Name: Nanomechanics des interactions médicaments-cibles et la détection de la résistance aux antibactériens (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Découvrez la nanomécanique des interactions médicaments-cibles pour quantifier la résistance antibactérienne à l'aide de capteurs à levier. Cette méthode innovante facilite le développement de nouveaux agents antibactériens.

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Joseph W. Ndieyira a été soutenue par le Conseil ingénierie et sciences physiques Research (EPRSC), Centre interdisciplinaire de recherche en nanotechnologie (IRC), la Royal Society (RS) et Biano conseil (BNC). Nous remercions, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment et Gabriel Aeppli pour des discussions utiles.

1. Préparation de Cantilevers <ol><li> Utilisation de Téflon pincettes immerger le numéro sélectionné de puces en porte à faux (chaque cantilever de mesure 500 um de long, 100 m de large et une épaisseur de 0,9 um) dans une solution piranha fraîchement préparée (à un rapport de 1:1 H 2 SO 4 et H 2 O 2) pendant 20 min . </li><li> Après environ 20 min enlever les copeaux en porte à faux à partir de la solution de piranha et les rincer à l&#39;eau déminéralisée et transférer immédiatement dans une solution piranha fraîchement préparé. Répétez l&#39;étape 1.1 ci-dessus si les puces contiennent des taches de saleté Sinon, passez à l&#39;étape suivante. </li><li> Après un nettoyage en profondeur dans l&#39;eau déminéralisée, rincez avec de l&#39;éthanol pur et sécher les copeaux de cantilever sur une plaque chauffante à 75 ° C pour éliminer toute trace d&#39;eau. Inspecter l&#39;aide d&#39;un microscope optique de confirmer leur propreté. </li><li> Transférer les puces en porte-à nettoyer une chambre d&#39;évaporation et de la pompe vers le bas, de ciblage pour atteindre un videpression de 10 -7 mbar. </li><li> Une fois que la pression de vide souhaitée est atteinte, le manteau d&#39;un côté de chaque réseau en porte à faux avec un titane de 2 nm au premier agit comme une couche d&#39;adhérence avant une couche supplémentaire de 20 nm d&#39;épaisseur d&#39;or. Pour confirmer leur épaisseur, utiliser le moniteur à cristaux de quartz placée directement au-dessus de la source cible. </li><li> Laisser puces de capteurs en porte à faux revêtus d&#39;or dans la chambre pendant 1-2 heures pour refroidir sous vide avant l&#39;ouverture. </li><li> Transférez les frites fraîchement évaporé à une cuve de stockage de vide rempli d&#39;argon pour éviter toute forme de contamination. </li></ol> 2. Cantilever Chip fonctionnalisation <ol><li> Tout d&#39;abord, disposer les tubes capillaires microscopiques sur une étape de fonctionnalisation 2 en fonction de la taille de pas en porte à faux de 250 um. </li><li> Puis injecter 2 mM de solutions éthanoliques thiol de molécules cibles à la surface, c&#39;est à dire mucopeptides bactériennes (D-Ala et D-Lac), et une «inert &#39;alcanethiol terminant en triéthylèneglycol (PEG) connu pour résister biomoléculaire adsorption. 16 Chacune des tubes capillaires doit contenir un assortiment de molécules de capture de surface déterminés aléatoirement pour éviter les biais de l&#39;utilisateur. </li><li> Incuber pendant 20 min Suivant les encorbellements dans le microcapillaires rempli de solutions thiol contenant des molécules de capture de surface. Veiller à ce que les solutions de molécules de capture de surface sont confinés sur chaque capteur cantilever individuelle pour éviter ou minimiser les contaminations croisées. Si ce procédé est utilisé correctement, il faut systématiquement modifier les cantilevers revêtus d&#39;or fraîchement préparés en capteurs chimiquement actifs formés en permettant SAM de cibles bactériennes mucopeptide à se former sur les surfaces peintes d&#39;or comme récepteurs. </li></ol> 3. Préparation de la solution <ol><li> Dissoudre 0,1 M sels mono-et di-phosphate de sodium de base dans de l&#39;eau ultra-pure (18,2 MQ · cm résistivité) et mélanger to obtenir une valeur de pH de 7,4. </li><li> Ajouter 0,002% du PS80 aux solutions tampon pour minimiser les effets d&#39;agrégation causées par des interactions non spécifiques de molécules médicamenteuses à la verrerie. </li><li> Diluer la drogue avec des solutions fraîchement tamponné à différentes concentrations désirées qui permettront le calcul de K d. </li><li> Filtrer les solutions médicamenteuses fraîchement préparés en utilisant des filtres de 0,2 um et soniquer pendant 5 min à température ambiante avant de purge à l&#39;argon. </li><li> Répétez la procédure avec la drogue dans le sérum tamponné à l&#39;aide de sérum entier. Doucement vortex pendant 15 minutes avec 5 minutes supplémentaires pour assurer une solubilité complète. </li></ol> 4. Détection de contrainte de surface <ol><li> Charger une puce de détecteur en porte-fonctionnalisé dans une chambre de la cellule d&#39;écoulement de liquide. </li><li> Aligner le point laser sur l&#39;extrémité libre de chaque capteur et de confirmer l&#39;alignement en chauffant jusqu&#39;à la chambre de liquide pour 1 ° C. Les huit or revêtues réseaux de capteurs en porte à faux doivent subir Comprehensivessive flexion en raison de l&#39;effet bimétallique causé par les différences dans les taux d&#39;expansion de silicium et d&#39;or à la baisse. </li><li> Après chauffage pendant environ 10 min, permettent aux cantilevers refroidir pendant encore 10 min. </li><li> Calcul de la variation de courbure au niveau des signaux de flexion maximales entre les capteurs individuels en porte à faux, et si l&#39;écart type relatif des signaux de flexion est ≤ 5% puis accepter l&#39;alignement comme souhaitable sinon répéter le processus. </li><li> Ensuite, mesurer les fréquences de résonance de l&#39;ensemble des huit leviers de calculer leurs constantes élastiques. Si la variation de la constante entre chaque sonde en porte à faux à l&#39;intérieur d&#39;une puce ressort est ≤ 1%, puis accepte la puce comme ayant des propriétés mécaniques compatibles sinon remplacer le capteur de puce en porte à faux. </li><li> Ensuite, utilisez un système fluidique (Modèle Genie Plus) via une vanne à six voies pour réaliser l&#39;échange de liquide à l&#39;intérieur de la cellule d&#39;écoulement tandis que l&#39;acquisition de données doit être réalisé en utilisant un LabView automatisé afinftware. </li><li> Pour surveiller le cantilever flexion des données, utiliser les protocoles de mesure suivantes: i) soit injecter la solution tampon ou du sérum sans médicament pour la mesure de contrôle durable pour 5-30 min à établir une base de référence; ii) injecter la solution de drogue pendant 30-60 min; iii) injecter du HCl 10 mM lavage pour 10 à 60 min à dissocier complexe médicamenteux lié; iv) enfin injecter une étape de lavage supplémentaire en utilisant une solution tampon pour un autre 5-30 min pour régénérer les peptides de surface et pour restaurer le signal de référence. Toujours s&#39;assurer que tous les signaux sont acquises sous débit constant de liquide de 30 à 180 pl / min et à température fixe de 25 ° C dans une enceinte à température contrôlée. </li><li> Les signaux de flexion absolues de tous les huit leviers doivent être surveillés en utilisant le temps de série multiplexée méthode du faisceau optique avec un seul détecteur sensible à la position. </li><li> Pour analyser les signaux de flexion de chaque concentration de médicament, les flexions différentielles qui en résultent sont convertis en un différentiel stress entre les faces supérieure et inférieure de la poutre à l&#39;aide de l&#39;équation de cailloux. </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêts est déclaré

Les moléculaires sous-tend la reconnaissance paradigme de larges pans de la biologie et de la médecine. En pharmacologie, par exemple, le but est d&#39;interférer avec une voie pathologique en ciblant un acteur clé d&#39;un processus biochimique comme transglycoslyation ou transpeptidation qui catalyse la réticulation des peptides de la paroi cellulaire bactérienne. La conception de médicaments se réduit donc à la définition d&#39;une molécule apte à cibler un site d&#39;amarrage bactérienne spécifique pour induire un ajustement parfait. Un exemple classique émuler le succès de cette approche est la vancomycine (Van), qui vise la paroi cellulaire peptidoglycane, une caractéristique structurelle conservé d&#39;une bactérie. Dans une bactérie Gram-positive naissante, la matrice se compose de peptides peptidoglycane de terminaison dans la séquence Lysine-D-alanine-D-alanine, attaché par l&#39;intermédiaire d&#39;un C55 lipidiques 8-10 de liaison appelé ici D-Ala. Ces peptides exposés sur les précurseurs du peptidoglycane sont fondamentales pour laprotection mécanique des cellules bactériennes contre les forces environnementales difficiles, et surtout, on ne trouve pas dans les cellules humaines, faisant d&#39;eux des cibles idéales pour les antibiotiques. Van lie spécifiquement à l&#39;extrémité C-terminale des peptides de la paroi cellulaire bactérienne formant une assez forte Van-peptide complexe comme le montre la figure 1. Cette interaction entre Van et les peptides blocs exposés les actions de transpeptidases et transglycosylases, qui catalysent la réticulation des parois cellulaires 1, ce qui les empêche de réticulation et donc affaiblit nanomechanically la cellule bactérienne conduisant à sa mort par rupture 1,6, 7. L&#39;émergence de résistants à la vancomycine Enterococcus (ERV) est un problème croissant de santé 11 et parce que la résistance bactérienne chez les entérocoques se pose en raison du changement subtil d&#39;un amide linkage à une liaison ester 8, ce changement structurel d&#39;une simplicité trompeuse à la surface de la bactérie supprime une seule liaison hydrogène à partir du site d&#39;accueil de Van avec modification ultérieure de la poche de liaison. Il est important de ce processus modifie le pentapeptide terminale alanine présent dans vancomycine sensibles Enterococcus (VSE) à un Lysine-D-alanine-D-lactate 10,12, ici appelé D-Lac, ce qui donne une réduction significative de Van-D-Lac affinité de liaison par trois ordres de grandeur rendu Van thérapeutique inefficace contre les infections à entérocoques 1, la croissance alarmante de bactéries résistantes aux antibiotiques est donc de conduire le développement d&#39;approches novatrices afin d&#39;accélérer et de restaurer l&#39;activité antibactérienne des agents antibactériens ou la découverte de médicaments plus puissants contre les bactéries multirésistantes les infections. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Nos expériences utilisant des cantilevers autoportants est inspiré par des systèmes tels que les cellules qui exploitent l&#39;énergie chimique en mouvement. La capacité des capteurs en porte à faux de traduire l&#39;énergie chimique en mouvement mécanique rend sondes uniques avec des avantages considérables pour surveiller les perturbations mécaniques de cibles de la paroi cellulaire bactérienne en temps réel. Les capteurs de porte à faux exigent des «balises» pas journaliste et biomolécules sont détectées rapidement dans une réaction en une seule étape. Ils peuvent dépister plusieurs médicaments en parallèle dans des environnements physiologiques tels que des solutions tamponnées et le sérum ensemble. En outre, la technologie de cantilever utilise en référencement situ pour des mesures différentielles leur permettant de détecter spécifiquement les interactions médicament-cible et, en vertu de leur fabrication par des voies de traitement de semi-conducteurs standards, ils se prêtent à la production de masse et parallélisation pour le criblage à haut débit de milliers de médicaments par heure. En particument ses multiples réseaux de capteurs en porte à faux sont des outils utiles pour l&#39;étude de la résistance aux antibiotiques à la vancomycine - parce que la résistance à la vancomycine est essentiellement un problème mécanique 1,6,7. Les réactions entre un modèle cible bactérienne de la paroi cellulaire et Van en solution peuvent être détectés en surveillant les variations de tension induites cliniquement significative de l&#39;interaction de liaison médicament-cibles. La contrainte générée par des réactions de surface qui se manifeste par un signal de flexion en porte à faux est analysée optiquement par des détecteurs d&#39;éclairage avec un faisceau laser. Par ailleurs, en adaptant le revêtement réceptif de molécules cibles de surface bactériennes sur le dessus du capteur cantilever, proches d&#39;un nombre illimité d&#39;analytes (Van), les interactions biochimiques spécifiques et la biomécanique du modèle bactérien matrice de la paroi cellulaire est suivie en temps réel. Mis à part le cas de la reconnaissance moléculaire, il ya plusieurs facteurs qui peuvent causer des capteurs en porte à faux à deflect, qui comprennent - des variations de température, de liaison non spécifiques ou des changements d&#39;indice de réfraction de la solution. Pour tenir compte des signaux non spécifiques, à des mesures différentielles situ sont effectuées lorsque la courbure de fois la mesure et consoles de référence sont surveillés en permanence pour analyser les interactions spécifiques. En outre, la sensibilité de détection des capteurs de porte à faux qui dépendent des chimies de surface et de la géométrie peut être améliorée en réglant la densité de surface p (où p est défini comme le rapport de la surface occupée par les molécules de capture pour la totalité de la surface supérieure de la porte à faux couvert par la population totale de molécules telles que déterminées par rayons X spectroscopie photoélectronique (XPS) 1. Voici ce protocole de détails comment la vancomycine ou tout autre antibiotique liaison à bactériennes mur analogues de précurseurs cellulaires (mucopeptides) à des concentrations cliniquement pertinentes dans une solution tamponnéesérum sanguin e peut être détectée à l&#39;aide de la technologie de cantilever sans étiquette. Surfaces d&#39;or frais sont utilisés parce monocouches auto-assemblées (SAM) ont tendance à former facilement des couches stables sur l&#39;or propre 13,14. SAM est typiquement constitué de molécules courtes avec une fraction thiol lié de manière covalente à la surface de l&#39;or, tandis que l&#39;unité de capture désiré sur l&#39;autre extrémité est autorisé à interagir librement avec les cibles de l&#39;analyte en solution. Thiols forment un système souple d&#39;autant plus que de nombreux composés thiols avec différents groupes terminaux chimiques sont disponibles dans le commerce ou sont facilement synthétisés en laboratoire. Cependant, des précautions doivent être prises pour s&#39;assurer que les molécules avec un groupement thiol doivent avoir des groupes terminaux appropriés, par exemple dans une protéine ou conjugaison peptide, le groupe amino doit faire face vers l&#39;intérieur pour la réaction avec le groupe carboxylique du groupement thiol attaché sur le surface pour se produire. Ici, les thiols sont directement conjugué par des composés mimétiques tripeptidiques d&#39;origine bactérienne lipide II de la bparoi cellulaire acterial objectifs synthétisé par la méthode en phase solide à l&#39;aide disponible dans le commerce préchargé Wang-D-Ala et résines Wang-D-Lac et le niveau protecteur Fmoc groupe chimie 15. Bien que cette description se concentre à la vancomycine, clairement il peut être étendu à d&#39;autres antibiotiques et bien d&#39;autres études sont invités par des chercheurs de différents domaines notamment en biochimie, la pharmacologie et la science des matériaux à adopter facilement ce protocole pour leurs propres expériences.

<table><tbody><tr><td>Scentris</td><td></td><td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td><td>Pas en production</td></tr><tr><td>Vanne</td><td></td> à six voies <td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td><td>Permet l’injection à concentrations multiples</td></tr><tr><td>EB Évaporateur</td><td></td><td>BOC Edwards Auto 500, UK</td><td>Le faisceau d’électrons est préférable en raison de la déformation des porte-à-faux causée par des problèmes de chauffage thermique</td></tr><tr><td>Récipient</td><td></td> de stockage <td>Agar Scientific, Royaume-Uni</td><td>Conserve la fraîcheur des films revêtus</td></tr><tr>d’or Capillaire <td></td><td>en verre</td><td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td><td>Pour la fonctionnalisation capillaire des réseaux de porte-à-faux</td></tr><tr><td>Modèle de pompe</td><td></td><td>Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td><td>Bon pour le débit contrôlé d’échantillons liquides dans les canaux microfluidiques</td></tr><tr><td>0,2-4,5 &mu ; m Filtres</td><td>1511940001</td><td>Merck Millipore</td><td>Pour le filtrage d’échantillons</td></tr><tr><td>Puces</td><td></td> en porte-à-faux <td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Phosphate</td></tr><tr><td>de sodium monobasique</td> hautement sensible <td>10049-21-5</td><td>Sigma-Aldrich, Royaume-Uni</td><td>Pour la fabrication de solutions tampons</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>7558-79-4</td><td>Sigma-Aldrich, Royaume-Uni</td><td>Pour la fabrication de solutions tampons</td></tr><tr><td>Polysorbate 80 (PS80) ou Tween 80</td><td>9005-65-6</td><td>Sigma-Aldrich, Royaume-Uni</td><td>Utilisé dans les solutions tampons pour éviter les interactions non spécifiques sur</td></tr><tr><td>l’eau</td><td></td> DI de la verrerie <td>Millipore Co., Billerica, MA, États-Unis</td><td>Utilisé pour la fabrication de solutions</td></tr><tr><td>Sérum entier</td><td>GEM-700-110-H</td><td>Sera Laboratories International Ltd, Royaume-Uni</td><td>Utilisé dans les mesures qui imitent les conditions physiologiques</td></tr><tr><td>Vancomycine (Van)</td><td>1404-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Royaume-Uni</td><td>Médicament utilisé</td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>7664-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Royaume-Uni</td><td>Utilisé pour les procédures de nettoyage de la verrerie</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>7722-84-1</td><td>Sigma-Aldrich, Royaume-Uni</td><td>Utilisé pour les procédures de nettoyage de la verrerie</td></tr><tr><td>D-Ala et D-Lac</td><td></td><td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Récepteurs de surface recouverts sur le porte-à-faux pour détecter les interactions</td></tr> <tr>médicament-cible<td>LabView</td><td></td><td>National Instruments Co., Austin, TX, États-Unis</td><td>Logiciel utilisé pour l’interface instrumentale pour permettre des mesures contrôlées</td></tr></tbody></table>

nanomechanics des interactions médicaments-cibles et la détection de la résistance aux antibactériens

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

La sonde en porte à faux, qui agit comme un transducteur de réactions entre le modèle bactérienne matrice paroi cellulaire immobilisé sur sa surface et des antibiotiques en solution, a montré un potentiel considérable dans les applications biochimiques de détection avec la sensibilité et la spécificité sans précédent 5.1. Les interactions médicament-cible génèrent des contraintes de surface, ce qui provoque le cantilever à plier, et le signal peut être analysé optiquement quand il est éclairé par un laser. La variation de la tension de surface mesurée avec une précision nanométrique permet de perturbations de la biomécanique de la paroi cellulaire bactérienne modèle Cibles à être suivis en temps réel. Malgré offrant des avantages considérables, de multiples réseaux de capteurs en porte à faux n&#39;ont jamais été utilisées pour quantifier les interactions de liaison médicament-cible. Ici, nous rapportons sur l&#39;utilisation de silicium plusieurs tableaux en porte à faux avec enduit alcanethiol monocouches auto-assemblées mimant bactérienne matrice de la paroi cellulaire Stu quantitativementinteractions de liaison dy antibiotiques. Pour comprendre l&#39;impact de la vancomycine sur la mécanique des structures de la paroi cellulaire bactérienne 1,6,7. Nous avons développé un nouveau modèle 1, qui propose que cantilever flexion peut être décrit par deux facteurs indépendants: i) soit un facteur chimique, qui est donnée par un Langmuir classique isotherme d&#39;adsorption, à partir duquel nous calculons l&#39;équilibre thermodynamique constante de dissociation (Kd) et ii) un facteur géométrique, essentiellement une mesure de la façon dont les récepteurs de peptides bactériens sont réparties sur la surface du cantilever. La répartition de surface des récepteurs peptidiques (p) est utilisée pour étudier la dépendance de la géométrie et de la charge du ligand. Il est démontré qu&#39;une valeur seuil de p ~ 10% est essentielle pour les applications de détection. En dessous de laquelle il n&#39;y a pas de signal détectable flexion tandis qu&#39;au-dessus de cette valeur, le signal de fléchissement augmente presque linéairement, révélant que le stress est un produit d&#39;un produit chimique locale contraignant facteur et un facteur géométrique combiné par la connectivité mécanique des régions réagi et propose un nouveau paradigme pour la conception d&#39;agents puissants pour combattre les infections superbactérie.

Le changement de contrainte mesurée en utilisant une précision nanométrique avec une sensibilité sans précédent pour une seule suppression de liaisons H, est exploité pour suivre les perturbations du modèle bactériennes biomécanique de la paroi cellulaire en temps réel (figures 2a-d). La limite de sensibilité de la détection de la drogue pour Van a été étudiée par dilution en série de ses concentrations dans les étapes à partir de 1000 um à ≤ 10 nm, révélant 10 nm (~ 15 ng / ml) que la concentration détectable la plus basse donnant lieu à une moyenne de ~ -9 ± 2 nm que les signaux différentiels de flexion (figure 2C). La capacité de détecter des antibiotiques dans un environnement physiologique a été étudiée dans le sérum à une concentration cliniquement pertinente de 3-27 uM 17. Lors de l&#39;injection de 7 um Van dans le sérum (90% de sérum de veau foetal, plus 10% tampon phosphate de sodium pH 7,4) à travers tous les leviers dans des conditions identiques, le signal différentiel pourDAla dans le sérum était 105 ± 4 nm tandis que pour les consoles enduits DLAC, aucune flexion a été observée (Figure 3). Les signaux de flexion considérables observées pour DAla couché (vancomycine sensible) cantilevers sont causés par les interactions de liaison médicament-cible forts. Toutefois, pour DLAC couché (résistant à la vancomycine) cantilevers, la présence de l&#39;état fondamental répulsion de l&#39;oxygène seule paire et la réduction liaison NH dans la poche de liaison vancomycine 10,12 contribue à l&#39;affaiblissement des interactions de liaison médicament-cible qui se traduit par moins ou pas cantilever flexion, en particulier pour des concentrations inférieures à la vancomycine (Figure 3). Cependant, pour une forte concentration de vancomycine, nous observons des signaux de flexion mesurables pour DLAC. Par ailleurs, notre modèle expérimental est important dans le référencement situ où tous cantilevers enduits à la fois DAla et DLAC sont simultanément exposés à cette même substance en temps réel. Pour comprendre le rôle précis de la chimie et de la géométrie, nous avons conçu un modèle 1 décrivant la corrélation entre les interactions solvant et de la mécanique de surface. Cela produit la contrainte de surface: <img alt="Équation 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> pour p&gt; pc et zéro autrement (1) Le premier terme de l&#39;équation (1) est l&#39;isotherme d&#39;adsorption de Langmuir, ce qui représente événements de liaison médicament-cible et le second terme est la forme de la loi de puissance décrivant les conséquences mécaniques de grande envergure de la formation du réseau stressé. La constante correspond à une contrainte de surface maximale lorsque tous les sites de liaison accessibles sont occupés et Kd est la surface dissociation à l&#39;équilibre contreTant sur le cantilever. L&#39;analyse comme le montre la figure 4 est le résultat de l&#39;ajustement global de l&#39;équation (1) superpose les signaux de stress différentielles mesurées révèlent, une ~ 29,7 ± 1,0 ou 14,1 ± 3,0 mN / m et K d ~ 1,0 ± 0,3 et 800 ± 310 iM pour D-Ala ou peptides DLAC, où A correspond à une mesure de contrainte de surface lorsque tous les sites de liaison accessibles sont occupés. La sensibilité accrue du cantilever a été réglé en faisant varier systématiquement les densités peptide p tout en surveillant les données de contrainte en fonction de p alors que les concentrations d&#39;antibiotiques fixé à 10, 100 et 250 pM, respectivement (figure 5). Le processus a été répété avec la contrainte en fonction de Van concentrations tandis que les densités de peptides fixés à la p ~ 100%. &lt;img alt = &quot;Figure 1&quot; fo: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1. détection de luge d&#39;interactions de liaison de surface antibiotiques. a) Représentation schématique d&#39;un réseau de capteurs en porte à faux et le mode par lequel les interactions médicament-cibles sont détectées nanomechanically. b) une interaction de liaison chimique entre une molécule de médicament (Van) et l&#39;analogue de mucopeptide bactérienne (D-Ala ou D-Lac). c) Le mécanisme par lequel une des bactéries sensibles à la vancomycine mutés (VSE) acquiert une résistance à la vancomycine par la suppression d&#39;une liaison hydrogène unique dans la poche de liaison. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Figure 2. Suivi des perturbations du modèle bactériennes biomécanique de la paroi cellulaire en temps réel. a) des signaux de flexion absolues de D-Ala, D-Lac et PEG cantilevers enrobés dans du tampon phosphate et de 250 pM vancomycine. Les signaux de référence de PEG différentielles sont indiqués dans les lignes noires. B) des signaux de flexion différentielle de D-Ala et D-Lac cantilevers enrobés dans du tampon phosphate et 250 vancomycine pM. C) Le cantilever flexion différentielle d&#39;un signal dépendant de la dose en fonction du temps en présence de concentrations de vancomycine dans l&#39;ordre de 10 nM (ligne jaune), 100 nm (ligne rouge) et 1000 nM (ligne rouge foncé) respectivement. d) les signaux de déviation du cantilever différentiels pour les trois D-Ala capteurs cantilever enrobées sous forme de fonction du temps, en présence de 10vancomycine nM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Figure 3. Suivi des perturbations du modèle bactériennes biomécanique de la paroi cellulaire en temps réel pour un D-Ala et D-Lac cantilevers enduits en présence de 7 pm vancomycine dans le sérum de veau foetal. <img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> Figure 4. Étudier les nanomechanics d&#39;interactions médicament-cible. Graphique montrant la réponse au stress de surface différentielle mesurée pour D-Ala (cercles noirs) et D-Lac (cercles rouges) Les cantilevers enduits en fonction de la vancomycinela concentration en solution [Van]. Les données sont décrites par l&#39;équation (1) (traits pleins). 1 <img alt="Figure 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;optimisation de la sensibilité de détection nanomécanique d&#39;interactions récepteur-ligand par instruction la dépendance de la charge du récepteur et de la géométrie par des monocouches mixtes. Différentielles surface réactions de stress mesurées des capteurs de porte à faux, en fonction de D-Ala couverture de surface, p, en présence de concentrations de vancomycine fixes en solution à 10 uM (ligne noire), 100 um (ligne rouge) et 250 um (ligne verte).

La résistance acquise aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique et est actuellement classé par l&#39;OMS comme l&#39;une des plus grandes menaces à la vie humaine. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de la technologie de cantilever pour quantifier la résistance antibactérienne, essentielle à la découverte de nouveaux et puissants agents contre les bactéries multirésistantes.

Nanomechanics des interactions médicaments-cibles et la détection de la résistance aux antibactériens

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les changements dans les propriétés mécaniques des cibles modèles de cellules bactériennes sous-jacentes provoqués par les interactions de liaison avec la cible du médicament, et de quantifier la résistance antibactérienne. Cela est réalisé en déposant d'abord 20 nanomètres de film d'or sur un côté du réseau de capteurs en console préalablement nettoyé. La deuxième étape consiste à auto-assembler des cibles de surface appropriées, imitant les phénotypes bactériens sensibles aux médicaments et résistants aux médicaments, sur six des capteurs en console, tandis que les deux capteurs en console restants sont assemblés avec des cibles modèles bactériennes non pertinentes afin de servir de témoins de mesure.Ensuite, les réseaux de capteurs en forme de levier sont chargés dans une chambre d'écoulement liquide. La dernière étape consiste à préparer des solutions de médicaments dans des plages de concentration cliniquement pertinentes et à injecter successivement chaque concentration de médicament sur les réseaux de capteurs en forme de levier. Enfin, une lumière laser focalisée sur les extrémités libres du réseau de capteurs en forme de levier permet de visualiser les déflexions du levier causées par les variations de contrainte superficielle résultant des interactions de liaison entre le médicament et sa cible.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la résonance plasmonique de surface et le microdosage à cristal de quartz résonnant, est qu'elle détecte directement la contrainte de surface générée par les interactions de liaison entre un médicament et sa cible, en mesurant les forces ano-mécaniques spécifiques induites par la liaison de chaque médicament aux cibles à la surface. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pharmacologie, telles que la vitesse, l'efficacité et la précision du dosage. En général, les personnes novices dans ce domaine éprouveront des difficultés en raison de l'alignement fastidieux des échantillons.Cependant, nous avons récemment mis au point un nouveau mécanisme de détection qui ne nécessite pas d'alignement initial de l'échantillon, et à l'avenir, l'utilisation de cette méthode sera beaucoup plus simple et conviviale. Commencez par utiliser une paire de pinces en téflon pour immerger une puce de levier dans une solution de parama fraîchement préparée pendant 20 minutes. Les leviers utilisés dans cette expérience mesurent 500 microns de long, 100 microns de large et 0,9 micron d'épaisseur.Après 20 minutes, retirez le levier et rincez-le soigneusement à l'eau déionisée. Examinez la puce nettoyée à l'aide d'un microscope optique afin de détecter d'éventuelles impuretés. Replacez les puces présentant encore de la poussière ou des saletés dans une solution piranha fraîche pendant 20 minutes supplémentaires.Après un nettoyage approfondi à l’eau déionisée, rincez la puce dans de l’éthanol pur et séchez-la sur une plaque chauffante à 75 degrés Celsius pendant environ 30 secondes afin d’éliminer toute trace d’eau. Inspectez-la ensuite à nouveau à l’aide d’un microscope optique pour confirmer sa propreté. Transférez la puce de levier propre dans une chambre d’évaporation chargée de sources de titane et d’or.Pompez jusqu'à ce qu'une pression de vide d'un fois dix puissance moins sept millibar soit atteinte. Une fois le vide requis obtenu, recouvrez un côté de chaque réseau de leviers avec une couche de titane d'une épaisseur de deux nanomètres. Ensuite, configurez le système pour déposer une couche d'or de 20 nanomètres d'épaisseur par-dessus le titane, qui sert de couche d'adhérence.Confirmez l'épaisseur de chaque couche à l'aide d'un moniteur à cristal de quartz placé directement au-dessus de la source cible. Une fois l'épaisseur correcte atteinte, laissez les puces de levier recouvertes d'or dans la chambre pendant une à deux heures pour refroidir sous vide avant d'ouvrir la chambre. Ensuite, transférez la puce capteur de levier vers un récipient de stockage sous vide rempli d'Argonne afin d'éviter toute forme de contamination.Les puces de levier peuvent être stockées ici indéfiniment. Toutefois, en l'absence de récipient de stockage, la puce doit être utilisée immédiatement juste avant l'expérience. Disposer les tubes capillaires microscopiques dans les canaux d'une plateforme de fonctionnalisation selon le pas des leviers de 250 microns.Ensuite, alignez-les à l'aide d'une lame en verre et fixez-les en place à l'aide d'une pince afin d'empêcher tout déplacement pendant l'expérience. Préparez ensuite des solutions deux millimolaires de récepteurs de surface folatisés, obtenus à partir de cibles de paroi cellulaire bactérienne sensibles et résistantes aux médicaments, en utilisant de l'éthanol pur. Placez ensuite un levier distinct dans chacun des tubes capillaires microscopiques.Veillez à ce que les solutions des molécules de capture de surface soient confinées à chaque capteur en forme de console afin d'éviter toute contamination. Répartissez ensuite aléatoirement un mélange de ces molécules de capture de surface dans les tubes capillaires microscopiques, puis injectez huit microlitres des solutions cibles de surface dans les tubes respectifs. Laissez les consoles incuber dans les solutions pendant 20 minutes.Pendant cette période, les leviers en or fraîchement préparés deviendront des capteurs chimiquement actifs grâce à l'auto-assemblage de peptides muco-bactériens en couche monocouche sur leurs surfaces recouvertes d'or. Commencez par dissoudre des sels de phosphate de sodium mono- et dibasique à 0,1 molaire dans de l'eau ultrapure et mélangez pour obtenir une valeur de pH de 7,4, puis filtrez la solution à l'aide de filtres de 0,2 micron. Ajoutez ensuite 0,002 % de polysorbate 80 à la solution tamponnée.Cela permettra de minimiser les effets d'agrégation causés par des interactions non spécifiques des molécules du médicament avec la verrerie. Ensuite, diluez la vancomycine et l'orin avec des solutions récemment tamponnées à la concentration souhaitée, comprise entre 100 picomolaire et 250 micromolaire, ce qui permettra le calcul du KD. Vortexez et soniquez les échantillons afin de garantir une dissolution complète du médicament dans le tampon et le sérum, afin de déterminer si l'action du médicament est modifiée par les protéines sériques. Répétez cette procédure avec les mêmes concentrations de médicament, mais cette fois-ci, ajoutez-les au sérum total.Vortexez également les échantillons sériques pendant un total de 20 minutes pendant le mélange afin de garantir la solubilité complète des médicaments. Enfin, purgez les solutions avec de l'argon pour commencer la détection de la contrainte de surface sur les leviers. Chargez d'abord les huit capteurs de levier fonctionnalisés sur la puce dans une chambre de cellule d'écoulement liquide.Ensuite, alignez le spot laser sur l'extrémité libre de chaque capteur. Confirmez l'alignement en chauffant la chambre liquide d'un degré Celsius. Les huit réseaux de capteurs en cantilever recouverts d'or subiront une flexion vers le bas en compression due à l'effet bimétallique provoqué par les différences de taux de dilatation du silicium et de l'or.Après avoir chauffé pendant environ 10 minutes, calculez la variation de flexion aux signaux de flexion maximale entre les capteurs en porte-à-faux individuels. Si l'écart-type relatif des signaux est inférieur ou égal à 5 %, acceptez l'alignement comme souhaitable. Sinon, répétez le processus après l'alignement.Laisser refroidir les leviers à température ambiante pendant 10 minutes afin de garantir l'équilibration. Ensuite, mesurer les fréquences de résonance des huit leviers et calculer leurs constantes de raideur. Si la variation de la constante de raideur entre chaque capteur levier est inférieure ou égale à 1 %, valider l'étalonnage.Dans le cas contraire, remplacez le système fluidique connecté au capteur à poutre en porte-à-faux, comme la pompe à seringue illustrée ici, en le raccordant à la puce acceptée via un clapet à six voies. Réglez le débit du système pour qu'il fonctionne à un taux constant compris entre 30 et 180 microlitres par minute, et installez l'ensemble du système dans une armoire thermostatique maintenue à 25 degrés Celsius. Commencez ensuite à injecter soit un tampon, soit du sérum seul, sans médicament, afin d'obtenir une mesure de référence témoin d'une durée comprise entre cinq et 30 minutes.Démarrer le logiciel de visualisation automatisé du laboratoire pour acquérir simultanément les données de déflexion provenant de chacune des poutres encastrées. Surveiller les signaux absolus de courbure des huit poutres encastrées à l’aide d’une méthode optique à faisceau multiplexé dans le temps en série, utilisant un seul détecteur sensible à la position. Une fois la ligne de base acquise, injecter une solution de médicament pendant 30 à 60 minutes après l’échantillon témoin.Un lavage avec une solution de HCl à 10 millimolaire est injecté pendant 10 minutes à une heure afin de dissocier tous les complexes de médicament liés. Grâce à ce système, une précision à l'échelle nanométrique et une sensibilité sans précédent à la suppression d'une seule liaison hydrogène sont possibles ici. La modification à l'extrémité d'une chaîne peptidique, passant de l'alanine D au lactate D, entraîne une réduction significative de la liaison de la vancomycine, rendant les bactéries portant la séquence DLAC résistantes à ce traitement. Lorsque différentes concentrations du médicament ont été testées sur la chaîne peptidique terminée par l'alanine D, la vancomycine a montré un effet dépendant de la dose, environ 10 nanomolaires étant la concentration minimale détectable.La capacité de ce système à détecter des antibiotiques dans un environnement physiologique a été davantage étudiée dans du sérum à une concentration cliniquement pertinente de sept micromoles. Alors que les microleviers revêtus de D-alanine présentaient encore une courbure importante dans ces conditions, ceux recouverts de DLAC n'en présentaient pas. À partir de points de données provenant de plusieurs concentrations de médicament, il est possible d'élaborer des modèles décrivant les interactions entre le médicament et sa cible.Les droites d'ajustement présentées ici combinent l'absorption des langurs, l'isotherme et un terme décrivant les conséquences mécaniques à grande échelle de la formation d'un réseau sous contrainte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes pour confirmer l'efficacité et la précision du dosage du médicament, ainsi que tout signe de résistance bactérienne si elle est effectuée correctement.

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