Un test migration cellulaire quantitative pour murins de neurones entériques progéniteurs

L’objectif global de cette procédure est de quantifier le potentiel de migration des neuroprogéniteurs entériques en présence de divers facteurs de croissance. Ceci est accompli en disséquant d’abord des embryons de souris, des intestins grêles peuplés de cellules de croûte neurologique fluorescentes. La deuxième étape consiste à utiliser un microtome vibrant pour fabriquer des tranches d’intestins de 200 microns d’épaisseur.

Ensuite, ces tranches sont incubées sur un gel de collagène contenant des facteurs de croissance. La dernière étape consiste à décoller les tranches afin de révéler les cellules migratrices en dessous. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour montrer le modèle de migration des cellules dans le gel de collagène.

Cette méthode peut aider à répondre à une question clé en biologie du développement, comme fournir une meilleure compréhension de l’interaction entre les différentes voies de signalisation sous-jacentes à la formation du système nerveux périphérique. 12 jours après la découverte d’un bouchon vaginal, euthanasier la souris femelle et retirer l’utérus, placer l’utérus dans une boîte de Pétri en verre remplie de glace. Le PBS froid coupe l’utérus transversalement entre les gonflements individuels du deum pour isoler chaque site d’implantation de l’embryon sous un microscope de dissection, utilise une pince fine pour retirer la couche musculaire de l’utérus.

Ouvrez le sac vitellin viscéral et l’amnios pour révéler l’embryon. Faites attention lorsque vous sectionnez les vaisseaux sanguins, en joignant l’embryon au sac vitellin car ils sont entrelacés avec les intestins en développement. Ensuite, insérez des pinces fermées dans la cavité abdominale juste au-dessus du foie de couleur rouge foncé et laissez-les s’ouvrir.

Cela crée une ouverture transversale dans la cavité abdominale. Tirez la pince ouverte vers le bas vers l’extrémité postérieure de l’embryon pour ouvrir complètement l’abdomen. Une fois ouvert, saisissez le tissu conjonctif derrière le foie et retirez les intestins.

En prenant soin de ne pas casser les intestins. Coupez le côlon à n’importe quel endroit pour libérer les intestins du reste de l’embryon. Réservez la portion de la queue pour plus tard.

Retirez le tissu conjonctif du caecum puis des intestins, en travaillant soigneusement pour ne pas les blesser sur l’extrémité rostrale de l’intestin grêle. Coupez le foie et l’estomac ainsi que le méso, le néphros et les crêtes génitales s’il y en a. Enfin, isolez l’intestin grêle en coupant le cæcum et le côlon ainsi que le tissu conjonctif restant.

Comme précédemment, veillez à ne pas entailler l’intestin. Laissez l’intestin grêle dans le PBS à température ambiante aussi peu de temps que possible avant de l’intégrer. Après avoir sectionné l’embryon au niveau du cou, notez le nombre de somites de la queue pour déterminer avec précision le stade de développement embryonnaire.

Avant de procéder à la dissection d’embryons, faites fondre 1,5 gramme d’agros dans 100 millilitres de PBS et maintenez-le à 50 degrés Celsius. Préparez le moule d’enrobage en coupant un tube de micro-centrifugeuse de deux millilitres dans le sens de la longueur pour exciser environ un quart de la paroi du tube. Versez les agros fondus dans le moule et laissez-les refroidir jusqu’à ce qu’ils ne soient que légèrement chauds au toucher.

Lorsque vous êtes prêt, tenez l’intestin avec une pince par l’extrémité rostrale pliée et tirez-le très lentement à travers l’agros, sur toute la longueur du moule. Cela aide à garder l’intestin droit pendant que les agro-ensembles libèrent le tissu dès qu’il commence à résister à être déplacé et à suivre l’orientation du dorlotement rostral de l’intestin. Ensuite, placez le moule dans un réfrigérateur pendant deux à trois minutes pour qu’il soit complètement pris.

Une fois pris, retirez les agros du moule et coupez l’excédent d’agros aux deux extrémités, en faisant des coupes perpendiculaires à l’intestin. Collez l’extrémité rostrale du bloc agros sur l’étage métallique d’un microtome et coupez l’excédent d’aros de tous les côtés. Ensuite, montez la platine métallique sur la chambre vibrante du microtome.

Si nécessaire, ajustez l’angle de la scène de manière à ce que l’intestin soit le plus vertical possible. Couvrez l’échantillon avec du PBS glacé avant de ramener la lame microtone à quelques millimètres sous la surface du tampon. Lorsque vous êtes prêt, faites des coupes transversales de 200 microns du cajola le plus gros de l’intestin grêle.

S’assurer que chaque tranche d’agro contient une section intestinale complète. Déposez délicatement les tranches fraîchement coupées sur un gel de collagène préalablement préparé. En plaçant une tranche vers le milieu de chaque puits pour permettre la migration des cellules de la crête neurologique hors des aubergines, incubez les tranches pendant trois jours.

Après ce temps, retirez doucement les tranches du gel de collagène à l’aide d’une pince en prenant soin de ne pas endommager le gel en dessous. Pour s’assurer que le schéma de migration cellulaire n’est pas perturbé, il est important d’éviter de toucher directement le gel de collagène lors des étapes d’incubation et de lavage suivantes. Tout d’abord, fixez les cellules avec 500 microlitres de 4 % de PFA par puits pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, remplacez le fixateur par 500 microlitres de solution DPI par puits et incubez pendant 10 minutes. À température ambiante, retirez soigneusement la solution DPI et lavez chaque puits trois fois avec 500 microlitres de PBS pendant cinq minutes. Enfin, photographiez les cellules fluorescentes intégrées dans le gel de collagène à l’intérieur de chaque puits.

Dans cet exemple, des facteurs de croissance ont été utilisés pour stimuler la migration des cellules de la croûte neuronale entérique exprimant la GFP. La ligne pointillée représente la taille et l’emplacement approximatifs de l’explication. Avant qu’il ne soit retiré du gel, le nombre et la propagation des cellules exprimant la GFP migrant hors de l’explan intestinal se sont avérés significativement plus élevés dans les conditions traitées que dans les conditions non traitées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer le potentiel de migration des progéniteurs neuraux entériques en incubant des tranches intestinales sur un gel de collagène contenant des facteurs de croissance.