Un tégument Literie dosage à explorer génétiquement

L'objectif général de cette procédure est de monter un test de germination sur couche de testa afin d'explorer comment l'endosperme contrôle la germination des graines chez Arabidopsis en réponse à diverses conditions environnementales, à la fois aux niveaux génétique et in vitro. Cela est réalisé en premier lieu en utilisant une aiguille de seringue et des pinces tronquées pour disséquer soigneusement la testa et l'embryon à partir de graines d'Arabidopsis. Dans une deuxième étape, les testas disséquées sont transférées délicatement sur un milieu de germination.

Ensuite, les téguments sont assemblés en une seule couche circulaire. Dans la dernière étape, les embryons sont disposés au centre du lit de téguments assemblé, également en une seule couche circulaire.

L'endosperme joue un rôle essentiel dans le contrôle de la germination des graines chez nos graines ab autopsie. Et le test de courbure du code de la graine est une procédure génétique in vitro permettant d'identifier les composants moléculaires des voies de signalisation actives dans l'endosperme pour le contrôle de la germination des graines. En général, les personnes nouvellement familiarisées avec cette méthode éprouvent des difficultés, car il est difficile de disséquer rapidement l'embryon sans l'endommager.

L'âge du matériel mis en place est également important à prendre en compte, car celui-ci finit par perdre sa capacité à contrôler la détermination cellulaire avec le vieillissement. Commencez par verser 50 à 60 microlitres de graines sèches matures d'Arabidopsis dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite un millilitre d'éthanol à 70 % dans le tube et agitez les graines à température ambiante à l'aide d'un vortex ou à 1200 tr/min. Après 10 minutes, centrifugez le tube pendant trois secondes à 4 000 g pour concentrer les graines au fond du tube.

Ensuite, utilisez une pointe d'aspiration sous vide pour aspirer soigneusement l'éthanol, en laissant les graines au fond du tube. Ajoutez maintenant un millilitre d'eau distillée stérile aux graines, puis agitez-les pendant encore 10 minutes. Après avoir à nouveau centrifugé les graines, aspirez le surnageant et ajoutez un autre millilitre d'eau distillée stérile dans le tube, en veillant à ce que le flux d'eau mette les graines en suspension de manière homogène dans tout le tube.

Ensuite, placer le tube dans un porte-tubes pour permettre aux graines de sédimenter au fond du tube. Après environ 30 secondes, aspirer soigneusement l'eau pour ensemencer les graines. Premièrement, verser 30 millilitres de milieu de germination fraîchement préparé à 50 degrés Celsius dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Resuspendre les graines dans 200 microlitres d'eau distillée stérile, puis utiliser une micropipette de 1 millilitre pour les transférer à la surface du milieu de germination.

Aspirez l'eau entourant les graines, puis laissez la boîte de Pétri et les graines découvertes dans l'enceinte de flux laminaire pour un séchage supplémentaire. Après deux heures, fermez la boîte de Pétri, en laissant les graines dans la hotte pendant encore 90 minutes. Placez maintenant un microscope stéréo à l'intérieur de la hotte.

Verser 30 millilitres de milieu de germination dans une autre boîte de Pétri de 100 millimètres, puis placer deux papiers rectangulaires Watman de 3 millimètres juxtaposés et stérilisés à l'autoclave à la surface du milieu. L'étape la plus délicate de cette procédure est la dissection c, car A, la graine est très fine, il est donc nécessaire de faire très attention à ne pas endommager l'embryon lors de la coupe de la graine prise à l'aide d'une paire de forceps stériles Dumont n°5 à extrémités émoussées.

Transférez les graines sur les papiers, puis maintenez la pince fermée. Appuyez doucement une graine individuelle dans le papier. Utilisez maintenant la pointe d'une aiguille de seringue à insuline de calibre 29 pour couper l'enveloppe de la graine le long de son axe semi-principal le plus long, aussi près que possible de l'endroit où les cotylédons sont reliés au radicule.

Ensuite, utilisez la pince pour pousser la graine contre le papier. Appliquez à nouveau une pression au niveau de l'extrémité des Cains, la plus proche de l'extrémité du radicule, afin de libérer l'embryon de l'enveloppe de la graine pour monter un essai d'incorporation de l'enveloppe de la graine. Placez d'abord un morceau de treillis en nylon stérile de 3,5 sur 5 centimètres dans une autre boîte de 100 millimètres fraîchement remplie de milieu de germination.

Ensuite, utilisez la seringue pour pousser délicatement les embryons et les téguments sur les bords métalliques de la pince et transférez les tissus végétaux sur le tamis en nylon. Utilisez la pince et la seringue pour assembler une seule couche circulaire de téguments, en veillant à ce que les téguments soient aussi proches que possible les uns des autres et que les ouvertures des téguments soient orientées vers le haut. Placez ensuite les embryons en une seule couche circulaire au centre du lit de téguments, en vous assurant qu’ils sont également aussi proches que possible les uns des autres.

Enfin, incuber les tests sur lit de sable marin en lumière continue à 20 à 21 degrés Celsius, en accord avec les résultats précédents. Des graines de mutants opsys de lapin incapables de synthétiser la gierilline ou des mutants déficients en GA ne peuvent pas germer 80 heures après l'inhibition de la graine. En revanche, et conformément davantage aux résultats antérieurs, l'élimination du tégument entraîne la croissance de l'embryon de mutant déficient en GA, sauf si l'acide OB CIC ou une BA est présente dans le milieu, suggérant que l'endosperme des mutants déficients en GA libère une BA vers l'embryon pour bloquer sa germination.

Dans cette image, 80 heures après l'inhibition des graines, un test d'incubation sur testa avec des embryons mutants déficients en GA placés sur un lit composé de 80 testas mutants déficients en GA est présenté. Conformément à notre hypothèse, les testas mutants déficients en GA bloquent la croissance des embryons mutants déficients en GA. Ici, un test d'incubation sur testa avec des embryons mutants déficients en GA cultivés sur un lit de testas mutants déficients en GA, incapables également de synthétiser l'ABA, est montré 80 heures après l'inhibition des graines ; comme prévu, les testas mutants ne parviennent pas à bloquer la croissance des embryons mutants déficients en GA.

De même, des embryons mutants déficients en GA cultivés sur un lit de testas de graines mutants déficients en GA et dépourvus du facteur deli RGL2 n'ont pas été capables d'empêcher la croissance des embryons mutants déficients en GA suite à cette procédure. D'autres méthodes, comme l'analyse de l'expression génique à partir de testas de graines et d'embryons disséqués de graines, peuvent être réalisées afin d'étudier les interactions génétiques en utilisant le bain de testa de graine. Ainsi, une fois la technique maîtrisée, elle devrait permettre aux chercheurs dans le domaine de la germination des graines d'explorer comment le testa de graine contrôle la croissance embryonnaire en réponse aux signaux environnementaux chez nos s.