Microinjection plaies dosage et In vivo Localisation des épidermique plaies Reporters réponse dans Drosophila Embryons.

L’objectif global de cette procédure est de visualiser in vivo le rapporteur de la réponse de la plaie épidermique dans l’embryon de drosophile. Ceci est accompli en collectant d’abord le stade de développement où l’activité du rapporteur peut être détectée de manière cohérente. La deuxième étape de la procédure consiste à perforer l’embryon à l’aide d’une aiguille de verre et d’un appareil de micro-injection.

La troisième étape consiste à anesthésier l’embryon pour visualiser le rapporteur. La dernière étape consiste à valider la localisation du rapporteur en détectant le modèle d’expression des sondes d’ARN. En fin de compte, les résultats peuvent montrer l’activation spécifique du rapporteur de la réponse de la plaie épidermique uniquement dans les cellules entourant le site de la lésion par perforation grâce à la microscopie confocale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes qui impliquent l’examen de la fermeture de la plaie est que nous pouvons voir dans les embryons vivants l’expression génique qui est déclenchée par la blessure par perforation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réparation tissulaire, telles que la façon dont les cellules entourant une blessure régulent une réponse immédiate de la plaie pour favoriser la réparation. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie ou au diagnostic de la régénération tissulaire, car la régulation de la réponse de la plaie est l’étape initiale.

La cicatrisation des plaies peut être dosée à n’importe quel stade de développement. Cependant, au stade 17, la cuticule est trop mature. Les signaleurs de blessures connus ne seront pas activés.

Donc, pour le démontrer, les stades 15 à 16 seront blessés pour récolter des embryons. Ramassez des mouches adultes âgées de deux à trois jours, 50 femelles et 25 mâles. Transférez-les dans une cage de collecte d’embryons avec une assiette fraîche de jus de pomme, de gélose et une cuillerée de pâte de levure.

Rangez la cage à 25 degrés Celsius chaque matin pendant les trois prochains jours. Remplacez l’assiette par une assiette neuve. L’après-midi du troisième jour, laissez les œufs s’accumuler sur une assiette fraîche pendant deux heures.

Conservez cette assiette pendant 14 heures à 25 degrés Celsius. Une ponte de deux heures devrait produire environ 200 embryons le lendemain. Ajoutez quelques millilitres d’eau dans l’assiette et remuez-la doucement.

Ensuite, à l’aide d’un pinceau, transférez l’eau et les embryons de la plaque dans un panier en maille de nylon dans un tube de collecte. Préparez maintenant un bain d’eau de Javel peu profond et faites-y tremper les embryons pendant deux minutes. Cette étape permet d’enlever les CORs, les œufs.

Coquille : faites tourner le bain plusieurs fois pour éviter que les embryons ne s’agglutinent. Après deux minutes, rincez les embryons à l’eau courante et rincez la boîte de Pétri pendant cinq secondes chacun. Transférez ensuite le panier d’embryons sur une serviette en papier pour sécher les embryons.

Ensuite, à l’aide d’une aiguille de dissection, déplacez environ 50 embryons du maillage vers une plaque de gélose faite avec un colorant alimentaire vert. Le colorant sert à augmenter la visibilité des œufs de genou. Sous une lunette de dissection, faites deux rangées parallèles d’embryons distants d’environ cinq millimètres.

Positionnez les rangées à distance de la largeur d’un embryon pour permettre l’échange gazeux. Ensuite, appuyez soigneusement une lame avec du ruban adhésif double sur les embryons de manière à ce que les rangées soient perpendiculaires à la longueur de la lame. Pour réduire leur pression interne, laissez les embryons sécher à l’air.

De cette façon, ils n’éclateront pas lorsqu’ils seront blessés. Après 25 minutes, la première lame préparée doit être sèche. Maintenant, couvrez les embryons avec deux à trois gouttes d’huile de carbone halo pour éviter une déshydratation supplémentaire et procédez immédiatement à la blessure des embryons secs.

Placez la lame d’embryon dans la platine du microscope d’injection. Trouvez les embryons dans le champ de vision et entraînez-vous à déplacer la platine du microscope inversé. Concentrez-vous maintenant sur le plan médian de l’embryon le long de l’axe ventral dorsal et amenez l’embryon supérieur de la première rangée alignée dans le champ de vision.

Ensuite, placez et fixez soigneusement une aiguille tirée dans le porte-aiguille. Utilisez le micromanipulateur pour déplacer l’aiguille vers le bas jusqu’à la lame. Alignez l’aiguille avec l’embryon dans le même plan focal.

Maintenant, n’ajustez plus le manipulateur microm. Déplacez maintenant la scène pour percer l’embryon de part en part. Passez ensuite à l’embryon suivant dans la rangée.

Après avoir blessé la première rangée, déplacez complètement l’aiguille vers le haut et éloignez-vous de la scène. Ensuite, faites pivoter la lame et continuez à percer les embryons dans la deuxième rangée. Une fois tous blessés, les embryons peuvent être immédiatement fixés pour l’hybridation à l’intérieur de vous ou la coloration des anticorps.

Pour examiner les rapporteurs fluorescents, attendez quatre à six heures et transférez l’embryon sur un nouveau sur la nouvelle lame, placez des perles de verre autour des embryons. Ajoutez ensuite quelques gouttes de 50 % d’un phénoxy, deux de propanol, qui est un anesthésique, et placez une lamelle sur les embryons pour les micro-injections. Chargez l’aiguille d’injection par l’arrière avec un microlitre de solution chimique et un colorant, tel que du peroxyde d’hydrogène 0,6 molaire.

Permettre à l’action capillaire d’aspirer la solution chimique vers la pointe de l’aiguille. Ensuite, cassez la pointe de l’aiguille contre le bord d’une lamelle dans un mélange d’huile de carbone halo. Tout d’abord, faites la mise au point sur l’aiguille montée avec le bord de la lamelle de recouvrement inclinée à pas tout à fait à 90 degrés.

Ensuite, déplacez doucement le bord du couvercle sur la pointe de l’aiguille jusqu’à ce qu’il se brise. Ensuite, appliquez une pression sur l’appareil de micro-injection et vérifiez que la solution s’écoule de l’aiguille. S’il ne coule pas, ouvrez un peu plus l’aiguille.

Maintenant, effectuez la même procédure que celle utilisée pour perforer les embryons uniquement. Cette fois, micro-injectez la solution en même temps que la ponction. Idéalement, injectez 10 nanolitres.

Si trop de solution est injectée dans l’embryon, la membrane Vitale éclatera tout en suivant la procédure de fixation dans le protocole de texte, portez une attention particulière aux étapes suivantes. Utilisez une pipette en verre, et non en plastique, pour rincer l’heptane sur la lame et utilisez du verre pour faire tourbillonner les embryons au centre de la boîte de Pétri en verre. Plus tard, secouez les embryons dans un fixateur pendant 25 minutes à 220 à 230 tr/min.

Après avoir secoué, laissez éclater les bulles à l’interface avant d’éliminer complètement la phase aqueuse inférieure. Veillez également à ne pas arracher les embryons. Après avoir ajouté le méthanol, les embryons blessés doivent se regrouper à l’interface plus tard, étaler les embryons le long de la surface de la plaque comme ça, et les transférer sur une lame de verre à double ruban adhésif comme ça.

Ensuite, poussez soigneusement les embryons avec l’aiguille de dissection pour faire éclater la membrane Vitale et procédez à la déshydratation. Des mouches de type sauvage ont été transformées avec des rapporteurs fluorescents fusionnés à des amplificateurs de décarboxylase DOPA ou de tyrosine hydroxylase et soumises au test décrit. En fond clair, il était possible de voir le site de la plaie tandis que sous éclairage de fluorescence, il était possible de voir l’activité du rapporteur de la plaie DCD.

Le rapporteur de la tyrosine hydroxylase a montré un résultat similaire. Les deux images ont été collectées à l’aide d’un microscope confocal Leica SP Two avec un objectif 20x. La procédure a été réalisée dans une perte de fonction flux deux mutant.

Contexte, l’activité du rapporteur de la décarboxylase DOPA a été étendue dans toutes les cellules épidermiques dans le gain de fonction du flux de deux mutants générés avec une expression ubiquitaire dans toutes les cellules. L’inhibition du rapporteur a été notée dans toutes les cellules de l’épiderme. Ensuite, les embryons ont été simultanément blessés et injectés avec un composé solubilisé et du peroxyde d’hydrogène à colorant bleu d’indine et une activité rapporteuse de la DOPA décarboxylase expansée à l’eau dans les cellules épidermiques, ainsi qu’une injection de méthyl B cyclodextrine dans de l’hydroxyde de sodium en utilisant l’hybridation à l’intérieur de l’U.

L’activation transcriptionnelle des gènes de réponse à la plaie a été testée par dosage de la DOPA décarboxylase endogène. L’expression de l’ARN s’est avérée localisée autour du site de la plaie et, bien sûr, la tyrosine hydroxylase, les transcrits de l’ARN se sont également accumulés au site de la plaie. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 60 minutes si elle est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas passer trop de temps à aligner les embryons et d’aller de l’avant avec les prochaines étapes de la procédure.