Name: Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Apprenez à détecter les mutations somatiques dans les gènes associés au cancer par capture d'exons et séquençage massivement parallèle. Cette méthode utilise des bibliothèques d'ADN à codes-barres pour analyser 279 oncogènes.

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Nous remercions le Dr Agnès Viale et le MSKCC génomique Laboratoire central d&#39;assistance technique. Ce protocole a été élaboré avec le soutien du Centre de Cancérologie Geoffrey Beene et la Fondation fermier de famille.

Une. Préparation des réactifs et de l&#39;ADN Remarque: Ce protocole décrit le traitement simultané et l&#39;analyse des 24 échantillons (par exemple 12 paires tumeur / normal), mais peut être adaptée pour des lots plus petits et plus grands. échantillons d&#39;ADN peuvent provenir de FFPE ou tissu frais congelé, les échantillons cytologiques, ou de sang. Typiquement, à la fois la tumeur et le tissu normal du même patient sont profilées conjointement de manière à distinguer les mutations somatiques de polymorphismes héritées. Le protocole commence immédiatement après l&#39;extraction d&#39;ADN. <ol><li> Aliquote de 50 à 250 ng (250 ng recommandé) de l&#39;ADN extrait par échantillon, on le dilue dans 1 x Tris-EDTA (pH 8,0) tampon d&#39;un volume final de 50 ul, dans des tubes à fond rond Covaris distinctes. </li><li> Cisailler l&#39;ADN sur l&#39;instrument Covaris E220 dans les réglages de cisaillement suivants: 360 sec à 10 facteur de marche, 175 PIP, et 200 cycles par rafale. </li><li> Décongeler AMPure Perles XP (__gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ tableau 2) à température ambiante. Décongeler tous buffre et enzymes sur la glace avant l&#39;étape appropriée. </li></ol> 2. Module de réparation de fin - Préparation bibliothèque <ol><li> Préparez le mélange maître de réparation de fin dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 10 pi de 10x NEBNext Fin réparation Reaction Buffer (tableau 2), 5 pi NEBNext Fin enzyme de réparation Mix (tableau 2), 35 pl nucléase stérile libre H 2 O. </li><li> Aliquoter les 50 ul de chaque ADN cisaillé dans des puits séparés d&#39;une plaque à 96 puits. Ajouter 50 pi de mélange maître de réparation de fin prêts à chaque réaction. Incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 20 ° C. </li></ol> 3. Réparation Poster Fin Clean-up <ol><li> Ajouter 2x volume (200 pi) de AMPure Perles XP (__gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ tableau 2) pour chaque échantillon et la pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x en utilisant une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Placez sur le support magnétique (tableau 2 </strong&gt;) à température ambiante pendant 15 min jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon apparaît clairement. </li><li> Retirez délicatement et jeter clairement la prise de surnageant soin de ne pas déranger les perles. Certains liquide peut rester dans les puits. </li><li> Avec des tubes sur le support, ajouter doucement 200 ul de fraîchement préparée de 80% d&#39;éthanol pour chaque échantillon et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 sec. Avec précaution, éliminer l&#39;éthanol par pipette. </li><li> Répétez l&#39;étape 5, pour un total de deux lavages à l&#39;éthanol. S&#39;assurer que tous éthanol a été éliminée. Retirer du support magnétique et laisser sécher à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Reprendre billes séchées 44,5 M ul stérile 2 O. Doucement, toute pipette volume vers le haut et vers le bas 10x bien mélanger. S&#39;assurer que les perles ne sont plus fixés sur le côté du puits. </li><li> Incuber billes en suspension à température ambiante pendant 2 min. Placez sur support magnétique pendant 5 min jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon apparaît clairement. </li><li> Transférer doucement 42 pi de surnageant clair contenant l&#39;échantillon à un nouveau puits. La procédure peut être arrêtée sans danger à ce step et les échantillons conservés à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 7 jours. Pour redémarrer, dégeler les échantillons congelés sur glace avant de poursuivre. </li></ol> 4. Préparation Bibliothèque - Module dA-Tailing <ol><li> Préparer le mélange maître dA-Tailing dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 5 pi de 10x NEBNext réaction dA-Tailing tampon (tableau 2), 3 pi (3 &#39;5&#39; exo-) fragment de Klenow (tableau 2 ). </li><li> Ajouter 8 pi du prêt master mix dA-Tailing à chaque puits contenant 42 ul d&#39;ADN de fin réparé. Incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Effectuer un poste dA-Tailing nettoyage: Répétez les étapes 3.1 à 3.8 en utilisant 2x volume (100 pi) de perles, mais remettre en suspension dans H 2 O stérile à un volume final de 33,75 pi. La procédure peut être arrêté en toute sécurité à cette étape et les échantillons conservés à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 7 jours. Pour redémarrer, dégeler les échantillons congelés sur glace avant de poursuivre. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Préparation Bibliothèque - Adapter Module ligature <ol><li> Préparer le mélange maître de ligature dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 10 pi de 5x NEBNext ligature rapide Reaction Buffer (New England Biolabs, tableau 2), 5 pi rapide ADN ligase de T4 (tableau 2). </li><li> Ajouter 15 pi de mélange maître de ligature dans chaque puits contenant l&#39;ADN dA à queue. </li><li> Ajouter 1,25 ul de 25 uM NEXTflex l&#39;adaptateur approprié à code-barres (tableau 2) à chaque puits. Chaque échantillon doit recevoir un code-barres adaptateur séparé. Incuber dans un thermocycleur pendant 15 min à 20 ° C. </li><li> Effectuer un poste adaptateur ligature nettoyage: Répétez les étapes 3.1 au 3.8 en utilisant un volume 1x (50 pi) de perles, mais remettre en suspension dans H 2 O stérile à un volume final de 50 ul. </li><li> Répétez les étapes 3.1 à 3.8 pour un second volume de 1x (50 pi) de nettoyage, mais remettre en suspension dans H 2 O stérile à unvolume final de 23 ul. La procédure peut être arrêté en toute sécurité à cette étape et les échantillons conservés à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 7 jours. Pour redémarrer, dégeler les échantillons congelés sur glace avant de poursuivre. </li></ol> 6. Amplification bibliothèque <ol><li> Préparer le mélange maître KAPA HiFi dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 25 pl 2x KAPA HiFi HS RM (tableau 2), 1 pl de chacune des 100 uM Primer 1 et Primer 2 (Tableau 3). </li><li> Ajouter 27 pi de mélange maître à chaque puits contenant le produit de ligature. Régler la pipette à 50 pi et délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 10x. </li><li> Placez dans le thermocycleur pour les cycles de PCR suivantes: dénaturation initiale de 45 sec à 98 ° C, 10 cycles de 15 sec à 98 ° C, 30 secondes à 60 ° C, 30 secondes à 72 ° C, et l&#39;extension finale de 1 min à 72 ° C. </li><li> Effectuez une post-amplification de nettoyage: Répétez les étapes 3.1 à 3.8 à l&#39;aide1x volume (50 ul) de AMPure XP Beads, et remettre en suspension dans de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à un volume final de 30 ul. </li><li> Quantifier la concentration de chaque bibliothèque à l&#39;aide qubit Large gamme de dosage (Life Technologies, tableau 2) selon les instructions du fabricant. </li></ol> 7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Bibliothèque hybridation, lavage, et Amplification <ol><li> Dégel universelles et l&#39;indice de blocage des oligonucléotides (tableau 3), SeqCap EZ bibliothèque, et NimbleGen composants de capture (ADN COT, tampons d&#39;hybridation 2x, et composant hybridation A, tableau 2) sur la glace. Tous les inhibiteurs d&#39;oligonucléotides sont stockés dans les stocks de travail de 1 mM. Notre SeqCap EZ Library est une piscine sur mesure de sondes de capture englobant tous les exons codant pour des protéines de 279 gènes associés au cancer, mais d&#39;autres dessins personnalisés et catalogue peuvent être utilisés. </li><li> Préparer une piscine de 1 mM de bloqueurs indice d&#39;oligonucléotides correspondant à l&#39;annonce code-barres spécifiqueséquences Aptor utilisés dans la préparation bibliothèque. Mélanger 1 pi de chaque bloqueur, et vortex. </li><li> Dans un nouveau tube de 1,5 ml microtubes stériles, ajouter 5 ul d&#39;ADN COT 1mg/ml, 2 pi de 1 mM bloquant universel et 2 pi de la piscine 1 mM des inhibiteurs indice d&#39;oligonucléotides. </li><li> Piscine 24 bibliothèques à code-barres en une seule réaction. Ajouter un total de 1 à 3 ug de mise en commun, une bibliothèque de séquence à code à barres (préparé ci-dessus) au mélange de capture. Pour 24 échantillons, 100 ng par échantillon est recommandé. Lorsque la mise en commun des tumeurs et des échantillons normaux appariés, nous avons recommandé d&#39;ajouter plus de bibliothèque de tumeurs (par exemple de 100 ng par la tumeur et 50 ng par normale) de sorte qu&#39;ils sont séquencées à une plus grande profondeur de la couverture. </li><li> Fermez le bouchon du tube et faire 15-20 trous dans le haut de la capsule avec un 18-20 G ou plus petite aiguille. Speed ​​Vac les échantillons bibliothèque / COT ADN / à oligos amplifiés dans le vide concentrateur d&#39;ADN sur feu vif (60 ° C). </li><li> Une fois complètement sec vers le bas, réhydrater avec 7,5 ul de 2x hybridationtampon sation et 3 pi de composant hybridation A. Le tube doit maintenant contenir les éléments suivants: 5 pg d&#39;ADN COT, pg la variable de bibliothèque de l&#39;échantillon amplifié, 1000 pmol d&#39;Universal et Index oligos, tampon 7,5 pi 2x d&#39;hybridation, 3 pi hybridation composant A dans un volume total de 10,5 pi. </li><li> Couvrez les trous dans le couvercle avec un petit morceau de ruban adhésif de laboratoire. Vortex l&#39;échantillon pendant 10 secondes et centrifuger à la vitesse maximale pendant 10 s. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 95 ° C pendant 10 min pour dénaturer l&#39;ADN, suivi par une centrifugation à vitesse maximale pendant 10 s à température ambiante. </li><li> Dans un nouveau tube de PCR 0,2 ml de bande, préparer 2,25 pi aliquote de SeqCap EZ sondes de capture Bibliothèque et 2,25 pi de stérile nucléase libre H 2 O et ajouter le contenu de l&#39;étape 7.7. Pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. </li><li> Incuber dans un cycleur thermique à 47 ° C pendant 48-96 h. Régler et maintenir la température du couvercle de l&#39;appareil à cycles thermiques à 57 ° C. </li><li> Folmarches basses dans le chapitre 6 du Guide de la v3.0 de la NimbleGen SeqCap EX Bibliothèque SR utilisateur (tableau 2) pour le lavage et la récupération de l&#39;ADN capturé. </li><li> Suit les étapes du chapitre 7 du protocole Roche NimbleGen pour l&#39;amplification de l&#39;ADN capturé avec les modifications suivantes: <ul type="disc"><li> Utilisez 2x KAPA HiFi polymérase (tableau 2) au lieu de Phusion haute fidélité PCR Master Mix </li><li> Utilisez 100 uM Primer 1 et 2 Primer énumérés dans le tableau 3. </li><li> Exécuter les conditions de PCR suivantes: dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 sec, 11 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 30 secondes, et extension finale à 72 ° C pendant 5 min . Maintenir à 4 ° C. </li></ul></li><li> Quantifier la concentration de l&#39;ADN amplifié à l&#39;aide capturé qubit haute sensibilité Assay (tableau 2) selon les instructions du fabricant. </li><li> Analyser la qualité de l&#39;ADN capturée à l&#39;aide Agilent BioAnalyseur puce ADN HS (tableau 2) selon les instructions du fabricant. <ul type="disc"><li> Le rendement de la PCR doit être d&#39;au moins 100 ng (gamme 100-1000 ng). </li><li> La longueur des fragments de moyenne doit être comprise entre 150 à 400 paires de bases. </li></ul></li></ol> 8. Illumina Salut-Seq séquençage <ol><li> Diluer l&#39;ADN capturé amplifié à 14 heures, et de charger l&#39;échantillon sur une seule voie d&#39;une cellule de débit Illumina HiSeq 2000. Séquence appariée de gamme paire 75 but lit selon les instructions du fabricant. Dans notre expérience, une voie est suffisante pour produire une couverture de séquence unique de 500 700x par exemple sur 279 gènes pour une piscine de 24 échantillons. </li><li> Logiciel Illumina (Real Time Analysis) permet de convertir des images haute résolution à des intensités de cluster de fonder des appels et des scores de qualité. Utilisation CASAVA pour démultiplexer les données en fonction de l&#39;identité de code à barres et générer des fichiers de FASTQ individuels pour chaque échantillon. </li></ol> 9. Données Anallyse <ol><li> Garniture séquences d&#39;adaptation à partir de l&#39;extrémité 3 &#39;de la séquence se lit en utilisant des fichiers FASTQ Cutadapt ( <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). La longueur minimale de chevauchement (-O) est égal à 3 avec un taux d&#39;erreur (-e), de 1%. La longueur de la base minimale de conservation des apparié lit après la coupe est de 25. </li><li> Alignez séquence lit les hg19 du génome humain de référence en utilisant l&#39;outil de Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 12. Exécutez les étapes de post-traitement y compris le marquage double, le réalignement de séquence multiple local, et le score de qualité de base recalibrage en utilisant l&#39;analyse du génome Toolkit (GATK) en fonction de leurs meilleures pratiques standard ( <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = meilleures pratiques</a> ) 13. Quand de multiples échantillons de profilage à partir du même patient (par exemple, identifié tumorales et normales), le réalignement de séquences multiples local devrait être perforMED conjointement. La sortie de ces étapes de post-traitement est un fichier de BAM pour chaque échantillon, qui contient toutes les séquences, de qualité, et des informations d&#39;alignement et peut être chargé directement dans la génomique intégrative Viewer (IGV) pour la visualisation de lit et des variants de séquence 14. </li><li> Calculer la séquence des mesures de performance en utilisant des outils Picard ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Mesures d&#39;information comprennent le taux alignement, la distribution de la taille des fragments, GC-contenu biais de couverture associés, sur cible spécificité de capture, la PCR en double taux, la complexité bibliothèque, et signifier la couverture cible. Des valeurs représentatives sont affichées dans la figure 1. Les fréquences des allèles sur les sites de polymorphisme communs calculés en utilisant DepthOfCoverage de GATK sont utilisés pour surveiller la contamination de l&#39;ADN non lié et de veiller à ce que les échantillons appariés provenaient des mêmes patients. Les analyses informatiques suivants dépendent de la présence de appariéséchantillons tumoraux et normaux pour la détection d&#39;altérations génétiques somatiques. Tumeurs inégalés peuvent également être analysées à l&#39;aide d&#39;un échantillon de contrôle normal séparé, mais la plupart des mutations somatiques ne peuvent être facilement distingués des variants de séquence héritées. </li><li> Appel variants nucléotidiques simples somatiques (SNVs) pour chaque paire de la tumeur à la normale à l&#39;aide d&#39;un appelant de la mutation somatique, comme muTect 15, SomaticSniper 16, 17 ou Strelka. Nous utilisons muTect avec des critères de filtrage modifiés, ce qui permet pour les variantes à faible (non nulle), chiffres d&#39;allèles dans l&#39;échantillon normal, tant que la fréquence de l&#39;allèle est au moins 5 fois plus grande dans la tumeur. Des variantes appelées récurrente dans un panneau d&#39;ADN normaux sont supprimés comme des artefacts systématiques susceptibles de séquençage ou l&#39;alignement. Chaque SNV passant filtres est ensuite examiné avec soin en utilisant IGV. </li><li> Appel indels somatiques pour chaque paire de la tumeur à la normale à l&#39;aide d&#39;algorithmes tels que SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, 19 ou SOAPindel </sup&gt;. Nous utilisons SomaticIndelDetector selon les critères suivants: au moins 10% la fréquence des allèles d&#39;au moins 3 supportant lit, ou au moins 2% de la fréquence des allèles d&#39;au moins 10 lectures de support. Nous laissons pour indels ayant un faible (non nulle), chiffres d&#39;allèles dans l&#39;échantillon normal, tant que la fréquence de l&#39;allèle est au moins 5 fois plus grande dans la tumeur. Indels appelés dans un groupe d&#39;ADN normaux sont supprimés, comme ci-dessus. Chaque indel passant filtres est ensuite examiné avec soin en utilisant IGV. </li><li> Extrapoler copie statut de nombre de couverture de la séquence à exons cibles. Pour chaque échantillon, procéder à une normalisation Loess de la couverture de séquence moyenne de tous les exons cibles, régression sur le pourcentage de GC. Ajustez les valeurs de couverture non normalisées en soustrayant l&#39;ajustement Loess et ajouter la couverture médiane échantillon entier. Calculer le ratio de la couverture de la séquence normalisée pour tous les exons cibles pour les paires de tumeurs à la normale. En l&#39;absence d&#39;un échantillon normal identifié et / ou pour diminuer le bruit, d&#39;autre diploïde au genre identifiétémoins normaux dépourvus de variants du nombre de copies de la lignée germinale peuvent être utilisés. Déterminer somatiques gains et pertes de nombre de copies en fonction des augmentations ou diminutions du taux de couverture. </li><li> Appelez réarrangements somatiques impliquant les gènes du cancer où au moins un point d&#39;arrêt génomique tombe à l&#39;intérieur ou à proximité d&#39;un intervalle ciblée du génome. Algorithmes suggérés incluent GASV 20, breakdancer 21, CREST 22, et Dranger 23. Inversions intrachromosomiques, des suppressions et duplications en tandem peuvent être distingués en fonction de la position relative et l&#39;orientation de soutenir lit en paires discordantes. Tous les réarrangements candidats devraient être examinées manuellement à l&#39;aide IGV. Nous vous recommandons validation expérimentale par séquençage PCR et Sanger à travers les points d&#39;arrêt de réarrangement putatifs. </li></ol>

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<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
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</ol>

Dr Berger a reçu des honoraires de conseil et financement de la recherche de la Fondation de médecine, une société de diagnostic de cancer.

Notre essai IMPACT produit un taux élevé d&#39;alignement, le taux sur la cible haut, couverture cible haute et haute sensibilité pour la détection des mutations, indels, et du nombre de copies des modifications. Nous avons démontré la capacité de notre essai IMPACT à l&#39;ADN de séquence à la fois frais congelé et archivé échantillons FFPE de faible apport d&#39;ADN. En effectuant le séquençage de l&#39;exon ciblé de gènes associés au cancer principaux, on peut obtenir une couverture de séquence très profond pour les ...

L&#39;identification des événements génétiques tumorales «driver» dans oncogènes clés et des gènes suppresseurs de tumeurs joue un rôle essentiel dans le diagnostic et le traitement de nombreux cancers 1. Efforts de recherche à grande échelle en utilisant le séquençage massivement parallèle &quot;nouvelle génération&quot; ont permis l&#39;identification de plusieurs de ces gènes associés au cancer au cours des dernières années 2. Cependant, ces plates-formes de séquençage nécessitent généralement de grandes quantités de l&#39;ADN isolé à partir de tissus congelés frais, ce qui présente donc une limitation importante dans l&#39;analyse et la caractérisation des mutations de l&#39;ADN à partir de tissus conservés, tels que la paraffine fixés au formol noyé (FFPE) des échantillons de tumeurs. Amélioration des efforts pour caractériser efficacement et de manière fiable l&#39;information génomique &quot;action&quot; d&#39;échantillons tumoraux FFPE permettront l&#39;analyse rétrospective d&#39;échantillons précédemment mis en réserve et encourager davantage les approches individualisées à la gestion du cancer. Traditionnellement, d moléculairelaboratoires iagnostic se sont appuyés sur fastidieuses, des méthodologies bas-débit telles que le séquençage Sanger et PCR en temps réel pour le profilage ADN mutation. Plus récemment, des méthodes plus-débit utilisant la PCR multiplex ou spectrométrie de masse génotypage ont été développées pour étudier des mutations somatiques récurrentes dans les gènes du cancer clés 3-5. Ces approches sont cependant limitées par le fait que seuls les &quot;points chauds&quot; mutations prédésignés sont dosés, ce qui les rend impropres à la détection de mutations d&#39;inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs. Séquençage massivement parallèle offre plusieurs avantages par rapport à ces stratégies, y compris la possibilité d&#39;interroger les exons entiers pour les mutations à la fois communs et rares, la capacité de révéler d&#39;autres catégories d&#39;altérations génomiques tels que les gains et les pertes du nombre de copies, et une plus grande sensibilité de détection dans des échantillons hétérogènes 6, 7 . Séquençage du génome entier représente l&#39;approche la plus complète pour la découverte de la mutation, si elle est relativement coûteux et encourt grandes exigences de calcul pour l&#39;analyse des données et le stockage. Pour les applications cliniques, où seule une petite fraction du génome peut être d&#39;intérêt clinique, deux innovations particulières dans la technologie de séquençage ont eu un effet transformateur. Tout d&#39;abord, à travers l&#39;exon capture à base d&#39;hybridation, on peut isoler l&#39;ADN correspondant à des gènes associés au cancer clés de mutation ciblée profilage 8,. Deuxièmement, grâce à la ligature des codes-barres moléculaires (par exemple des séquences d&#39;ADN 6-8 nucléotides de long), on peut regrouper des centaines d&#39;échantillons par séquençage terme et profiter pleinement de la capacité croissante des instruments massivement parallèles de séquençage 10. Lorsqu&#39;ils sont combinés, ces innovations permettent tumeurs être profilée pour un coût moindre et à un débit plus élevé, avec des exigences de calcul plus petits 11. En outre, par la redistribution de la couverture de séquence avec seulement les gènes les plus critiques pour l&#39;application particulière, on peut Achieve plus grande profondeur de séquençage pour la sensibilité de détection plus élevé pour les événements de basse fréquence de l&#39;allèle. Nous décrivons ici notre test IMPACT (Mutation profilage intégrée des objectifs du cancer à une action), qui utilise l&#39;exon capture sur un code à barres piscines de la bibliothèque de séquence par hybridation en utilisant personnalisés oligonucléotides pour capturer tous les exons codant pour des protéines et sélectionnez introns de 279 gènes associés au cancer clés (tableau 1 ). Cette stratégie permet l&#39;identification de mutations, indels, nombre de copies des modifications, et sélectionner réarrangements structuraux impliquant ces 279 gènes. Notre méthode est compatible avec l&#39;ADN isolé à partir de deux tissus congelés et FFPE frais ainsi que de fines aspire à aiguilles et d&#39;autres spécimens de cytologie.

<table><tbody><tr><td>NEBNext Module de réparation d’extrémité</td><td>New England Biolabs</td><td>E6050L</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>NEBNext dA-Tailing Module New</td><td>England Biolabs</td><td>E6053L</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>NEBNext Module de ligature rapide</td><td>New England Biolabs</td><td>E6056L</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Codes-barres NEXTflex PCR Free &ndash ; 24</td><td>Bioo Scientific</td><td>514103</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit d’amplification de bibliothèque HiFi</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2612</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>COT ADN humain, qualité fluorométrique</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 480 647 001</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>NimbleGen SeqCap EZ Kit d’hybridation et de lavage</td><td>Roche NimbleGen</td><td>05 634 261 001</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>SeqCap EZ Library Appâts</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Purification PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de dosage Qubit dsDNA Broad Range (BR)</td> Life <td>Technologies</td><td>Q32850</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de dosage haute sensibilité (HS) Qubit dsDNA</td> Life <td>Technologies</td><td>Q32851</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit HS Agilent DNA</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626, 4627</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bioanalyseur Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Support magnétique-96</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Illumina Hi-Seq 2000</td><td>Illumina</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par exon et le séquençage massivement parallèle

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Les efforts visant à détecter et enquêter sur des mutations oncogènes clés sont révélés précieux pour faciliter le traitement approprié pour les patients atteints de cancer. La mise en place de haut-débit, le séquençage massivement parallèle &quot;nouvelle génération&quot; a aidé la découverte de beaucoup de ces mutations. Pour améliorer l&#39;utilité clinique et translationnelle de cette technologie, les plates-formes doivent être à haut débit, le coût-efficace, et compatible avec de la paraffine fixés au formol (FFPE) intégré échantillons de tissus qui peuvent donner de petites quantités d&#39;ADN dégradé ou endommagé. Ici, nous décrivons la préparation de banques d&#39;ADN code-barres et multiplexés suivie d&#39;une hybridation de capture sur la base-des exons ciblés pour la détection de mutations associées au cancer dans les tumeurs congelées et FFPE fraîches par séquençage massivement parallèle. Cette méthode permet l&#39;identification de mutations de la séquence, le nombre de copies des modifications, et sélectionner réarrangements structuraux impliquant tous les gènes ciblés. Séquençage de l&#39;exon offres ciblées til bénéficie d&#39;un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, conférant ainsi une haute sensibilité pour détecter des mutations de basse fréquence.

Une piscine de 24 banques de séquences à code-barres (12 paires de tumeurs à la normale) a été capturée à l&#39;aide des sondes correspondant à tous les exons codant pour des protéines de 279 gènes du cancer et séquencé comme 2 x 75 pb lit sur une seule voie d&#39;une cellule d&#39;écoulement HiSeq 2000. Tumeur et les bibliothèques normales ont été rassemblées dans un rapport de 2:1. des mesures de performance de l&#39;échantillon pour un mélange d&#39;échantillons d&#39;ADN de tumeur congelés sont présentés sur <strong...

Nous décrivons la préparation de banques d&#39;ADN code-barres et ultérieure capture d&#39;exon base hybridation pour la détection de mutations clés associés au cancer dans des échantillons de tumeurs cliniques par séquençage massivement parallèle &quot;prochaine génération&quot;. Séquençage de l&#39;exon ciblée offre les avantages d&#39;un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, donnant ainsi une grande sensibilité pour la détection de mutations de basse fréquence.

Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les mutations somatiques dans les gènes associés au cancer des cellules du tissu tumoral en utilisant des bibliothèques d’ADN multiplexées à code-barres, suivies d’un séquençage massivement parallèle. Ceci est accompli en ligaturant d’abord des adaptateurs de séquençage à code-barres sur des fragments d’ADN isolés de tumeurs préservées. La deuxième étape de la procédure est l’hybridation en oligonucléotides biotinylés personnalisés, complémentaires à tous les exons d’enrobage protéique de 279 oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs.La troisième étape consiste à effectuer un séquençage massivement parallèle des pools de codes-barres à partir des bibliothèques capturées. La dernière étape consiste à rechercher dans les données de séquence des altérations associées au cancer pour les 279 gènes ciblés. Cette procédure peut révéler des mutations de séquence, de petites insertions, de petites délétions, des altérations du nombre de copies et des altérations structurelles sélectionnées.Ainsi, les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont qu’elle permet d’étudier des exons entiers pour les mutat

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Biology

Biologie

Ce manuscrit décrit les protocoles cliniques de deux panels de séquençage de nouvelle génération. Un panel interroge les tumeurs malignes hématologiques tandis que l’autre panel cible les gènes couramment mutés dans les tumeurs solides. La classification moléculaire des mutations motrices dans les tumeurs malignes humaines offre des informations pronostiques et prédictives précieuses.

Le séquençage de prochaine génération pour la détection des Actionable mutations dans les tumeurs solides et liquides

Un système intégré pour le séquençage ciblé de nouvelle génération d’échantillons d’oncologie est décrit. Ce système multiplateforme est optimisé pour les biopsies tumorales de faible qualité et de faible quantité, s’adapte à de faibles entrées d’ADN, comprend des contrôles multivariants bien caractérisés et dispose d’un nouvel appelant de variant qui est informé par des mesures quantitatives de contrôle de la qualité pré-analytiques.

Intégration de Wet and Processes Banc sec Optimise ciblés Séquençage de nouvelle génération de faible qualité et à faible quantité biopsies de tumeurs

Cet article décrit une technique de détection des mutations de basse fréquence dans ADNct, ER-suiv. Cette méthode se distingue par son utilisation unique de correction d’erreur bidirectionnelle, un fond spécial filtre et acquisition moléculaire efficace.

Détection des Mutations rares dans ADNct à l’aide de prochaine génération séquençage

Obtention de l’ADN génomique de haute qualité provenant de tissus de la tumeur est une première étape essentielle pour l’analyse des altérations génétiques à l’aide de séquençage de la génération suivant. Dans cet article, nous présentons une méthode simple et rapide pour enrichir les cellules tumorales et obtenir des ADN intact de toucher les échantillons de cytologie mentions légales.

Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

Ici, nous présentons un protocole pour détecter des mutations somatiques de tumeur dans l'ADN circulant présent dans les fluides biologiques patients (biofluides). Notre méthode numérique de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette (dPCR) permet de quantifier la fréquence allélique de mutation de tumeur (MAF), facilitant un complément mini-invasif au diagnostic et à la surveillance temporelle de la réponse de tumeur.

Détection et surveillance de l'ADN circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients

Cet article décrit une méthode pour identifier des altérations clonales et subclonales parmi différents spécimens d'un patient donné. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur un type spécifique de tumeur, l'approche est largement applicable à d'autres tumeurs pleines.

Analyse comparative des lésions par une approche de séquençage ciblée

Cet article détaille l'utilisation d'un kit de préparation de bibliothèque de chaîne de polymérase de multiplex ancré de chaîne suivi du séquençage de prochaine génération pour évaluer des fusions de gène oncogènes dans les échantillons solides cliniques de tumeur. Les étapes de l'analyse des bancs humides et des données sont décrites.

Détection de fusion génique oncogène utilisant la réaction ancrée de chaîne de polymérase de multiplex suivie du séquençage de prochaine génération

Ici, nous présentons un protocole pour tester l’efficacité des thérapies ciblées sélectionnées basées sur la composition génomique d’une tumeur. Le protocole décrit l’identification et la validation des réarrangements structurels d’ADN, l’engraftment des tumeurs des patients dans les souris et les réponses d’essai aux drogues correspondantes.

Test de thérapies ciblées dans le cancer à l’aide de l’analyse structurale de l’altération de l’ADN et des Xénogreffes dérivées du patient

L’augmentation du nombre de biomarqueurs moléculaires à tester pour la prise en charge du cancer du poumon non à petites cellules non épidermoïde (NS-NSCLC) a entraîné la mise au point de méthodes de détection moléculaire rapides et fiables. Nous décrivons un flux de travail pour l’évaluation de l’altération génomique chez les patients atteints de NS-CPNPC à l’aide d’une approche de séquençage ultra-rapide de nouvelle génération (NGS).

Séquençage ultra-rapide de nouvelle génération basé sur l’amplicon dans le cancer du poumon non épidermoïde non à petites cellules

Ce protocole fournit une méthode reproductible pour visualiser l’amplification génique dans des échantillons de tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE).

Détection robuste de l’amplification génique dans des échantillons fixés au formol et inclus dans de la paraffine par hybridation in situ en fluorescence

Ce protocole décrit un flux de travail de séquençage de nouvelle génération automatisé et accrédité par ISO15189 pour détecter les altérations génomiques ciblables dans les tissus contenant de la paraffine fixée au formol pour le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC).

Détection d’altérations ciblables dans le cancer du poumon non à petites cellules à l’aide du séquençage de nouvelle génération

Apprenez à détecter les mutations somatiques dans les gènes associés au cancer par capture d'exons et séquençage massivement parallèle. Cette méthode utilise des bibliothèques d'ADN à codes-barres pour analyser 279 oncogènes.

Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle

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