Une méthode rapide et efficace pour évaluer la pathogénicité d’Ustilago maydis sur les lignées de maïs et de téosinte

L’objectif global de cette procédure est d’inoculer par injection à l’aiguille une culture de cellules de suspension de Lago Maus USTA et d’effectuer un dépistage de la réaction de résistance à la maladie des lignes d’intersection de la tête de labyrinthe et de la téosinte de labyrinthe. Pour ce faire, il faut d’abord sélectionner des lignées végétales pour l’inoculation et le dépistage. Ensuite, les graines pour des expériences expérimentales et d’inoculation par injection d’aiguille de contrôle sont plantées.

10 jours plus tard, la suspension cellulaire fabriquée en U est injectée dans la tige de chaque plante. Enfin, les réactions de résistance des plantes expérimentales et des plantes témoins sont comparées. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une inoculation réussie par injection à l’aiguille en visualisant le phénotype de la plante inoculée avec vous. Mais.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle délivre l’agent pathogène directement entre les feuilles. Cela élimine le problème de pénétration des agents pathogènes. Pour commencer, on a utilisé pour cette étude des lignées de plantes expérimentales et d’inoculation par injection d’aiguilles de contrôle, deux lignes de labyrinthe, cinq lignes de téosinte et 40 lignes transversales de téosinte de labyrinthe présentant une résistance non caractérisée à U Mais.

Plantez quatre graines de chaque ligne de plante dans de petits plats en enfonçant les graines d’environ un demi-pouce dans le sol avec un doigt et en les recouvrant légèrement de terre. Placez ensuite les plantes dans une chambre de croissance et arrosez les graines jusqu’à ce qu’elles soient trempées, en veillant à ce qu’elles restent sous le sol après l’arrosage. Cultivez les plantes avec des environnements diurnes et nocturnes de 28 et 20 degrés Celsius, et des cycles de lumière et d’obscurité de 14 et 10 heures respectivement.

Et environ 500 micromolaires par mètre carré par seconde de rayonnement photosynthétiquement actif au sommet de la canopée. Maintenez l’humidité relative pendant le jour et la nuit à environ 70 % et 90 % respectivement, et gardez toutes les plantes dans la même chambre de croissance pour maintenir un environnement de croissance cohérent dans l’ensemble de l’expérience. Huit jours après la plantation des graines, utilisez une boucle stérile pour tracer des huis à partir d’un stock de glycérol congelé sur des plaques de gélose au dextrose de pomme de terre ou PDA, incubez à 30 degrés Celsius pendant deux jours et surveillez-le régulièrement pour vous assurer qu’il pousse bien sous une hotte à flux laminaire.

À l’aide d’un cure-dent stérile, sélectionnez une seule colonie pour chaque souche et placez-les dans des tubes de trois millilitres de bouillon. Incuber les cultures à 30 degrés Celsius et 200 tr/min pendant deux jours, en vérifiant périodiquement la croissance. Ensuite, mesurez la DO 600 des cultures pour vous assurer qu’elles ont été cultivées à une DO de 1,0.

À l’aide d’eau, amener les cultures à une concentration finale de 1 million de cellules par millilitre dans un volume final de 30 millilitres. Cette concentration de suspension cellulaire pathogène entraîne systématiquement une bonne infection des plantes. Ensuite, avant l’inoculation, mélangez des volumes égaux des deux souches que vous avez créées.

Avant de remplir une seringue de trois millilitres avec la suspension cellulaire, remplissez la seringue de contrôle avec de l’eau à injecter avec un minimum de dommages à la plante. Le tissu fixe une aiguille hypodermique de 457 millimètres sur 1,3 centimètre à l’extrémité de chaque seringue. Retirez les plantes de la chambre de croissance et injectez-les à un angle de 90 degrés juste au-dessus de la ligne du sol.

Insérez soigneusement l’aiguille de l’U maus dans la tige d’une plante expérimentale jusqu’à ce qu’elle se trouve au milieu de la tige. Injectez environ 100 microlitres de suspension cellulaire. Il poussera à travers la tige et sera visible lorsqu’il se déplacera dans le tourbillon de la plante.

Continuez à injecter des plantes expérimentales supplémentaires jusqu’à ce que les seringues soient vides. Ensuite, remplissez-le d’eau pour nettoyer l’aiguille de tout tissu végétal et remplissez à nouveau la seringue jusqu’à ce que toutes les plantes soient injectées. Utilisez la seringue à eau pour injecter les plantes témoins de la même manière.

Lorsque les injections sont terminées. Remettez les plantes dans la chambre de culture quotidiennement. N’arrosez que le sol et vérifiez le développement d’agents pathogènes et les réactions de résistance des plantes.

À l’aide d’une cote de réaction de résistance de un à cinq, échelonnez, notez et enregistrez les réactions de résistance pour chaque plante 7, 10, 14 et 21 jours après l’inoculation ou l’IAP. Les valeurs numériques de l’échelle d’évaluation augmentent avec la gravité de la maladie. Par exemple, une réaction de résistance A1C A ou deux indique une résistance.

Une réaction de résistance trois, quatre ou cinq indique la susceptibilité. Comparez les réactions de résistance des plantes expérimentales et des plantes témoins et sélectionnez des plantes expérimentales avec un indice de réaction de résistance A1C un, a ou deux. Ces plantes sont considérées comme résistantes au matis.

Dans cette expérience, la majorité des plantes inoculées d’humus étaient sensibles à l’infection. Les plantes ont montré un développement sévère de la maladie, comme en témoigne la formation de la tige et de la galle basale avec des spores de télio noires. Plusieurs plantes étaient mortes après l’inoculation en raison de la gravité de la maladie.

En revanche, les plantes témoins étaient très propres et n’ont montré aucun développement d’agents pathogènes sur aucune partie de l’usine, ce qui indique que le développement d’agents pathogènes sur les plantes expérimentales était dû à l’inoculation par injection à l’aiguille avec U Mais, trois lignées d’agression croisées de Teosinte de Mais résistantes à U Mais ont été identifiées, et une inoculation réussie a été vérifiée par une sclérose mineure. cyan dans la production, ou formation de galles foliaires mineures. Cette technique peut être réalisée de manière très efficace avec une reproductibilité. Cela aide à l’inoculation et au phénotypage d’un grand nombre de plantes.