Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les mutations somatiques dans les gènes associés au cancer des cellules du tissu tumoral en utilisant des bibliothèques d’ADN multiplexées à code-barres, suivies d’un séquençage massivement parallèle. Ceci est accompli en ligaturant d’abord des adaptateurs de séquençage à code-barres sur des fragments d’ADN isolés de tumeurs préservées. La deuxième étape de la procédure est l’hybridation en oligonucléotides biotinylés personnalisés, complémentaires à tous les exons d’enrobage protéique de 279 oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs.

La troisième étape consiste à effectuer un séquençage massivement parallèle des pools de codes-barres à partir des bibliothèques capturées. La dernière étape consiste à rechercher dans les données de séquence des altérations associées au cancer pour les 279 gènes ciblés. Cette procédure peut révéler des mutations de séquence, de petites insertions, de petites délétions, des altérations du nombre de copies et des altérations structurelles sélectionnées.

Ainsi, les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont qu’elle permet d’étudier des exons entiers pour les mutations courantes et rares, ainsi que d’identifier des altérations génomiques supplémentaires telles que les pertes et les gains de nombre de copies, et d’atteindre une plus grande sensibilité dans des échantillons hétérogènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique du cancer, telles que quelles sont les principales mutations factrices dans divers types de cancer, et ces mutations dans les échantillons cliniques sont-elles corrélées avec les résultats ou la réponse aux thérapies ciblées ? Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic et au traitement du cancer, car les mutations peuvent être identifiées de manière prospective et être utilisées pour aider à guider les patients vers les thérapies et les essais cliniques appropriés.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car une étape de nettoyage des abeilles est difficile à apprendre en raison d’une technique de prudence nécessaire lors du lavage et de l’évasion de l’ADN des perles Préparez le mélange maître de réparation d’extrémité. Mélangez les volumes appropriés pour avoir 50 microlitres par échantillon. Aliquote les 50 microlitres de chaque ADN pur dans des puits séparés d’une plaque d’identification à six puits.

Ajoutez ensuite 50 microlitres du mélange maître de réparation d’extrémité préparé à chaque réaction et incubez la plaque dans un thermocycleur pendant 30 minutes à 20 degrés Celsius pour nettoyer la réaction. Tout d’abord, ajoutez 200 microlitres de billes AMP pure XP à chaque échantillon et pipetez doucement tout le volume de haut en bas 10 fois à l’aide d’un pipeteur multicanaux. Ensuite, laissez incuber l’assiette à température ambiante pendant 15 minutes.

Ensuite, déplacez les plaques vers le support magnétique et laissez-les s’éclaircir pendant 15 minutes à température ambiante. Une fois nettoyé, retirez délicatement et jetez la majeure partie du surnageant en prenant soin de ne pas déranger les billes. Il se peut qu’un peu de liquide reste dans les puits.

Ajoutez ensuite doucement 200 microlitres d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à chaque échantillon et incubez la plaque à température ambiante pendant 30 secondes. Pipetez soigneusement l’éthanol et répétez le lavage une fois de plus. Ensuite, laissez sécher la plaque à température ambiante jusqu’à ce que tout l’alcool s’échappe.

Maintenant, remettez en suspension les billes séchées dans 44,5 microlitres d’eau stérile. Faites passer doucement chaque échantillon dans la pipette 10 fois avec la dernière éjection. Rincez toutes les perles attachées sur le côté du puits.

Maintenant, incubez les billes d’eau en suspension à température ambiante pendant deux minutes, puis déplacez-les vers le support magnétique pendant cinq minutes jusqu’à ce que les puits soient clairs. Enfin, transférez doucement 42 microlitres de surnageant clair dans chaque puits, qui contient l’échantillon, dans un nouveau puits. Les échantillons peuvent maintenant être conservés à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine.

Commencez par préparer le mélange maître de résidus D dans un microtube à centrifuger stérile. Ajoutez huit microlitres du mélange maître de résidus DA préparé à chaque puits d’ADN réparé. Ensuite, incubez la plaque dans un thermocycleur pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius pour nettoyer la réaction.

Utilisez le même processus décrit dans la section précédente à deux fois le volume et terminez par Resus en suspendant les billes dans 33,75 microlitres d’eau stérile. À ce stade, les échantillons peuvent ensuite être stockés à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine. Pour continuer, préparez un mélange maître de ligature pour 15 microlitres par réaction.

Ajoutez 15 microlitres du mélange maître de ligature dans chaque puits contenant l’ADN de la queue D. Ensuite, ajoutez 1,25 microlitre des 25 micromolaires appropriés. Adaptateur à code-barres flexible suivant.

Pour chacun, eh bien, chaque échantillon devrait recevoir un adaptateur de code-barres distinct. Une fois les adaptateurs chargés, incubez la plaque pendant 15 minutes à 20 degrés Celsius. Maintenant, à l’aide de 50 microlitres de billes, effectuez un nettoyage de ligature post-adaptateur et remettez l’échantillon en suspension dans de l’eau stérile à 50 microlitres.

Ensuite, faites le processus de nettoyage une deuxième fois en terminant avec 23 microlitres d’eau. À ce stade, les échantillons peuvent ensuite être stockés à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine. L’étape suivante consiste à amplifier chaque échantillon, ce qui est détaillé dans le protocole texte sur la fonte des glaces, les bloqueurs d’oligonucléotides universels et indices, la bibliothèque facile CCAP et les composants de capture de génération agile, qui comprennent le tampon d’hybridation con TNA deux X et le composant d’hybridation.

R.Préparez maintenant un pool millimolaire d’oligonucléotides indexeurs correspondant aux séquences d’adaptateur à code-barres spécifiques utilisées dans la préparation de la banque. Combinez un microlitre de chaque bloqueur et vortex-les ensemble pendant 10 secondes Dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, préparez le mélange de capture composé de cinq microlitres de conte A à raison d’un milligramme par millilitre, deux microlitres de bloqueur universel et deux microlitres de la piscine de bloqueur. Regroupez 24 bibliothèques de codes-barres en une seule réaction.

Ajoutez un total de un à trois microgrammes de bibliothèque de séquences de codes-barres regroupés au mélange de capture. Percez 15 à 20 trous dans le capuchon à l’aide d’une aiguille de calibre 20 ou moins, passez l’aspirateur dans un concentrateur d’ADN sous vide à 60 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit complètement sec. Ensuite, réhydratez le mélange dans le tampon d’hybridation et le composant d’hybridation A.Couvrez les trous du capuchon avec du ruban adhésif et agitez l’échantillon pendant 10 secondes.

Ensuite, centrifugez le mélange à vitesse maximale pendant 10 secondes. Maintenant, incubez brièvement le mélange à 95 degrés Celsius pour dénaturer l’ADN. Poursuivez avec 10 secondes de centrifugation à vitesse maximale à température ambiante dans un tube de bandelette PCR de 0,2 millilitre, mélangez 2,25 microlitres de sondes de capture de bibliothèque facile ccap pour obtenir le même volume d’eau stérile sans nucléases.

Ensuite, lors de la réaction de centrifugation, mélangez le tube et faites couler doucement le volume total à travers une pointe de pipette 10 fois. Maintenant, incubez le tube de 0,2 millilitre dans un thermocycleur à 47 degrés Celsius pendant 48 à 96 heures. Maintenez la température du couvercle du thermocycleur à 57 degrés Celsius pour éviter l’évaporation et stabiliser la température de réaction des jours plus tard.

Suivez les étapes de lavage et de récupération de l’ADN capturé. Utilisez ensuite un protocole Nimble gen modifié de Roche pour amplifier la finition de l’ADN capturé en quantifiant l’ADN capturé amplifié à l’aide du test haute sensibilité du qubit. Un pool de 24 banques de séquences à code-barres contenant 12 paires normales de tumeurs a été capturé à l’aide de sondes de 279 gènes cancéreux et séquencé en deux par 75.

lectures de paires de bases sur une seule voie d’une tumeur à cellules d’écoulement HighSeq 2000 et les banques normales ont été regroupées dans un rapport de deux pour un. L’image IGV montre la spécificité de la couverture de séquence aux exons d’EGFR dans un cancer du poumon, les barres grises représentent des lectures de séquence uniques. La mutation hétérozygote T deux G à droite était présente dans 24 % des lectures, indiquant qu’il s’agit d’une substitution somatique d’acides aminés L 8 58 R.

Aucune des lectures du tissu pulmonaire normal n’a montré cette mutation TTA G, certains indels dans une tumeur cancéreuse colorectale, une paire normale ont montré une insertion somatique par décalage de cadre dans un PC ou une délétion somatique par décalage de cadre de sept paires de bases. Dans TP 53, des altérations du nombre de copies ont également été observées entre les paires normales de tumeurs. Chaque point de données représente un seul exon de 279 gènes cibles.

Les gains et les pertes de nombre de copies sont déduits des augmentations et des diminutions de la séquence tumorale Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures et demie pour la préparation de la bibliothèque de partage et en 48 à 96 heures pour l’hybridation de capture si elle est effectuée correctement. Bien qu’il soit extrêmement important d’effectuer ce test, il est extrêmement important de faire attention aux contaminants lors de la préparation de la banque, car cela peut perturber l’analyse des données. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage de Sanger et l’analyse de fragments peuvent être effectuées afin de répondre à des questions telles que : comment puis-je valider une altération douteuse ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des banques d’ADN à code-barres et de la capture Exxon sur ces bibliothèques regroupées.