Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour

L'objectif général de cette procédure est de générer une carte bidimensionnelle du protéome bactérien. Cela est réalisé en premier lieu en faisant croître une culture bactérienne et en récoltant les protéines. Ensuite, les protéines récoltées sont séparées selon une seule dimension en fonction de leur pH.

Par électrofocalisation après la séparation en première dimension, les protéines sont davantage séparées en seconde dimension selon leur poids moléculaire. Enfin, le gel en seconde dimension est coloré et les protéines sont visualisées. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant des différences d'expression protéique par électrophorèse bidimensionnelle.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogenèse bactérienne, telles que les protéines produites dans certaines conditions, et comment différents isolats bactériens diffèrent quant à la production de protéines. Ces informations peuvent permettre d'identifier des protéines candidates susceptibles d'être impliquées dans la virulence. Après avoir fait croître une culture de 100 millilitres de lait froid enrichi à la phase stationnaire, transférez 35 millilitres dans un tube à centrifugation et centrifugez à 4 500 G et 4 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Resuspendre, suspendre le culot dans 35 millilitres de PBS froid et répéter la centrifugation. Après avoir resuspendu le culot dans un millilitre de PBS froid, transférer la solution dans un microtube stérile de deux millilitres et centrifuger à nouveau. Répéter le lavage dans un millilitre de PBS froid avant de centrifuger à quatre degrés Celsius et à 14 000 g pendant une minute. Jeter le surnageant et ajouter un millilitre de solution P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F, puis transférer le culot dissous dans un tube vissable de deux millilitres contenant environ 0,5 millilitre de billes de verre pré-stérilisées.

Ensuite, dans la chambre froide, pour rompre les cellules, utiliser un homogénéisateur à billes trois fois pendant une minute chacune, en plaçant l'échantillon sur de la glace après chaque cycle, puis centrifuger une minute avant de transférer le surnageant dans un tube en polystyrène stérile de cinq millilitres. Pour augmenter le rendement, répéter la fragmentation par billes deux fois avec un aliquot supplémentaire de P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Récupérer les échantillons.

Ensuite, après avoir dosé la quantité de protéines, conserver des aliquotes de 200 microgrammes à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être utilisées pour réaliser la première dimension. Commencer la focalisation isoélectrique ou FIE en utilisant une solution de nettoyage pour bandes afin de nettoyer les supports de bandes. Rincer ensuite les bandes avec de l'eau milli Q.

Ensuite, les laisser sécher à l’envers après le séchage, attribuer à chaque échantillon un numéro de support de bande de gel. Charger un échantillon protéique de 200 microgrammes préparé au préalable dans le puits latéral du support, puis utiliser la pipette pour répartir l'échantillon le long du support à l'aide de pinces propres. Sortir les bandes de gel de leur emballage.

Ensuite, retirez la couche protectrice des bandes de gel avant de les aligner, côté rugueux vers le bas, en un mouvement lent et glissant afin d'humidifier les bandes de l'extrémité négative à l'extrémité positive. Pour éviter la surchauffe, placez du papier buvard humidifié avec de l'eau stérilisée au-dessus de l'électrode et sous les bandes de gel. Éliminez les bulles d'air et recouvrez d'une fine couche d'huile minérale pour éviter le dessèchement.

Aligner les supports de bande de gel sur l'appareil de CIE. Faire courir les échantillons en utilisant le programme indiqué ici. Les gels peuvent être retirés à tout moment pendant la dernière étape.

Lorsque le programme est terminé, retirez les bandes des porte-bandes et, sauf si elles doivent être utilisées immédiatement, recouvrez-les de film plastique et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment d’effectuer la deuxième dimension de l’électrophorèse SDS-PAGE. Après avoir monté l’appareil de coulée de gel pour l’électrophorèse SDS-PAGE, préparez la solution de gel dans un flacon muni d’une embout sous vide et d’un barreau aimanté en ajoutant du tampon Tris 1,5 molaire Draquel et un mélange d’eau MCU, puis dégazez la solution à vitesse modérée sous vide pendant 20 minutes. Une fois le dégazage terminé, ajoutez du SDS à 10 % à la solution de gel en pipettant le long de la paroi du flacon. Pour éviter d’introduire des bulles, ajoutez ensuite du persulfate d’ammonium fraîchement préparé et du TEMED, puis mélangez.

Versez le gel et laissez-le durcir, puis dissolvez le DTT dans la solution d'équilibre préparée précédemment. Retirez les bandes du stockage à moins 80 degrés Celsius, déballez-les et placez les bandes IPG, côté gel vers le bas, dans le tampon, puis incubez pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 4,5 litres de tampon d'électrophorèse dans le réservoir de migration.

Ensuite, à l’aide de pinces, retirez les bandes de la solution d’équilibration et utilisez une serviette en papier pour éliminer l’excès de tampon. Démontez l’appareil de coulée du gel et lavez les plaques de verre à l’eau tiède. Après avoir remplacé l’eau située au-dessus du gel par du tampon de migration, utilisez des pinces propres pour placer une bande sur la plaque longue, côté gel tourné vers vous.

Lubrifiez la bande avec un tampon x et utilisez une bande en plastique pour faire glisser la bande IPG davantage contre le gel, en éliminant toutes les bulles d'air entre la bande et le gel. Ajoutez une solution de scellement à base d'agarro sur le dessus de la bande afin de la fixer en place. Ensuite, après avoir répété le processus pour toutes les bandes, abaissez-les dans le réservoir de gel.

Après avoir vérifié que le niveau du tampon 1× dans la chambre externe se trouve au niveau indiqué, fixez la chambre supérieure. Placez le cadre de la chambre tampon supérieure sur les plaques de verre et appuyez vers le bas. Ajoutez le tampon de migration 2× dans la chambre supérieure jusqu'à la ligne médiane.

Ensuite, ajoutez le tampon de migration 1 x dans la chambre externe jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne supérieure. Placez le couvercle et allumez l'appareil d'électrophorèse et l'alimentation électrique. Faites migrer les échantillons toute la nuit à 52 volts, 96 milliampères et 5 watts.

Faire migrer les gels jusqu'à ce que les fronts de migration soient à un centimètre du bas. À la fin de l'électrophorèse, retirer les plaques du support. Une fois les gels retirés des plaques de verre, les fixer dans la solution n°1 pendant au moins une heure ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Transférez ensuite les gels vers la solution de fixation 2 et agitez pendant une heure. Lavez les gels dans de l’eau Milli Q quatre fois pendant 15 minutes chacun. Ensuite, utilisez la solution de nitrate d’argent pour colorer les gels pendant 30 minutes ou jusqu’à 48 heures.

Après avoir lavé les gels pendant une minute dans de l’eau Milli Q, transférez-les dans la solution de développement jusqu’à coloration du gel. Après cinq à trente minutes, pour arrêter la réaction, transférez les gels dans la solution d’arrêt pendant 10 minutes. On observe ici un gel coloré au Kumasi Blue représentant des extraits protéiques totaux de cellules d’ol dia multivorans.

Des isolats cliniques cultivés soit dans du bouillon LB, soit dans du bouillon de mannitol de levure et récoltés en phase stationnaire. Une analyse comparative des profils protéiques extraits des mêmes cultures bactériennes à deux moments différents a révélé des motifs de bandes similaires, indiquant des extractions protéiques réussies. Sur cette figure, l'analyse par électrophorèse bidimensionnelle de 200 microgrammes de protéines totales provenant de Bural dio, pseudo montre une abondance de plus de 500 taches pouvant être identifiées individuellement par spectrométrie de masse.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la cytométrie peuvent être réalisées afin de déterminer les différences quantitatives et qualitatives entre des isolats bactériens étroitement apparentés. De plus, en modifiant la méthode de coloration, les chercheurs peuvent identifier les protéines présentes dans les taches par excision des taches et spectrométrie de masse.