Identification des bactéries métaboliquement actif dans l'intestin du généraliste Spodoptera littoralis Par ADN isotopes stables de palpage Utilisation ¹³ C-Glucose

L’objectif général de l’expérience suivante est de détailler une méthodologie efficace employée pour caractériser génétiquement phylo les bactéries métaboliquement actives dans l’intestin d’un insecte. Pour ce faire, l’insecte est d’abord alimenté en glucose marqué au C13 afin d’enrichir isotopiquement l’ADN des bactéries métaboliquement actives dans son intestin. L’étape suivante consiste à extraire l’ADN de la communauté bactérienne présente dans l’intestin.

La troisième étape consiste à séparer l’ADN de l’espèce métaboliquement active, qui a incorporé le C 13. L’ADN est ensuite identifié phylogénétiquement et quantifié pour les espèces présentes par pyroséquençage. Identifiant ainsi les espèces bactériennes métaboliquement actives constituant la communauté présente dans l’intestin de l’insecte.

Ainsi, l’intestin d’un organisme multicellulaire est une invention ingénieuse pour exploiter les capacités métaboliques des micro-organismes à se dissoudre ou à solubiliser une matière organique complexe afin qu’elle puisse enfin servir de nutriments à l’insecte hôte. Pour comprendre le système, nous devons d’abord analyser qui est là-bas, et ensuite qui a quelles activités métaboliques. Si nous disposons de ces données, nous pouvons reconstituer le flux de métabolites et de produits de dégradation entre les micro-organismes dégradants et l’insecte hôte.

Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’écologie microbienne, en particulier dans la manière dont ces microbes interagissent avec leur hôte. En ce sens, nous pourrions en savoir plus, clarifier et définir quelles sont les fonctions que ces organismes remplissent pour leur hôte. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des bactéries intestinales actives générales.

En suivant le glucose ucle, il peut également être effectué vers d’autres sources de carbone, telles que l’étiquetage du celllose pour identifier les bactéries actives impliquées dans le processus de digestion du nutriment ocrant. Maintenez les litres op, les œufs et les boîtes de Pétri ajoutent la température ambiante jusqu’à ce qu’ils éclosent. Ensuite, transférez les larves nouvellement écloses dans une boîte en plastique propre et élevez-les avec un régime artificiel à 23 à 25 degrés Celsius dans le cadre d’un régime de longues journées avec 16 heures d’éclairage et huit heures d’obscurité après quelques jours, transférez neuf à 15 larves saines du deuxième stade de la boîte d’élevage dans des boîtes de Pétri individuelles contenant du glucose frais en C 13.

Avec un régime artificiel enrichi, au moins trois répétitions de trois larves chacune sont nécessaires par traitement. Utilisez un régime artificiel fournissant la même quantité de glucose natif qu’une source alimentaire naturelle comme le coton pour nourrir le groupe témoin. Au cours des prochaines 24 heures.

Renouvelez fréquemment les régimes artificiels. Commencez par transférer les larves à l’aide d’une pince molle dans une mare d’eau distillée pour enlever les gros débris. Transférez ensuite dans une nouvelle parabole propre pour anesthésier et tuer les insectes.

Placez-les sur de la glace, puis baissez la température à moins cinq degrés Celsius dans une glacière. Ensuite, désinfectez les insectes morts avec de l’éthanol à 70 % et immergez-les dans du PBS pour la dissection. Les outils doivent également être nettoyés avec de l’éthanol à 70 %.

Commencez par des incisions dans la cuticule le long des côtés droit et gauche. Commencer par la tête et terminer par l’anus. Retirez tout l’exosquelette, les tubules maliens et le corps adipeux.

Remplacez ensuite le tampon avant d’ouvrir l’intestin par l’intestin isolé des autres tissus. Traitez l’intestin entier ou des sections pour l’intestin, l’intestin moyen ou l’intestin postérieur. En fonction de la question scientifique.

Transférez les tissus intestinaux sans PBS dans un petit tube stérile et conservez-les au congélateur. Avant l’extraction de l’ADN, faites sécher les échantillons à 45 degrés Celsius dans un concentrateur sous vide pendant 30 à 90 minutes, selon la taille du tissu. Ensuite, écrasez le tissu séché à l’aide d’un plastique stérile Pele pour extraire l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction de l’ADN du sol.

Déterminez ensuite la concentration de l’ADN final éludé à l’aide d’un spectrophotomètre. Vérifier une extraction réussie de l’ADN métagénomique microbien de l’intestin de l’insecte en préparant un test PCR diagnostique à l’aide d’amorces générales bactériennes 27 F et 1 492 R. Exécutez cinq microlitres de chaque produit PCR sur un gel agros à 1 % à 300 volts et 115 milliampères pendant environ 20 minutes.

La taille correcte des amplicons est de 1,5 kilobase. Tirez ensemble l’ADN extrait correspondant à chaque réplique expérimentale. Garder ceux avec et sans glucose C13 séparés.

Normalisez les concentrations d’ADN pour vous assurer que chaque échantillon contribue de manière égale à son pool. Une concentration finale de 500 à 5 000 nanogrammes d’ADN convient au processus d’ultracentrifugation. Vérifiez la concentration anticipée à l’aide du spectrophotomètre dans un tube à bouchon à vis stérile de 15 millilitres.

Configurez le support de dégradé. Combinez l’ADN quantifié avec 4,8 millilitres de solution de chlorure de césium. Complétez ensuite le volume avec six millilitres de tampon à gradient.

Transférez soigneusement les mélanges dans des tubes à ultracentrifuger de 5,1 millilitres. À l’aide d’une seringue et d’une aiguille, remplissez les tubes jusqu’à la base de leur cou et évitez de pomper ou de former des bulles d’air. Incluez au moins un dégradé vierge sans ADN dans chaque course.

Pour agir comme un gradient de référence, sélectionnez des paires de tubes et équilibrez-les à 10 milligrammes près. Appliquez un topper de tube sur chaque tube et assurez-vous qu’ils ne fuient pas en inversant le tube et en appliquant une pression modérée à la main. Utilisez un rotor presque vertical avec huit puits.

Scellez soigneusement les puits du rotor et chargez le rotor dans l’ultracentrifugeuse conformément aux instructions du fabricant. Faites tourner l’ADN à 50 000 tr/min à 20 degrés Celsius sous vide pendant 40 heures. Sélectionnez l’accélération maximale et la décélération sans freiner.

Deux jours plus tard, retirez délicatement les tubes du rotor de la centrifugeuse à l’aide d’une pince. Placez-les dans une grille sans perturber les gradients formés et traitez les tubes immédiatement. Équilibrez d’abord un HPLC à l’aide d’un débit de 850 microlitres par minute.

Fixez ensuite le tube de l’ultracentrifugeuse à un support de pince et percez le bas du tube avec une aiguille de calibre 23 d’un pouce attachée à une seringue. Percez donc soigneusement le haut du tube avec un mineur de contrôle pour éviter de perturber la forme, la pente et la pratique à l’avance pour assurer un mouvement PSA réussi. Ensuite, insérez l’aiguille attachée au tube de la pompe dans le haut du tube où il n’y a pas de liquide et collectez les gouttes du bas directement dans des tubes Micro fuge stériles de 1,5 millilitre collectez une fraction toutes les 30 secondes pour 425 microlitres par fraction.

Dans cet exemple, 12 fractions sont collectées à partir de chaque gradient. Ensuite, mesurez la densité de chaque fraction séparée sur une balance analytique. Procédez à la récupération de l’ADN et au pyroséquençage en consultant le protocole texte pendant 24 heures.

10 millimolaires de glucose C 13 ont été complétés dans le régime alimentaire de litres ssop. Larve. La même quantité de glucose normal a été ajoutée à la nourriture des insectes témoins. Ensuite, l’ADN a été extrait de la communauté bactérienne de l’intestin de l’insecte.

Sur un gel d’électrophorèse, une forte bande d’ADN génomique au sommet a confirmé une extraction d’ADN réussie, une PCR diagnostique. L’utilisation d’amorces universelles bactériennes a montré la présence d’ADN bactérien, un pyroséquençage quantitatif a été effectué directement sur les gradients SIP représentatifs pour révéler la lignée des espèces et leur abondance relative. Au total, 120 045 lectures de haute qualité ont été générées avec une durée moyenne de 404 OT.

Le profil de pyroséquençage a montré une abondance accrue de certaines espèces, y compris l’entérocoque et le panto, dans l’échantillon marqué par rapport à celui du groupe témoin. Par conséquent, ces bactéries sont considérées comme métaboliquement actives et méritent une étude plus approfondie. Ainsi, lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’impliquer un contrôle approprié dans l’analyse du CYP.

Ainsi, ce qui soustrairait l’impact de l’arrière-plan, la contamination dans le flash capillaire et garantirait que la diversité et l’abondance des bactéries apparaissant ou disparaissant ne sont pas des artefacts de la masse elle-même. En suivant cette procédure ou des méthodologies telles que l’hybridation in situ en fluorescence, on pourrait utiliser et réaliser afin de répondre à des questions supplémentaires. Dans ce cas, il s’occupera de la localisation et de la disposition des bactéries à l’intérieur de l’intestin de l’insecte.