Name: Imagerie de cellules vivantes de Alphaherpes Virus Transport antérograde et la propagation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Découvrez l'imagerie de cellules vivantes pour visualiser le transport antérograde et la propagation des virus alphaherpès dans les cultures neuronales primaires. Cette méthode permet de suivre les particules virales fluorescentes en temps réel.

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LWE et RK sont pris en charge par le US National Institutes of Health des subventions R37 NS033506-16 et R01-03 NS060699 nationale. MPT a été pris en charge par une société de bourse de recherche postdoctorale American Cancer (PF-10-057-01-MPC). Les conseils et les connaissances du Dr Matthew Lyman et le Dr Oren Kobiler ont joué un rôle dans la conception de la configuration du microscope et les méthodes d&#39;imagerie des cellules vivantes. Nous remercions également pour Neal Barlow et Brian T. Kain de Nikon Instruments pour leur assistance technique dans l&#39;acquisition, l&#39;installation et la performance du microscope.

Section 1 - Conditions de contrôle de l&#39;environnement pour la microscopie par fluorescence des cellules vivantes <ol><li> 30 min avant toute expérience d&#39;imagerie connecter et commencer à chauffer le microscope étage supérieur incubateur. <ol><li> Allumez le microscope, les sources de lumière transmise et épifluorescent, et les commandes de matériels automatisés. Ouvrez le logiciel de contrôle de microscope, NIS Elements, pour se connecter au microscope et commencer à refroidir l&#39;appareil EM-CCD. </li><li> Fixer l&#39;objectif plus chaud à l&#39;objectif approprié (60X ou 100X à immersion d&#39;huile). Remarque: Sélectionnez lentille de l&#39;objectif en fonction du type d&#39;expérience. Le contraste d&#39;interférence différentiel 100X (DIC) est le mieux pour le suivi des assemblées du virion transport antérograde alors que l&#39;objectif de phase 60X est adapté pour visualiser la propagation antérograde. Un grossissement inférieur, les objectifs d&#39;immersion non pétrolières n&#39;ont pas besoin d&#39;un objectif plus chaud car ils ne sont pas en contact direct avec l&#39;échantillon. </li><li> Fixez étage supérieur incubateur sur la platine motorisée de mi<html> croscope. Assurer l&#39;insert approprié qui tient l&#39;échantillon est en place. Fixer la conduite d&#39;air humidifié à partir du contrôle incubateur à l&#39;orifice d&#39;entrée de l&#39;étage de tête incubateur. </li><li> Allumez contrôles chauds incubateur et l&#39;objectif et régler les paramètres de température à des conditions spécifiques déjà vérifiés pour l&#39;objectif et l&#39;échantillon étant imagé (voir discussion). </li><li> Ouvrez la vanne de régulation sur les 5% de CO 2 / réservoir atmosphérique de 95% à fournir CO 2 air complétée au stade supérieur incubateur. Le débit doit être compris entre 60 et 80 ml de gaz par minute. Rythme plus rapide se traduira par déshydratation poussée de l&#39;échantillon en dépit de la chambre d&#39;humidification. </li></ol></li><li> Ajouter l&#39;huile d&#39;objectif sur l&#39;objectif et placer immédiatement la culture qui sera reproduite dans l&#39;étage supérieur incubateur. </li><li> Permettre l&#39;équilibrage de la température dans la culture pour un minimum de 10 min. Une heure est préférable, notamment pour l&#39;imagerie du jour au lendemain décrit dans la section 3. </li></ol>ve_title &quot;&gt; Section 2 - imagerie en temps réel des antérograde Virion Transport Events Protocole <ol><li> Six à huit heures avant l&#39;imagerie, infecter un plat de 35 mm lamelle-bas matures, les neurones SCG dissociées avec 1 x unités formant 10 6 de la plaque du virus d&#39;intérêt (voir le tableau 1, par exemple des virus) en utilisant la méthode décrite dans Taylor et al. 2012a 11. Si vous testez plus d&#39;un virus, la vaccination off-set par 30-60 min pour permettre l&#39;imagerie des échantillons séquentiels au même post-infection fois. </li><li> Insérez plat dans l&#39;étape supérieure incubateur pour un minimum de 10 minutes avant d&#39;exécuter n&#39;importe quelle expérience. Alors que la température s&#39;équilibre, le plan focal se déplace et aura un impact négatif sur les expériences d&#39;imagerie. </li><li> Utilisation de la lumière transmise et de l&#39;oculaire du microscope, pour un corps de cellule neuronale qui a une extension axonale clairement isolé. Vous pouvez également utiliser l&#39;éclairage par fluorescence approprié pour trouver une cellule exprimant DETECmontants des tables de protéines fluorescentes. Il est important de limiter l&#39;exposition de l&#39;échantillon à l&#39;éclairage fluorescent, à cette étape et les étapes ultérieures, en raison des dommages cellulaires induite par la lumière et le blanchiment des protéines fluorescentes. </li><li> Atténuer l&#39;éclairage à fluorescence à réduire l&#39;intensité de la lumière d&#39;excitation dans laquelle les cellules sont exposées. Engager atténuant la lumière densité neutre (ND) de filtres dans le trajet de la lumière d&#39;éclairage par fluorescence. Pour les films d&#39;une durée de 1 min, un minimum de ND4 doivent être utilisés pour empêcher photo-blanchiment des protéines fluorescentes et étendue photo-endommagement des axones. Structures fortement fluorescentes peuvent généralement être visualisé avec un filtre ND8 en place. </li><li> En utilisant le logiciel de microscope (Figure 2 et complémentaire Film 1A), mettez le trajet de la lumière à la caméra EM-CCD. </li><li> Déterminer le temps d&#39;imagerie optimales et des conditions pour chaque canal fluorescent. <ol><li> Lancez une fenêtre d&#39;image en direct en utilisant le bouton &quot;Play&quot;. &lt;/ Li&gt; <li> Déterminer les paramètres d&#39;exposition de l&#39;appareil optimal pour chaque protéine fluorescente. Ne pas dépasser 300 ms par canal comme des aberrations dynamiques sur les structures de virions mouvement rapide se produira. Utiliser le gain EM de l&#39;appareil photo à un réglage de 300 (suggérés par le fabricant gain maximum), afin de minimiser le temps d&#39;exposition et d&#39;améliorer la détection des signaux faibles. Temps d&#39;exposition correcte devrait produire une image avec une faible intensité de fond et les signaux spécifiques élevées. </li></ol></li><li> Après avoir réglé l&#39;exposition et de trouver une région bien définie de l&#39;axone, le logiciel doit être configuré pour effectuer l&#39;acquisition automatique d&#39;images. Arrêtez la fenêtre d&#39;imagerie en temps réel pour éviter échantillon de blanchiment. <ol><li> Dans le logiciel NIS Elements, sélectionnez le 6D - Définir / Exécuter l&#39;application de l&#39;expérience de la &quot;Applications&quot; menu déroulant. </li><li> Dans la fenêtre d&#39;acquisition de ND, cliquez sur l&#39;onglet Temps qui déterminera la fréquence d&#39;acquisition d&#39;image. Définir l&#39;intervalle de «pas de retard» et de la durée de 5 min. Thlogiciel de e acquerra alors trames d&#39;image à la fréquence la plus élevée possible pour la durée de 5 min. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Lambda&quot;, qui permet de sélectionner les configurations matérielles prédéfinies utilisées pour de multiples acquisition d&#39;image fluorescente. Cliquez sur la première case et la baisse subséquente menu déroulant pour sélectionner une configuration matérielle appropriée. Répétez l&#39;opération pour toutes les protéines fluorescentes à imager. </li><li> S&#39;assurer que les languettes pour &quot;XY Positions&quot;, &quot;série Z&quot; et &quot;Image Grand&quot; sont de-sélectionnés. </li><li> Au-dessus des onglets, sélectionnez la case «Save to File&quot; pour sauvegarder automatiquement les images sur le disque dur lors de l&#39;acquisition. Configurer l&#39;emplacement et le nom de fichier du fichier de sortie de l&#39;expérience. Comme les expériences successives sont effectuées, le logiciel va ajouter un numéro séquentiel à la fin du nom de fichier désigné. </li><li> Une fois tous les onglets ont été sélectionnés. Initier l&#39;expérience en cliquant sur le bouton &quot;Run-Now&quot;. </li><li> Optimiser le taux d&#39;acquisition d&#39;image par le biais des paramètres d&#39;exposition et imagtaille de e. En utilisant une petite région de la zone d&#39;image est souvent capable d&#39;accélérer les taux d&#39;acquisition d&#39;images. Définir la zone d&#39;intérêt en utilisant l&#39;outil ROI dans NIS-Elements, en sélectionnant une zone située entre 25% et 50% de la superficie totale de l&#39;image. Alternativement, les temps d&#39;exposition plus courts vont augmenter les taux d&#39;acquisition d&#39;images, mais diminue la qualité de signal (voir la discussion). </li></ol></li></ol> Section 3 - Nuit imagerie time-lapse de antérograde spread Événements <ol><li> Quatre heures avant l&#39;imagerie, infecter une culture neuronale compartimentée construit sur un 35 mm μ-Dish. Inoculez corps cellulaires neuronaux avec 1 x 10 6 unités formatrices de plages du virus d&#39;intérêt (voir le tableau 1, par exemple des virus) en utilisant la méthode décrite dans Taylor et al. 2012b 12. </li><li> Placez délicatement boîte de culture dans l&#39;étage supérieur incubateur. S&#39;assurer que la position de l&#39;objectif est fixé sur le côté de la boîte. Porter lentement l&#39;objectif dans le foyer, s&#39;assurantment l&#39;objectif ne pousse pas vers le haut dans l&#39;échantillon. Une fois le champ de mise au point a été identifié, se déplacer lentement l&#39;objectif dans le centre de l&#39;assiette, près de la barrière interne démarquage du côté interne du compartiment de l&#39;axone. Pendant le déplacement, s&#39;assurer que la profondeur de mise au point est maintenue et éviter les poussant vers le haut dans l&#39;échantillon. Déviation de la surface en plastique par l&#39;objectif risque d&#39;endommager les axones et les plastiques. </li><li> Ajoutez environ 2 ml d&#39;eau tiède (~ 37 ° C) tampon phosphate salin à la boîte de culture à l&#39;extérieur de l&#39;anneau en téflon. Ce entoure la culture des neurones d&#39;une bague de PBS pour minimiser échantillon déshydratation et assurer une isolation thermique. </li><li> Laisser la température s&#39;équilibrer pendant au moins 1 heure avant de commencer l&#39;acquisition d&#39;image automatisé (3,8). Étapes 3.5 à 3.7 peuvent être configurés pendant ce temps. </li><li> Restreindre l&#39;intensité de l&#39;éclairage au niveau le plus bas possible en engageant tous les filtres de densité neutre. Cela permettra l&#39;acquisition d&#39;images fréquentes over de longues périodes sans excessive photo-dommages. Réduire l&#39;éclairage se traduira par un signal faible, ce qui nécessite de plus longues expositions (voir discussion). </li><li> Utiliser les paramètres d&#39;exposition historiques ou avant montage expérimental générer un plat parallèle des cellules épithéliales infectées exprimant les protéines fluorescentes cibles importantes pour établir les paramètres de l&#39;exposition, décrite à la section 2.5. </li><li> Après avoir réglé l&#39;exposition pour les canaux nécessaires, il est temps de configurer le logiciel pour l&#39;acquisition automatique d&#39;images. Arrêtez la fenêtre d&#39;imagerie en temps réel pour limiter échantillon de blanchiment. <ol><li> Dans le logiciel Elements (Figure 2 et le film supplémentaire 2), sélectionnez le 6D - Définir / Exécuter l&#39;application de l&#39;expérience de la &quot;Applications&quot; menu déroulant pour faire apparaître la fenêtre d&#39;acquisition de ND. </li><li> Dans la fenêtre d&#39;acquisition ND, cliquez sur l&#39;onglet Heure. Définir l&#39;intervalle de &quot;5 min&quot;. Réglez la durée à 20 h. Le champ des boucles est automatiquement calculée pour le nombre de répétitions du programmm sera performant. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Lambda&quot;. Cliquez sur la première case et la baisse subséquente le menu déroulant, sélectionnez la configuration de lambda approprié pour le contraste de phase. Répétez l&#39;opération pour les positions suivantes, la sélection des configurations appropriées pour chaque protéine fluorescente à imager. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Image Large&quot;, qui détermine les paramètres de plusieurs images à combiner dans un seul champ de vision plus large. Une zone de bonne taille se compose de 5 x 2 images à l&#39;aide de 7% chevauchement de couture. Cela permettra pour le nombre maximum de cellules par mesure d&#39;imager sans impact sur la fréquence d&#39;acquisition d&#39;image. Aussi, décochez la case pour &quot;Shutter Fermer actif pendant le mouvement de la scène&quot;. Cette option améliore la vitesse d&#39;acquisition en ne fermant volets entre les images. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;XY Positions&quot;, pour identifier plusieurs postes qui seront imagés séquentiellement en parallèle au cours du film du jour au lendemain. Sélectionnez positions qui définissent le centre point pour chaque grande zone d&#39;image. Sélectionner 6-8 positions d&#39;image de l&#39;échantillon. Une bonne partie de l&#39;image aura de petits amas de cellules en étroite apposition d&#39;axones clairement définis. Les cellules ne doivent pas être empilés les uns sur les autres et axone regroupement doit être minimisé. Le point de focalisation est le noyau de la cellule. Positionner l&#39;objectif de telle sorte qu&#39;une enveloppe nucléaire clairement définie est considérée pour la majorité des cellules. </li><li> Assurez-vous sur l&#39;onglet &quot;série Z&quot; est décochée. </li><li> Configurez la fonction de sauvegarde automatique tel que décrit ci-dessus à la section 2.6.5. </li><li> Testez l&#39;exposition et la position en cliquant sur ​​&quot;1 boucle temporelle&quot;. Évaluer les images qui en résultent pour l&#39;éclairage transmis de lumière, foyer, et le cadrage. Si accent s&#39;est déplacé, réinitialiser la mise au point pour chaque position sous l&#39;onglet XY. Attendre 10 minutes et répéter l&#39;opération jusqu&#39;à ce point est stable. </li><li> Après tous les paramètres ont été vérifiés et testés, initier l&#39;expérience automatisé en cliquant sur le bouton &quot;Exécuter&quot;. </li></ol></li&gt; </ol> Section 4 - Traitement de l&#39;image et de l&#39;Exportation Data Export <ol><li> Ensembles de données obtenues lors de l&#39;imagerie des cellules vivantes d&#39;événements de transport ou de propagation doivent être exportés depuis le logiciel NIS Elements en types de fichiers couramment utilisés pour une utilisation ultérieure à des présentations et des publications (Supplemental Movie 3). Pour exporter des films ouvrent la première nd2 fichier approprié. Dans NIS Elements et sélectionnez la vue &quot;split-composante&quot; pour visualiser les canaux fluorescents souhaités. Lire le fichier à une vitesse appropriée; 5 images par seconde est un bon point de départ pour la visualisation des fast-transport. </li><li> Inclure un horodatage pour représenter une horloge en temps réel pendant la lecture du film. Faites un clic droit sur l&#39;image et sélectionner, ajouter ND-information. Un compteur numérique apparaîtra dans le coin supérieur gauche. <ol><li> Modifier l&#39;horodatage pour afficher des informations. Faites un clic droit sur le comptoir et sélectionnez Modifier ND-information. Dans la fenêtre suivante pop-up, de modifier le texte pour refléter l&#39;imaginationng paramètres qui sont importants. Modifier la police, la couleur et la taille pour plus de clarté. </li></ol></li><li> Allez dans le menu &quot;Edition&quot; et trouver &quot;Créer vue instantané» ou appuyez sur la touche &quot;x&quot;. Cette commande ouvre la vue &quot;snapshot&quot; fenêtre. Sélectionnez &quot;s&#39;appliquent à tous les cadres&quot; pour générer un 8-bit, RGB, fichier prêt à exporter contenant les canaux fluorescents de l&#39;ensemble du film. </li><li> Enregistrer en tant que fichier. Avi pour une compatibilité multi-plateforme. Régler la vitesse de lecture de 200 ms par image. Les fichiers. Avi générés par NIS éléments peuvent ensuite être compressés avec d&#39;autres logiciels de conversion dans le type de fichier souhaité. </li></ol>

<ol><li>Johnson, D. C., Baines, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+remodel+host+membranes+for+virus+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses remodel host membranes for virus egress.</a> Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).</li>
<li>Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesvirus+assembly%3A+a+tale+of+two+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpesvirus assembly: a tale of two membranes.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).</li>
<li>Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+accumulation%2C+envelopment%2C+and+exit+in+growth+cones+and+varicosities+in+mid-distal+regions+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons.</a> Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).</li>
<li>Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+Simplex+Virus+Capsids+Are+Transported+in+Neuronal+Axons+without+an+Envelope+Containing+the+Viral+Glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).</li>
<li>Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+gE%2FgI+and+US9+proteins+promote+transport+of+both+capsids+and+virion+glycoproteins+in+neuronal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons.</a> Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).</li>
<li>Tomishima, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).</li>
<li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li>
<li>Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+case%3A+Married+versus+Separate+models+of+alphaherpes+virus+anterograde+transport+in+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons.</a> Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).</li>
<li>Antinone, S. E., Smith, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+herpesvirus+trafficking+in+neurons%3A+membrane+acquisition+directs+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).</li>
<li>Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+a+fluorescent+tegument+component+in+single+pseudorabies+virus+virions+and+enveloped+axonal+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies.</a> Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).</li>
<li>Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+an+alphaherpesvirus+membrane+protein+that+is+essential+for+anterograde+axonal+spread+of+infection+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons.</a> mBio. 3 (2), (2012).</li>
<li>Taylor, M. P., Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphaherpesvirus+axon-to-cell+spread+involves+limited+virion+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li>
<li>Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesvirus+replication+compartments+originate+with+single+incoming+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes.</a> mBio. 2 (6), (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).</li>
<li>Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmented+neuron+cultures+for+directional+infection+by+alpha+herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).</li>
<li>Zareen, N., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+culturing+sympathetic+neurons+from+rat+superior+cervical+ganglia+%28SCG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG).</a> J. Vis. Exp. (23), e988(2009).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-to-Cell+Spread+of+Pseudorabies+Virus+in+a+Compartmented+Neuronal+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System.</a> Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).</li>
<li>Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+compartmented+cultures+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).</li>
<li>Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+Mediates+Axonal+Sorting+and+Directional+Transport+of+Alphaherpesvirus+Particles+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons.</a> Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).</li>
<li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+use+bidirectional+fast-axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466(2001).</li>
<li>Kramer, T., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphaherpesvirus+Infection+Disrupts+Mitochondrial+Transport+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).</li>
<li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).</li>
<li>Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+Hippocampal+Neurons+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Le but de l&#39;imagerie des cellules vivantes est l&#39;observation des processus biologiques tels qu&#39;ils se présentent sans altération significative par l&#39;acte d&#39;observation. Cet objectif est atteint par l&#39;optimisation de trois variables: le contrôle de l&#39;environnement, de la vitesse de l&#39;imagerie et l&#39;éclairage par fluorescence. Ces variables interdépendantes doivent être équilibrées pour obtenir des conditions d&#39;imagerie viables. Les protocoles présentés utilisent des conditions spéci...

Infection du système nerveux périphérique (SNP) par alphaherpes virus tels que le virus de l&#39;herpès simplex (HSV) -1, -2 et virus de la pseudo-rage (PRV) comporte plusieurs étapes complexes et fortement réglementés au long du cycle de vie du virus. Transport dans les neurones du SNP est essentiel pendant les événements des deux infection virale primaire et la suite propagation inter-hôte. Les mécanismes moléculaires qui modulent deux composantes du cycle de vie du virus, le transport dirigé des assemblées virales loin des corps cellulaires dans les axones (transport antérograde) et de la transmission ultérieure des virions aux cellules sensibles (propagation antérograde) sont importantes pour comprendre la pathogenèse herpèsvirus. Le transport et l&#39;évacuation des particules virales dans les neurones dépend de l&#39;assemblage d&#39;un 1,2 virion infectieux mature. Dosages préalablement fixés, y compris immunofluorescence (IF) et la microscopie électronique (EM), ont été utilisés pour étudier l&#39;état de l&#39;ensemble des particules et protinteractions ein associés au transport du virion et la propagation 3-6. Toutefois, la nature dynamique des virions transport et des artefacts expérimentaux mis en place par fixation chimique confondu l&#39;interprétation des images fixes 7,8. Récemment, un certain nombre de protéines de fusion virale fluorescentes ont été décrits pour le HSV et PRV qui ont des répercussions négligeables sur la fonction des protéines. Green Fluorescent Protein (GFP) et des protéines fluorescentes rouges (mCherry ou mRFP) fluorophores sont souvent jumelés pour permettre l&#39;imagerie de deux des trois composantes structurelles d&#39;un virion maturité: capside, tégument, et la glycoprotéine 9-11. Vivez l&#39;imagerie cellulaire du transport antérograde utilisant des virus à double marquage visualise l&#39;état d&#39;assemblage des particules virales durant le transport. Fluorophore similaire exprimant souches virales sont utilisés pour visualiser le nombre et la diversité des génomes viraux suivants propagation 12,13. Les propriétés des protéines fluorescentes (revue de 14,15) influent considérablement surla capacité de visualiser assemblées virales ou cellulaires. Les propriétés intrinsèques de la protéine fluorescente, y compris l&#39;auto-interactions et la stabilité, devraient être considérés lors de la conception et de tester de nouvelles protéines de fusion pour la préservation de la fonctionnalité de type sauvage. En conjonction avec des protéines de fusion fluorescentes, deux bien caractérisés dans les systèmes de culture cellulaire in vitro sont utilisés pour l&#39;imagerie des cellules vivantes de l&#39;infection par le virus de l&#39;herpès: dissocié 16 et compartimenté 17 (figure 1A) ganglions neurones cervicaux supérieurs de rat (CTB). Dans les deux systèmes, embryonnaire SCG de sont disséqués, dissocié à des organismes unicellulaires, et plaqué par culture in vitro 18. SCG neurones font partie du système nerveux autonome et peut être facilement cultivées et différenciées par le facteur de croissance neuronal (NGF) dans un état ​​polarisé matures ex vivo. Neurones SCG dissociées forment un réseau étendu d&#39;axones qui permet fou la visualisation de particules virales car ils subissent le transport antérograde 6. SCG cultures compartimentées offrent une isolation fluidique du corps cellulaire des neurones (S compartiment) et terminaisons axonales distales (compartiment N) 19. Un certain nombre de protocoles détaillés pour la construction et l&#39;utilisation des neurones compartimentées aide initiale de 20 ou modifié Campenot chambres 17 ont été publiés précédemment. Isolement fluidique permet d&#39;infection sélective des corps cellulaires neuronaux et la détection des virions fils après le transport de la gare Termini de l&#39;axone isolés. Placage cellules épithéliales sur les terminaisons avant l&#39;infection fournit des cellules réceptrices de la propagation de l&#39;infection virale. Il ya beaucoup d&#39;éléments essentiels importants pour tous vivent expérimentation d&#39;imagerie cellulaire, mais le plus pertinent pour nos protocoles sont les suivants: acquisition automatique de l&#39;image, éclairage fluorescent, la vitesse de l&#39;imagerie et le contrôle de l&#39;environnement. Pour toutes les expériences d&#39;imagerie, nous utilisonsinversé, automatisé, microscope d&#39;éclairage à épifluorescence (figure 1B). Le microscope est construit autour du Nikon Eclipse base de Ti et emploie un certain nombre de systèmes motorisés commandés par ordinateur pour reconfigurer rapidement le microscope lors de l&#39;acquisition automatique d&#39;images. Pour l&#39;éclairage par fluorescence, nous utilisons un large spectre mercure lampe à arc qui peut être atténué avec des filtres de densité neutre le long de la voie d&#39;éclairage. filtres d&#39;excitation limiter le spectre de l&#39;éclairage fluorescent et lorsqu&#39;il est associé à des miroirs dichroïques multi-pass et filtres d&#39;émission de fluorescence visualiser composés fluorescents spécifiques. Les filtres d&#39;excitation et d&#39;émission sont montés à commutation rapide roues indépendantes, le filtre pour permettre l&#39;acquisition séquentielle rapide des différents canaux fluorescents. La vitesse d&#39;acquisition des images est encore améliorée avec une caméra EM-CCD sensible et rapide, utile pour la détection des signaux de faible intensité et de courte images fois lu. Contrôle de l&#39;environnement sur la microscOPE est réalisée avec un haut stade chauffé incubateur et un chauffage de l&#39;objectif de maintenir les échantillons à des températures élevées pendant une atmosphère humidifiée 2 et CO enrichi est passé dans l&#39;incubateur. Le microscope est gardé dans une pièce sombre avec une température ambiante maintenue à près de 25 ° C et la lumière extérieure réduite avec des rideaux occultants sur toutes les fenêtres. Les protocoles suivants décrivent l&#39;utilisation de ce système pour le transport antérograde et des essais d&#39;étalement. Un certain nombre d&#39;alternatives existent pour contrôler les variables d&#39;imagerie des cellules vivantes. Le contrôle des paramètres de microscopie peut être effectuée manuellement ou par des systèmes automatisés qui dépendent de logiciels propriétaires. Éclairage par fluorescence peut être réalisé avec des sources laser halogène, LED ou. La vitesse de formation d&#39;image est modifiée par la vitesse de commutation du filtre et le temps pour visualiser le signal dans le système de détection couplé. Contrôle de l&#39;environnement peut être réalisé avec du matériel spécialisé sur la miétape de croscope, enceinte de tout ou partie du microscope dans une boîte chauffé et humidifié, ou en élevant la température de la pièce où microscopie sera effectuée. Chacune de ces alternatives a ses avantages et inconvénients liés aux coûts et à la performance. Dans le protocole suivant, nous détaillons l&#39;utilisation de l&#39;imagerie des cellules vivantes pour étudier le transport antérograde rapide et la propagation antérograde de alphaherpes virus grâce à l&#39;utilisation de souches virales recombinantes. Imagerie des cellules vivantes en temps réel visualise capside, tégument et / ou glycoprotéine co-localisation des structures dynamiques qui subissent le transport dans les axones 11. Imagerie timelapse nuit de cultures de neurones compartimentées visualise sortie du virion axonale et l&#39;infection de cellules sensibles 12. Les protocoles présentés ici ont été optimisés pour une utilisation avec notre système d&#39;imagerie en particulier, mais sont présentés en termes généraux par rapport aux quatre éléments d&#39;imagerie des cellules vivantes. Dans la discussion que nousseront plus en détail certains de l&#39;optimisation qui est nécessaire pour l&#39;expérimentation réussie.

<table><tbody><tr><td>Plat de culture à fond en verre de 35 mm</td><td>MatTek Corporation ; Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm &mu ;-Dish </td><td>Ibidi USA LLC, Vérone, WI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Corps de microscope </td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nikon Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microscope motorisé X-Y stage</td><td>Prior Scientific ; Rockland, MA</td><td>H117 ProScan Flat Top</td><td></td></tr><tr><td>Roues à filtres motorisées</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110 Roue à</td><td></td>filtres à 10 positions</tr><tr><td>Source d’éclairage fluorescent </td><td>Lumen Dynamics ; Mississauga, Ontario Canada</td><td>X-Cite 120Q</td><td></td></tr><tr><td>Ensembles de filtres de fluorescence multibande</td><td>Chroma Technology Corp. ; Bellows Falls, VT</td><td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD caméra</td><td>Andor Technology USA ; South Windsor, CT</td><td>iXon3 897</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide stage top incubateur environnemental</td><td>Live Cell Instruments ; Séoul, Corée du Sud</td><td>TC-L-10</td><td></td></tr><tr><td>Lentille chauffante</td><td>Bioptecs ; Butler, PA</td><td>150803 Controller 150819-12-08 Logiciel</td> d’analyse de chauffage <td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments Inc. ; Melville, NY</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie de cellules vivantes de alphaherpes virus transport antérograde et la propagation

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Les progrès des techniques vivantes des cellules par microscopie de fluorescence, ainsi que la construction de souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes ont permis la visualisation en temps réel du transport et de la propagation de l&#39;infection par le virus alphaherpes des neurones. L&#39;utilité de nouvelles protéines de fusion fluorescentes à membrane virale, tégument, et capsides, en conjonction avec l&#39;imagerie des cellules vivantes, identifié ensembles de particules virales subissant transport à l&#39;intérieur des axones. Des outils similaires ont été utilisées avec succès pour les analyses de cellule à cellule propagation de particules virales de quantifier le nombre et la diversité des virions transmis entre les cellules. Surtout, les techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes du transport antérograde et la propagation de produire une foule de renseignements, y compris des vitesses de particules de transport, de distribution de particules, et des analyses temporelles de la localisation des protéines. A côté des techniques génétiques virales classiques, ces méthodes ont fourni des renseignements cruciauxen questions mécanistiques importantes. Dans cet article, nous décrivons en détail les méthodes d&#39;imagerie qui ont été développés pour répondre aux questions de base du transport de virus alphaherpes et la propagation.

Transport antérograde L&#39;application de ce protocole d&#39;infections des cultures SCG dissociées avec PRV 348, une souche PRV recombinant exprimant la GFP-US9 et des protéines de fusion membranaire gM mCherry, a facilité la visualisation du transport antérograde des virions (Figure 3 et Movie supplémentaires 4). L&#39;incorporation de ces protéines de fusion dans des particules virales résultats dans leur détection sur le transport lacrymaux, et les conditi...

Imagerie des cellules vivantes d&#39;infections virales alphaherpes permet d&#39;analyser les événements dynamiques de transport dirigée et la propagation intercellulaire. Ici, nous présentons des méthodes qui utilisent des souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes pour faciliter la visualisation des assemblages virale lors d&#39;une infection de neurones primaires.

Imagerie de cellules vivantes de Alphaherpes Virus Transport antérograde et la propagation

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les événements liés au transport et à la propagation du virus de l'herpès à l'aide de fusions avec des protéines fluorescentes dans des cultures primaires de neurones. Cela est réalisé en commençant par établir une incubation des échantillons à des températures physiologiquement pertinentes sur un microscope doté d'un système d'illumination fluorescente à commutation rapide. Dans un deuxième temps, les paramètres de l'imagerie de fluorescence sont ajustés afin de limiter les dommages photo-induits aux cellules tout en acquérant des données suffisantes.Ensuite, soit l'acquisition séquentielle des canaux fluorescents est effectuée, soit une acquisition multiposition. Des cadres d'images juxtaposées sont acquis lors de la dernière étape. Les données sont analysées et remises en forme pour la présentation et la publication.En fin de compte, cette méthode d'imagerie en temps réel de cellules vivantes permet de suivre le déplacement de particules virales fluorescentes au sein des neurones et de visualiser l'infection au fur et à mesure de sa propagation entre les cellules. Cette méthode peut fournir des informations sur le transport et la diffusion du virus de l'herpès dans les neurones. Elle peut également être appliquée à d'autres phénomènes dynamiques en biologie cellulaire et en microbiologie, tels que l'internalisation endocytique de particules ou la migration cellulaire.Avant toute expérience d'imagerie, connectez et commencez à préchauffer l'incubateur de platine du microscope. Après 30 minutes, allumez le microscope, les sources de lumière transmises et épifluorescentes, ainsi que les commandes automatisées du matériel. Ensuite, ouvrez NIS Elements, le logiciel de contrôle du microscope, afin de vous connecter au microscope.Voici une capture d'écran d'une interface utilisateur standard de NIS Elements. Les boutons lecture et arrêt contrôlent la fenêtre d'image en direct, qui affiche les configurations matérielles actuelles pour l'acquisition d'images, ainsi que ce qui est actuellement observé. Sur le panneau supérieur se trouvent une série de configurations optiques qui appliquent des paramètres matériels prédéfinis afin de configurer le microscope pour la détection en illumination transmise ou en fluorescence.Les commandes de caméra et les réglages d'exposition permettent de configurer la détection de la caméra afin d'optimiser la qualité d'image et la vitesse. Toutes les expériences sont coordonnées à l'aide des commandes d'acquisition ND. Ensuite, fixez un réchauffeur d'objectif à l'objectif à immersion huile approprié, puis fixez l'incubateur de plateau à la platine motorisée du microscope.Veillez à ce que l'insert approprié permettant de maintenir l'échantillon soit en place, puis raccordez la conduite d'air humidifié provenant du système de contrôle de l'incubateur à l'orifice d'entrée de l'incubateur à plateau chauffant. Ensuite, allumez les commandes de l'incubateur et du réchauffeur d'objectif, puis réglez les paramètres de température selon les conditions préalablement validées, spécifiques à l'objectif et à l'échantillon à imager. Enfin, ouvrez le robinet de régulation du réservoir contenant 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'air atmosphérique afin d'alimenter l'incubateur à plateau chauffant en air enrichi en dioxyde de carbone.Pour visualiser en temps réel les événements de transport de virions entrants de grade. Premièrement, insérez une boîte de culture cellulaire contenant des neurones infectés dans l'incubateur à plateau pendant au moins 10 minutes avant d'exécuter l'expérience. Ensuite, à l'aide de la lumière transmise et de l'oculaire du microscope, repérez un corps cellulaire neuronal possédant une extension axonale clairement isolée.Rechercher des zones imageables dans la culture neuronale est la partie la plus difficile de cette procédure. La réussite est assurée en préparant plusieurs cultures afin de pallier une mauvaise croissance cellulaire ou une infection, ou une perturbation physique de la culture pendant l'acquisition d'images. Utilisez maintenant le logiciel du microscope pour basculer le trajet lumineux vers la caméra EM CCD, puis cliquez sur le bouton de lecture pour ouvrir une fenêtre d'image en direct.Après avoir déterminé les réglages d'exposition optimaux du capteur pour chaque jeu de protéines fluorescentes, réglez le gain de multiplication électronique du capteur sur 300. Minimisez le temps d'exposition et améliorez la détection des signaux faibles. Arrêtez la fenêtre d'observation en direct afin d'éviter la décoloration de l'échantillon.Ensuite, après avoir réglé les temps d'exposition et identifié une région bien définie de l'axone dans les éléments NIS, configurez le logiciel pour l'acquisition séquentielle d'images. Ouvrez le menu déroulant des applications et sélectionnez l'application « six D définir expérience ». Dans la fenêtre d'acquisition ND, cliquez sur l'onglet temporel pour déterminer la fréquence d'acquisition des images.Réglez l'intervalle sur aucun délai et la durée sur cinq minutes. Cliquez maintenant sur l'onglet Lambda pour sélectionner les configurations matérielles prédéfinies utilisées pour l'acquisition d'images fluorescentes multiples. Cochez la première case, puis dans les menus déroulants suivants, sélectionnez une configuration matérielle appropriée.Sélectionnez la case « enregistrer dans un fichier » et configurez l'emplacement et le nom du fichier de sortie de l'expérience. Une fois tous ces paramètres définis, cliquez sur le bouton « exécuter maintenant » pour démarrer l'expérience. Le taux d'acquisition d'images est optimisé grâce aux réglages d'exposition et à la taille de l'image acquise.Utilisez l'outil de région d'intérêt dans NIS Elements pour définir la région d'intérêt. Sélectionnez une zone comprise entre 25 et 50 % de la surface totale de l'image afin d'effectuer une acquisition par lapse de temps pendant la nuit des événements de dispersion des entérocytes. Commencez par placer délicatement la boîte de culture dans l'incubateur monté sur le porte-objet.Après avoir vérifié que la position de l'objectif est réglée sur le côté de la boîte, approcher lentement l'objectif au foyer, en prenant soin qu'il ne remonte pas vers l'échantillon. Une fois le champ de mise au point identifié, déplacer lentement l'objectif au centre de la boîte, près de la barrière interne, délimitant ainsi le côté interne du compartiment des axones, tout en veillant à maintenir la profondeur de mise au point et à éviter de remonter vers l'échantillon. Ensuite, entourer les neurones dans la boîte de culture avec environ deux millilitres de PBS à 37 degrés Celsius à l'extérieur de l'anneau en téflon afin de minimiser toute déshydratation de l'échantillon et d'assurer une isolation thermique.Ensuite, activez tous les filtres de densité neutre afin de limiter l'intensité de l'illumination au niveau le plus bas possible, permettant ainsi une acquisition fréquente d'images sur de longues périodes sans endommagement photoélectrique excessif. Dans la fenêtre d'acquisition ND, cliquez sur l'onglet d'image grand format, puis sélectionnez une zone composée de cinq par deux images. Utilisez un recouvrement de juxtaposition de 7 % pour acquérir séquentiellement plusieurs positions en parallèle.Au cours du film réalisé pendant la nuit, sélectionnez l'onglet positions XY. Définissez ensuite les positions qui détermineront le point central de chaque zone d'image large. Le point de focalisation doit correspondre au noyau de la cellule ; positionnez l'objectif de manière à observer une enveloppe nucléaire bien définie pour la majorité des cellules.Cliquez ensuite une fois sur la boucle pour tester les réglages d'exposition et de position, puis évaluez les images obtenues pour la lumière transmise, l'illumination, la mise au point et le cadrage. Une fois tous les réglages vérifiés et testés, lancez l'expérience automatisée en cliquant sur le bouton exécuter maintenant afin d'exporter les vidéos obtenues pendant l'imagerie en temps réel des cellules vivantes. Ouvrez d'abord le fichier ND2 brut approprié dans NIS Elements et sélectionnez la vue composants séparés.Pour visualiser les canaux fluorescents souhaités, lisez le fichier à une vitesse appropriée. Cinq images par seconde constituent un bon point de départ pour visualiser le transport rapide, en incluant un horodatage représentant une horloge en temps réel pendant la lecture de la vidéo. Cliquez avec le bouton droit sur l'image et sélectionnez AJOUTER des informations ND.Un compteur numérique apparaîtra dans le coin supérieur gauche pour modifier l'horodatage ; cliquez avec le bouton droit sur le compteur et sélectionnez « modifier les informations du filtre neutre (ND) ». Dans la fenêtre contextuelle suivante, modifiez le texte afin qu'il reflète les paramètres d'acquisition d'images pertinents. Ajustez la couleur et la taille de la police du texte pour une meilleure lisibilité.Ensuite, allez dans le menu Édition et sélectionnez Créer une capture de vue pour ouvrir la fenêtre de capture de vue, afin de générer un fichier d'exportation RVB 8 bits prêt à l'emploi contenant les canaux fluorescents de l'ensemble du film ; sélectionnez Appliquer à toutes les images. Enfin, enregistrez le fichier au format A VI pour une compatibilité multiplateforme et réglez la vitesse de lecture à 200 millisecondes par image. Sur cette image en contraste de phase, on observe une culture représentative, mature, dissociée de ganglions cervicaux supérieurs, ou GCS, utilisée pour l'imagerie du transport de virions intergrade ; les neurones infectés par le virus de la pseudorabie, ou PRV 3 48, expriment les protéines de fusion membranaire GFPS neuf et GMM cherry.Dans cette figure, on observe une imagerie représentative de cellules vivantes des axones du ganglion cervical supérieur (SCG) huit heures après infection par le virus PRV 348, mettant en évidence des structures en cours de transport antérograde au sein des axones distaux, visualisées dans deux canaux fluorescents, GFP et mCherry. Une structure en transport antérograde, indiquée par les flèches blanches, progresse à l'intérieur de l'axone. Les deux protéines fluorescentes sont décalées spatialement en raison de l'acquisition séquentielle des canaux fluorescents et du mouvement rapide des structures virales.L'application de ce protocole aux infections de cultures dissociées de ganglions cervicaux supérieurs (SCG) par le PRV 3 48 a facilité la visualisation du transport antérograde des Vons. L'incorporation de ces protéines de fusion dans les particules virales permet leur détection sur des points de transport, observés sous forme de points fluorescents en mouvement. Les conditions d'imagerie susmentionnées minimisent le décalage de chaque fluorophore sur une particule en mouvement lors du changement de filtre.L'utilisation de roues porte-filtres à commutation rapide et de miroirs dichroïques multipasses appariés permet une acquisition séquentielle rapide de deux ou plusieurs canaux fluorescents à des vitesses allant jusqu'à 0,8 image par seconde dans une fenêtre d'acquisition de trois minutes. De nombreux Punta en transport sont couramment observés, et de grandes tailles d'échantillon pour les analyses de colocalisation sont rapidement obtenues. Voici un schéma du système de culture compartimenté illustré sur cette image, où des neurones du ganglion cervical supérieur (SCG) sont ensemencés dans le compartiment de gauche, leurs projections axonales s'étendant sous les barrières internes jusqu'au compartiment le plus à droite.Les images suivantes ont été sélectionnées à partir d'un film en time-lapse composé de grandes images mosaïques illustrant la transmission de virions depuis des axones infectés par le PRV 4 27 vers des cellules épithéliales réceptrices. Dans ce premier panneau apparaît l'image fusionnée des signaux fluorescents YFP et RFP à un moment donné après l'infection. On observe ici le début de l'expression, dans les cellules réceptrices, d'une protéine fluorescente YFP liée à la membrane et d'une protéine de fusion VP26-MRFP.Le cadre blanc met en évidence une zone des cellules épithéliales réceptrices contenant des assemblages de capsides infectieux. Ici, la même zone qu&#39;à l&#39;image précédente est présentée telle qu&#39;elle apparaît en utilisant uniquement le canal RFP. La ligne blanche continue indique la représentation schématique du contour de la cellule.Les lignes blanches en pointillés indiquent les noyaux cellulaires et les lignes bleues délimitent les axones. Dans ce second panneau, les canaux YFP et RFP sont uniquement montrés ensemble. Remarquez le grand nombre de puncta MRFP associés aux faisceaux d'axones.Ces cellules ont été récemment infectées et n'expriment aucune des deux protéines de fusion. Les cellules infectées peuvent être remontées en arrière pour visualiser les capsides fluorescents ayant initié l'infection virale. Ces cellules individuelles peuvent être isolées à partir du grand champ et suivies sans perte significative de détails.Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la microscopie de cellules vivantes peut influencer le processus biologique observé. Toutefois, une optimisation minutieuse de ces protocoles permet une visualisation sans altération du processus.

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