2.15: Clonage moléculaire

Le clonage moléculaire est un ensemble de techniques utilisées pour insérer de l’ADN recombinant d’une source procaryote ou eucaryote dans un véhicule réplicatif tel que des plasmides ou des vecteurs viraux. Le clonage consiste à faire de nombreuses copies d’un fragment d’ADN d’intérêt, tel qu’un gène. Dans cette vidéo, vous découvrirez les différentes étapes du clonage moléculaire, comment mettre en place la procédure et les différentes applications de cette technique.

Au moins deux molécules d’ADN importantes sont nécessaires avant que le clonage ne commence. Tout d’abord, et c’est le plus important, vous avez besoin du fragment d’ADN que vous allez cloner, également connu sous le nom d’insert. Il peut provenir d’un procaryote, d’un eucaryote, d’un organisme éteint, ou il peut être créé artificiellement en laboratoire. En utilisant le clonage moléculaire, nous pouvons en apprendre davantage sur la fonction d’un gène particulier.

Deuxièmement, vous avez besoin d’un vecteur. Un vecteur est un ADN plasmidique utilisé comme outil en biologie moléculaire pour faire plus de copies ou produire une protéine à partir d’un certain gène. Les plasmides sont un exemple de vecteur et sont de l’ADN circulaire, extrachromosomique, qui est répliqué par des bactéries.

Un plasmide a généralement un site de clonage multiple ou MCS, cette zone contient des sites de reconnaissance pour différentes endonucléases de restriction, également appelées enzymes de restriction. Différents inserts peuvent être incorporés dans le plasmide par une technique appelée ligature. Le vecteur plasmidique contient également une origine de réplication, ce qui lui permet d’être répliqué dans les bactéries. De plus, le plasmide possède un gène antibiotique. Si les bactéries incorporent le plasmide, il survivra dans un milieu contenant l’antibiotique. Cela permet de sélectionner les bactéries qui ont été transformées avec succès.

L’insert et le vecteur sont clonés dans un organisme de cellule hôte, le plus couramment utilisé dans le clonage moléculaire est E. coli. E. coli se développe rapidement, est largement disponible et possède de nombreux vecteurs de clonage différents produits commercialement. Les eucaryotes, comme les levures, peuvent également être utilisés comme organismes hôtes pour les vecteurs.

La première étape de la procédure générale de clonage moléculaire consiste à obtenir l’insert souhaité, qui peut être dérivé de l’ADN ou de l’ARNm de n’importe quel type de cellule. Le vecteur optimal et son organisme hôte sont ensuite choisis en fonction du type d’insert et de ce qui sera finalement fait avec celui-ci. Une méthode basée sur la réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, est souvent utilisée pour reproduire l’insert.

Ensuite, à l’aide d’une série de réactions enzymatiques, l’insert et le digestat sont assemblés et introduits dans l’organisme hôte pour une réplication de masse. Les vecteurs répliqués sont purifiés à partir de bactéries et, après une digestion par restriction, analysés sur un gel. Les fragments purifiés au gel sont ensuite envoyés pour séquençage afin de vérifier que l’encart est le fragment d’ADN souhaité.

Examinons un peu plus en détail comment le clonage moléculaire est effectué. Avant de commencer, vous voudrez planifier votre stratégie de clonage, avant de faire toute tentative de clonage sur le banc. Par exemple, n’importe quel vecteur plasmidique donné vous fournira un nombre fini de sites de restriction pour incorporer l’insert via le site de clonage multiple. Vous devrez choisir des sites de restriction qui ne se trouvent pas dans votre encart afin de ne pas le fendre. Vous pourriez vous retrouver dans une situation où vous êtes obligé de joindre un fragment d’extrémité émoussé à un fragment qui a un surplomb. Si c’est le cas, l’utilisation du fragment klenow pour mettre en place une ligature d’extrémité émoussée pourrait être votre seule option pour obtenir l’insert dans le vecteur souhaité. Comprendre les différents outils de clonage moléculaire à votre disposition, ainsi que l’élaboration d’une stratégie minutieuse avant de commencer le clonage peuvent être un immense gain de temps.

La source d’ADN pour le clonage moléculaire peut être isolée à partir de presque n’importe quel type d’échantillon de cellule ou de tissu grâce à des techniques d’extraction simples. Une fois isolée, la PCR peut être utilisée pour amplifier l’insert.

Une fois l’insert amplifié, celui-ci et le vecteur sont digérés par des enzymes de restriction, également appelées endonucléases de restriction.

Une fois digérés, l’insert et le vecteur peuvent être exécutés sur un gel et purifiés par un processus appelé purification par gel. En ce qui concerne le vecteur, cette étape aidera à purifier le plasmide linéarisé à partir du plasmide non coupé, qui a tendance à apparaître comme un frottis de poids moléculaire élevé sur un gel.

Après la purification par gel des digestions, l’insert est ligaturé ou lié au plasmide, via une enzyme appelée ADN ligase.

D’une manière générale, c’est toujours une bonne idée de mettre en place des ligatures, de sorte que le rapport entre l’insert et le vecteur soit de 3 pour 1, ce qui garantit que seule une petite quantité de vecteur s’auto-liguera. Une fois que la ligature a été installée sur de la glace, elle est incubée entre 14 et 25 ? C de 1 heure à toute la nuit.

Ensuite, la transformation est effectuée pour introduire le vecteur plasmidique dans l’hôte qui le répliquera.

Après la transformation, les bactéries sont placées sur des plaques de gélose avec un antibiotique et incubées pendant la nuit à 37°C. Parce que le plasimidé contient un gène de résistance aux antibiotiques, une transformation réussie produira des colonies bactériennes lorsqu’elle est cultivée sur des plaques de gélose en présence d’antibiotiques. Les colonies individuelles peuvent ensuite être prélevées sur la plaque transformée, placées dans un milieu de croissance liquide dans des tubes numérotés et placées dans un incubateur à agitation pour l’expansion. Un petit volume de culture liquide est ajouté à une plaque de gélose numérotée, tandis que le reste de la culture passe à la purification plasmidique. Le schéma de numérotation qui désigne l’identité des colonies bactériennes à partir desquelles les plasmides seront finalement purifiés est maintenu tout au long du processus de purification des plasmides.

Un échantillon de plasmide purifié est ensuite coupé avec des enzymes de restriction. La digestion est ensuite chargée et exécutée sur le gel afin de vérifier la présence d’insert, ce qui permettra de vérifier que la colonie bactérienne a été transformée avec un plasmide contenant un insert et non un plasmide auto-ligaturé. Les bactéries dont il a été vérifié qu’elles ont été transformées avec un plasmide contenant un insert sont expansées pour une purification ultérieure du plasmide. Le séquençage est utilisé comme étape de vérification finale pour confirmer que votre gène d’intérêt a été cloné.

Le clonage moléculaire peut être utilisé pour un nombre presque illimité d’applications. Par exemple, lorsqu’une matrice d’ARNm est transcrite en sens inverse pour former de l’ADNc, ou de l’ADN complémentaire, par une enzyme appelée transcriptase inverse, puis que la PCR est utilisée pour amplifier l’ADNc, le clonage moléculaire peut être utilisé pour créer une banque d’ADNc ? Une bibliothèque de tous les gènes exprimés par un type de cellule donné.

Le clonage moléculaire peut également être utilisé pour prendre une série de gènes, ou un groupe de gènes d’une souche bactérienne, les réorganiser en plasmides qui sont transformés en une autre souche, de sorte qu’une voie de biosynthèse entière peut être recréée pour produire une molécule complexe.

Grâce au clonage moléculaire, une banque de mutants peut être générée en exprimant un plasmide cible dans une souche bactérienne spéciale qui utilise une polymérase sujette aux erreurs lorsqu’elle est cultivée à certaines températures. Les mutations peuvent être caractérisées par séquençage. Les bactéries transformées avec des gènes mutants peuvent ensuite être testées avec différents médicaments ou produits chimiques pour voir quelles colonies bactériennes ont évolué pour avoir une résistance aux médicaments.

Grâce au clonage moléculaire, les gènes rapporteurs peuvent être incorporés dans les plasmides d’ADN, un gène rapporteur courant est la protéine fluorescente verte ou GFP, qui émet une fluorescence verte lorsqu’elle est exposée à la lumière UV. Un gène rapporteur peut également être inséré dans un alphavirus pour montrer l’infection chez les moustiques et la transmissibilité dans les cellules.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le clonage moléculaire. Vous devriez maintenant comprendre comment fonctionne le clonage moléculaire et comment la technique peut être utilisée en biologie moléculaire. Comme toujours, merci d’avoir regardé !