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux viscéral humain adapté à l’analyse de l’ARN et au phénotypage des macrophages

Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

Ici, nous présentons une méthode standard pour isoler efficacement les cellules souches et les adipocytes dérivés de l’adipos, caractérisée par une réduction de &gt; 90 % du temps de traitement, une forte viabilité cellulaire et une large compatibilité.

Isolation efficace des cellules souches et adipocytes dérivés de l’adipeux à partir du tissu adipeux porcine

Découvrez l'isolation de cellules immunitaires du tissu adipeux par digestion au collagénase et centrifugation différentielle. Cette méthode permet de quantifier macrophages et lymphocytes T par cytométrie en flux pour étudier les maladies immunométaboliques.

Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

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