Name: Microinjection plaies dosage et In vivo Localisation des épidermique plaies Reporters réponse dans Drosophila Embryons. (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Apprenez la microinjection et la localisation de reporters de réponse aux plaies épidermiques chez les embryons de Drosophila. Cette méthode permet de visualiser l'expression génique en temps réel pour étudier la cicatrisation tissulaire.

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Ce protocole a été élaboré en collaboration avec les anciens membres du laboratoire McGinnis, Kim A. Mace et Joseph C. Pearson. Nous remercions les efforts continus de la drosophile Stock Center Bloomington pour leur travail pour organiser et distribuer les stocks de valeur. Ce travail a été soutenu par un financement de la National Institutes of Health (R01 GM077197 et K12 GM68524) et la famille de Herbert Stern. MTJ est actuellement soutenu par Grant Nombre 5G12RR003060-26 du National Center for Research Resources et Grant Number 8G12MD7603-27 de l&#39;Institut national sur la santé des minorités et les disparités en santé. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national de la minorité de la santé et les disparités en santé ou les National Institutes of Health.

Le protocole de la plaie embryonnaire chez la drosophile peut se résumer en cinq étapes: (1) l&#39;embryon, de la collection (2) Préparation d&#39;embryons (3) Embryon Blessant, (4) l&#39;embryon microinjection, et (5) d&#39;embryons de fixation. Une. Embryon Collection <ol><li> Recueillir les mouches adultes, 2-3 jours après eclosing, ajouter 50 femmes et 25 hommes pour une cage de collecte d&#39;embryons. </li><li> Placez une gélose frais de jus de pomme ainsi que la plaque de levure chaque matin pendant 3 jours. Notes: Pour la collecte des embryons optimale, le cycle des mouches sur un horaire de 12 heures diurne dans un incubateur à 25 ° C (05:00 lumières &quot;ON&quot; et 17h00 les lumières &quot;OFF&quot;); mouches femelles réagissent aux changements dans le cycle de lumière et déposera grandes quantités d&#39;œufs pendant un interrupteur de feux &quot;ON&quot; pour les lumières &quot;OFF&quot; 10,11. </li><li> Dans l&#39;après-midi du Jour-3, placer un jus de pomme frais, plus la levure plaque de gélose sur la cage et recueillir des embryons pendant 2 heures. Placez une nouvelle plaque de levure sur la cage et enregistrer le2 plaque de collection de h. </li><li> Conservez la plaque de collection pour un 14 heures supplémentaires à 25 ° C à l&#39;âge des embryons. Notes: La cicatrisation peut être dosés à n&#39;importe quel stade de développement de la drosophile, les journalistes de la transcription induite plaies décrites dans ce document ont une activité optimale entre les étapes 15 à 16 déc. À la fin de l&#39;étape 17, l&#39;embryon est trop vieux pour percer facilement la cuticule de maturation et d&#39;activer efficacement les journalistes de la plaie ou de détecter la transcription induite par blessure. Pour laisser le temps à la collecte et l&#39;heure blessures se produisent pendant les heures de pointe de laboratoire, nous suivons un programme de collecte d&#39;embryons pendant 2 heures (16h00-18h00), échanger la plaque de collection avec une nouvelle plaque à 18h00, l&#39;âge la plaque de recouvrement à 25 ° C pendant 14 heures (la nuit), et enroulé les embryons à 08h00 (le lendemain). </li></ol> 2. Préparation d&#39;embryons Notes: Ce protocole comprend l&#39;utilisation de nombreux outils et objets tranchants ou faites de glass. Gérer tous les objets tranchants et les objets en verre avec soin pour éviter les blessures. <ol><li> Retirez délicatement les embryons à partir de plaques de collecte avec un pinceau en ajoutant 2-3 ml d&#39;eau à la plaque et tourbillonnant. Transférer de l&#39;eau et d&#39;embryons de l&#39;assiette au filet de nylon et le tube collecteur. </li><li> Ajouter 4-5 ml d&#39;eau de Javel à la coiffe d&#39;une Pétri de plat de plastique et laisser tremper l&#39;extrémité couverte de maille du tube contenant les embryons dans l&#39;eau de Javel pendant 2 min, ce qui supprime la coquille externe de l&#39;embryon. Faites tourner manuellement le tube de collecte une couple de fois pour empêcher les embryons de l&#39;agglutination dans l&#39;eau de Javel. Rincez embryons 10x de l&#39;eau et sécher le tube de collection de maille couverte contenant les embryons dechorionated sur une serviette en papier. </li><li> Utiliser une aiguille de dissection de transférer ~ 50 embryons de maille de nylon pour une plaque de gélose. Nous ajoutons de colorant alimentaire vert à la plaque de gélose pour ajouter du contraste et de l&#39;aide à l&#39;alignement de l&#39;embryon. Sous un microscope de dissection, faire deux rangées parallèles de ~ 25 embryons, l&#39;alignement de la Embryos sur le coulisseau de sorte qu&#39;ils seront à angles droits par rapport à l&#39;aiguille de ponction sur l&#39;appareil de micro-injection. Laisser un peu d&#39;espace (environ 1 longueur de l&#39;embryon) entre les embryons à des fins d&#39;échange de gaz. Les deux rangées parallèles devraient être d&#39;environ 5 mm. </li><li> Placez une lame à double bande de bâton sur des embryons alignés et appuyez délicatement sur la lame de transférer les embryons de la plaque verte à la diapositive. Puis sécher à l&#39;air les embryons ~ 25 min pour réduire la pression interne sur l&#39;embryon et empêcher une explosion quand blessant. </li><li> Placer 2-3 gouttes d&#39;halocarbures mélange d&#39;huile sur les embryons pour éviter une déshydratation. </li></ol> 3. Embryon Blessant <ol><li> Placer la lame d&#39;embryons dans la platine du microscope par injection. Trouver les embryons dans le champ de vision et la pratique de déplacer le stade du microscope inversé. Notes: Avant de travailler avec l&#39;aiguille, se concentrer sur plan médian de l&#39;embryon le long de l&#39;axe dorso-ventral. Pour permettre blessure efficace de laembryons alignés, commencent blessant la ligne plus proche de l&#39;appareil de l&#39;aiguille. Déplacez le stade pour apporter le haut de la ligne d&#39;embryons alignés dans le champ de vision. </li><li> Placez délicatement et garantir une aiguille tiré dans le porte-aiguille. Utilisez le micromanipulateur pour déplacer l&#39;aiguille vers le bas vers la diapositive. Aligner l&#39;aiguille avec l&#39;embryon, dans le même plan focal. Une fois que l&#39;aiguille est en discussion avec l&#39;embryon, ne déplacez pas l&#39;aiguille avec le micromanipulateur. </li><li> Déplacez le stade de l&#39;embryon percer de part en part, puis passer à la prochaine embryon dans la rangée. Lorsque vous avez terminé blessant la première ligne, utilisez le micromanipulateur pour déplacer l&#39;aiguille complètement et loin de la scène avant de passer la lame; tourner manuellement la lame de 180 ° et la plaie de la deuxième rangée. </li><li> Stocker les embryons dans l&#39;huile d&#39;halocarbures à la température ambiante et de procéder à la fixation embryon si cela hybridation in situ ou la coloration des anticorps dans (voir procédure de l&#39;étape 5). Sinon, stocker les embryons pour 4-6 heuresdans l&#39;huile d&#39;halocarbures et de procéder à des plaies visualisation rapporteur fluorescent transcription (de résultats représentatifs). Remarques: Pour la visualisation du rapporteur fluorescent, nous anesthésier les embryons à l&#39;aide de 50% de 1-phénoxy-2-propanol 13. Les embryons sont enlevés de l&#39;huile d&#39;hydrocarbure halogéné et on les place sur une nouvelle diapositive. Nous mettons perles de verre autour des embryons, ajouter quelques gouttes de l&#39;anesthésie, et placer un morceau de couverture sur les embryons. </li></ol> 4. Embryon microinjection Notes: L&#39;appareil de micro-injection que nous utilisons dans le protocole n&#39;est pas automatisé de livrer le volume spécifique pendant le test. Nous ajoutons un colorant à la solution de visualiser la micro-injection et d&#39;essayer de normaliser le volume livré. Si trop de solution est injectée dans l&#39;embryon, la membrane vitelline va éclater. <ol><li> aiguille de chargement à l&#39;arrière avec 1 pl de solution chimique, plus colorant (par exemple 0,6 MH 2 O 2). Autoriser capillairel&#39;action de tirer de la solution chimique à la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Pour casser une aiguille, placez une lamelle à un angle sur une lame et recouvrir le bord avec halocarbures mélange d&#39;huile. Apportez de l&#39;aiguille monté en discussion avec le bord de la lamelle inclinée et déplacez doucement bord lamelle sur la pointe de l&#39;aiguille jusqu&#39;à cassé. Appliquer une pression sur un appareil de micro-injection et vérifier que la solution chimique, plus colorant coule l&#39;aiguille. </li><li> Placez la diapositive contenant les embryons alignés sur la platine du microscope. Passez à concentrer l&#39;embryon et l&#39;aiguille dans le même plan. Simultanément percer et solution micro-injection chimique, plus teindre dans chaque embryon. Notes: aiguilles bouchés se produisent fréquemment; briser une nouvelle aiguille pour éviter la micro-injection incomplète. Une pointe d&#39;aiguille émoussée ne blesse le plus proprement une pointe de l&#39;aiguille inclinée. Réglage de la lamelle à un non-angle de 90 ° pendant la rupture est optimale pour produire une pointe de l&#39;aiguille inclinée. </li></ol> 5. Formaldéhyde Fixation Note: Les produits chimiques utilisés dans cette fixation drosophile sont nuisibles. Utiliser un équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité) lors de la manipulation des produits chimiques. Suivez les directives institutionnelles individuelles pour l&#39;élimination des produits chimiques réglementés. <ol><li> Après la blessure, attendre 15, 30, 60, ou plus de minutes pour l&#39;activation transcriptionnelle des gènes induite par la plaie de se produire. Pour supprimer des embryons à partir de diapositives d&#39;injection, égouttez les soigneusement le mélange d&#39;huile d&#39;halocarbures de la glisse, pencher la lame contre un rack et épongez la fin avec un Kimwipe. </li><li> Utiliser une pipette en verre pour rincer heptane sur la lame et laver le liquide de rinçage dans une boîte de Pétri en verre. Heptane va dissoudre la bande et de libérer les embryons. Continuer à rincer jusqu&#39;à ce que tous les embryons sont enlevés de la diapositive. Passez à la diapositive suivante, jusqu&#39;à ce que tous les embryons sont prélevés à partir de diapositives. </li><li> Transférer la heptane associé à une solution de l&#39;embryon de la boîte de verre dans 20 ml de sciencentillation flacon. Agiter le flacon pendant 2-3 min, retirer la heptane et ajouter 5 ml d&#39;heptane frais. </li><li> Ajouter 5 ml de solution fraîche, de fixation (voir la liste des réactifs pour la recette). Boucher le flacon et le joindre à une plate-forme agitation. Agiter le flacon contenant les embryons de 25 min à 220-230 rpm. </li><li> Après agitation, laisser les bulles à la pop de l&#39;interface. Supprimer complètement la phase aqueuse inférieure avec une pipette, évitant tirant les embryons. La couche inférieure est constituée de la solution de fixation et doit être éliminé correctement. </li><li> Ajouter 5 ml de méthanol, boucher le flacon et agiter vigoureusement à la main pendant 20-30 secondes, tourbillon et le placer sur le banc. Embryons blessés resteront à l&#39;interphase et ne seront pas couler au fond. Notes: Après fixation de la membrane vitelline d&#39;un embryon non lésée sera normalement de salve au cours de l&#39;étape de déshydratation avec du méthanol. Cependant, la membrane vitelline en un embryon blessé est déjà rompue et l&#39;étape de déshydratation ne supprime pas la memb vitellinerane. Main-devitellinzation est nécessaire pour achever le protocole de fixation. </li><li> Retirez délicatement la couche d&#39;heptane dessus et ajoutez 5 ml de méthanol frais alors. Agiter le flacon et les embryons doivent couler. </li><li> Retirer la solution de methanol plus embryon avec une pipette de transfert en verre et recueillir dans un tube de collecte de maille de nylon dans un plat en verre. </li><li> Retirez le méthanol et rincer les embryons avec une solution PBS 1x. </li><li> Transférer les embryons à partir de la maille de nylon pour une plaque de jus de pomme. Etaler les embryons le long de la surface de la plaque. </li><li> Transférer les embryons sur une lame de verre à double bande de bâton. Couvrir les embryons avec 1x PBS. Remarques: Les embryons ont tendance à s&#39;agglomérer à cause de la membrane vitelline. L&#39;utilisation d&#39;un jus de pomme lieu permet une séparation rapide des embryons agglomérées. Les embryons doivent être retirés de la plaque et transférées sur une lame de verre de l&#39;adhésif double face car les embryons s&#39;enfoncent dans la plaque de gélose lorsqu&#39;une force est appliquée pour enlever l&#39;embryon de l&#39;membrane vitelline. </li><li> Poussez doucement les embryons avec une aiguille de dissection de &quot;pop&quot; de la membrane vitelline. L&#39;embryon doit couler dans le PBS. </li><li> Utiliser une pipette en verre pour transférer l&#39;1x PBS plus des embryons à un tube de 1,5 ml. Rincer les embryons avec PBS 1x et conserver à 4 ° C. Passez à déshydrater les embryons en utilisant un mélange éthanol: la série de PBS et continuer avec l&#39;hybridation in situ ou protocole immunolocalisation 14. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Une réponse de régulation transcriptionnelle immédiate aux signaux externes permet aux cellules de coordonner une réponse localisée à des stimuli extracellulaires, qui peuvent inclure le stress, les dommages, ou d&#39;infection. Le contrôle abusif d&#39;une réponse localisée peut avoir des effets néfastes sur les cellules voisines, ainsi que d&#39;un gaspillage de ressources pour réparer le préjudice. L&#39;embryon de drosophile est un excellent système pour mener des expériences de cicatrisation des plaies de base dans un à entretenir facile organisme modèle peu coûteux et. Le potentiel de collaborations entre la recherche dans d&#39;autres organismes modèles et Drosophila offre une occasion unique d&#39;explorer de nombreuses questions biologiques. Une autre technique de reporters de la plaie est la combinaison génétique des mutants de milieux, en fournissant une méthode efficace pour tester la contribution de nouveaux gènes à l&#39;activation de la voie de réponse épidermique de la plaie. Nous avons épidermiques journalistes transcription induite plaies avDISPONIBLES à la fois sur la 2 ème et 3 ème chromosomes 5. Dans cette étude, nous utilisons SAMU et des systèmes de GAL4 de la surexpression 16. Pour les études avec des allèles mutants létaux nous déterminons le fond génétique utilisant un chromosome d&#39;équilibrage fluorescent, par exemple Kruppel-GFP 17. Nous avons analysé la localisation blessure de journaliste dans plusieurs fonds génétiques (tableau 1). Une modification possible de la technique est de combiner la micro-injection et blessures. La micro-injection peut être utilisée pour introduire une solution chimique dans l&#39;embryon. Plusieurs composés chimiques ont été testés et ont été trouvés à réglementer l&#39;activité des journalistes épidermique de la plaie 9. Cette méthode de la blessure et la micro-injection simultanée peut être utile d&#39;augmenter le nombre de cellules dans l&#39;embryon de drosophile qui répondent un signal de la plaie et peut être directement utilisé pour surveiller les changements d&#39;expression génique après la blessure 18. Une application future de la technique de micro-injection sera de tester de nouveaux produits chimiques pour la régulation de la réponse épidermique de la plaie. Drosophile comme système modèle pour les études génétiques propose une large gamme de protocoles simples pour répondre efficacement à des questions complexes. Les récents rapports sur la faisabilité des techniques de Drosophila souligne l&#39;utilisation de la migration des hémocytes 19 et l&#39;infection de guêpe parasite 20 comme un moyen d&#39;élargir encore davantage l&#39;impact de la communauté de recherche drosophile. En plus des études de cicatrisation des plaies, la drosophile est un modèle classique pour la régénération avec le système de disque imaginai 21,22. Les progrès combinés à imaginaux études de régénération de disque et ponction / microinjection blessure fournit un excellent système pour découvrir les composants bien conservées de la réparation des tissus.

La manipulation d&#39;embryons de Drosophila en utilisant une technique de micro-injection est un dosage bien établi 1. L&#39;importance de la méthode épidermique plaie réponse rapporteuse est de combiner le protocole pour la perforation / une micro-injection avec les reporters fluorescents et de visualiser in vivo une réponse à une lésion de l&#39;épiderme dans les embryons de Drosophila. Le but de cette méthode est de permettre à un plus large éventail de scientifiques à utiliser la drosophile comme un outil pour étudier les processus qui régulent la réponse transcriptionnelle des blessures épidermique de ponction. L&#39;épiderme seule couche chez la drosophile fournit un système simple à étudier une réponse épidermique de la plaie après une blessure perforante 2. L&#39;embryon de drosophile est un système de modèle robuste pour disséquer génétiquement les stades de la cicatrisation des plaies, y compris la réponse des plaies, l&#39;inflammation et la réépithélialisation 3. C&#39;est en partie parce que beaucoup ou la plupart des mutants zygotiques survivent à la fin de embryogenesest et de développer des barrières épidermiques, même si la structuration de développement va profondément mal. La caractérisation précédente d&#39;un facteur de transcription tête bien conservée grenue (Grh), identifiés que les gènes Grh-cibles Dopa décarboxylase (DDC) et la tyrosine hydroxylase (exemple) sont la transcription activés autour des sites de lésion 4. Drosophile comme un organisme modèle pour la réponse de la plaie fournit une ligne complémentaire d&#39;enquête pour faire progresser les études chez les mammifères cicatrisation 5. Des études ultérieures ont identifié des gènes supplémentaires induites par la plaie de drosophile et développé une «boîte à outils» de nombreux journalistes de la plaie fluorescents pour suivre in vivo épidermique réponse dans la plaie pour nettoyer blessant 6. Des rapports récents sur la réglementation de la guérison des plaies chez la drosophile ont porté sur le phénotype de fermeture de plaie, permettant la découverte de nombreuses voies de régulation la migration des cellules 7,8. Avec l&#39;analyse de l&#39;journalistes de la plaie fluorescentes, nos études ont identifié une nouvelle série de gènes nécessaires à l&#39;expression localisée de l&#39;épiderme inductibles par une blessure gènes 9. L&#39;un des mérites de la méthode réaction à la blessure de journaliste, c&#39;est que les résultats fournissent plus de perspicacité dans un mécanisme de comment les signaux sont transduction du site de la lésion aux cellules voisines. Cependant, un des inconvénients de la méthode réaction à la blessure de journaliste, c&#39;est que les résultats ne renvoient directement à des phénotypes pas dans la guérison ou la cicatrisation des plaies. Utilisation plus large du protocole piqûre propre dans les écrans génétiques et chimiques permettra de nouveaux régulateurs de la réponse transcriptionnelle à épidermique blessant être identifiés et d&#39;autres la traduction de cicatrisation des plaies découvertes dans les modèles de mammifères de traitements de blessures.

<table><tbody><tr><td>levure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>jus de pomme</td><td>Gélose générique</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>eau de Javel</td><td>Huile générique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aux halocarbures, 700 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>huile aux halocarbures, 27 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1- phénoxy-2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>peroxyde d’hydrogène</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>méthyl-&bêta ;-cyclodextrine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>bleu de toluidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>formaldéhyde, 16 %</td> <td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td></td></tr><tr><td>heptane</td> chimique toxique <td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td>produit chimique toxique</td></tr><tr><td>méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>produit chimique toxique</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>RNase libre H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila incubateur</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>cage à mouches</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>tube de prélèvement d’embryons</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>boîte de Pétri en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>ruban adhésif Générique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinceau</td><td>Générique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aiguille de dissection</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965A</td><td>objet pointu</td></tr><tr><td>lamelle en verre</td><td>Thermo Scientific</td><td>3306</td> lame <td></td></tr><tr><td>de microscope</td> objet pointu <td>Thermo Scientific</td><td>4445</td> microscope de dissection <td>d’objet pointu</td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr> aiguille <tr><td>capillaire</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>objet</td></tr> <tr>pointu<td>extracteur d’aiguille</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>porte-aiguille de micro-injection</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>microscope inversé</td><td>Carl Zeiss</td><td>Primo-Vert</td><td></td></tr><tr><td>en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>objet pointu</td></tr><tr><td>en verre Pipette Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-063-172</td><td></td></tr><tr><td>ampoule de transfert</td> d’objet pointu <td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>flacon à scintillation</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td> agitateur orbital <td>d’objet pointu</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>tube de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>balayage laser confocal</td><td>Leica</td><td>SP2</td><td></td></tr><tr><td>solution de fixation</td><td>(5 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 % formaldéhyde</td><td>2,5 ml</td><td></td><td>produit chimique toxique</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EGTA</td><td>0,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase sans H2O</td><td>1,5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mélange d’huile d’halocarbure</td> <td>(10 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>huile d’halocarbure, 700 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d’huile d’halocarbure, 27 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection plaies dosage et<em&gt; in vivo</em&gt; localisation des épidermique plaies reporters réponse dans<em&gt; drosophila</em&gt; embryons.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

L&#39;embryon de drosophile développe une couche épidermique robuste qui sert à la fois pour protéger les cellules internes d&#39;un environnement externe exigeants ainsi que pour maintenir l&#39;homéostasie cellulaire. Blessure de ponction avec des aiguilles de verre fournit une méthode directe pour déclencher une réponse rapide de la plaie de l&#39;épiderme qui active la transcription, la plaie reporters qui peuvent être visualisées par un signal du gène rapporteur localisé dans les embryons ou les larves vivantes. Ponction ou laser blessure fournit également des signaux qui favorisent le recrutement des hémocytes au site de la plaie. Étonnamment, sévère (par et à travers) les blessures de ponction dans les embryons à un stade avancé perturbe que très rarement le développement embryonnaire normal, que plus de 90% de ces embryons blessés survivent à l&#39;âge adulte lorsque les embryons sont injectés dans un milieu d&#39;huile qui minimise les fuites immédiate de l&#39;hémolymphe des sites de ponction . La procédure de la plaie exige de micromanipulation sur des embryons de drosophile, y compris l&#39;alignement manuel des embryons sur agplaques d&#39;ar et le transfert des embryons alignés sur des lames de microscope. Le dosage de la réponse épidermique de la plaie Drosophila fournit un système rapide pour tester les exigences génétiques d&#39;une variété de fonctions biologiques qui favorisent la cicatrisation des plaies, ainsi que d&#39;un moyen pour cribler des composés chimiques potentiels qui favorisent la cicatrisation des plaies. Le cycle de vie court et facile routine de culture font la drosophile un modèle de l&#39;organisme puissant. Drosophila propre cicatrisation semble coordonner l&#39;épiderme réponse régénérative, avec la réponse immunitaire innée, de façons qui sont encore à l&#39;étude, qui fournit un excellent système pour trouver conservée réglementaire des mécanismes communs pour la drosophile et les mammifères épidermique blessures.

Pour obtenir les résultats présentés dans le présent procédé, le bâti de la protéine fluorescente verte (GFP) de lecture ouvert est fusionné à un / séquence d&#39;activateur de promoteur induit bobiné à partir de la dopa décarboxylase (DDC) et la DsRed est fusionnée à une séquence plaie activatrice de la tyrosine hydroxylase ( exemple) 4,6. Dans un embryon de drosophile en direct, la maturation de la protéine rapporteur fluorescent plaie est optimal 4-6 h après la blessure, ce qui laisse du temps pour l&#39;accumulation de la protéine suffisante pour visualiser, ainsi que le temps pour la protéine fluorescente à oxyder à l&#39;état fluorescent 15. Pour observer la localisation de journaliste, un microscope à fluorescence composé est suffisante. Pour observer un plus fort grossissement de la localisation de reporter, un microscope confocal est optimal pour générer une projection maximale de multiples sections optiques (figure 1). Confocale imagerie in vivo d&#39;embryons de drosophile est compliquée par le rapid ondulations de l&#39;embryon. . Une vue complète de l&#39;embryon peut être obtenue avec 20X objectif et une vue en gros plan d&#39;un site de la plaie peut être obtenue avec objectif 40x. Une vue de dessus épidermique blessure reporter localisation peut être imagée avec 10 sections optiques 1 um successives. Un latérale vue de l&#39;épiderme blessure reporter localisation peut être visualisée à l&#39;aide de 40 successives 1 um sections optiques. En utilisant des méthodes de croisement génétique standard, il est possible de combiner les journalistes de la plaie avec des mutations génétiques. Un exemple présenté dans cet article est Flotillin-2 (Flo-2), en raison de gain de fonction (surexpression généré avec l&#39;expression omniprésente dans toutes les cellules) mutants perte de fonction (allèle nul générée à l&#39;insertion P-élément) et de flo-2 démontrent le produit du gène Flo-2 est nécessaire et suffisante pour inhiber la localisation de la GFP-Ddc enroulé reporters 9 (Figures 2A et 2B). Utilisation de la microinjection protocole, il est possible de tester si l&#39;introduction de solutions chimiques superactivates ou inhibe la localisation de reporters de la plaie. Embryons chimiquement blessés ont été simultanément blessés et injectés avec un rapport de 1:4 de 1% toluidine colorant bleu et composés solubilisés. Un colorant bleu de toluidine autorisé pour confirmation visuelle des composés solubilisés étant injectés dans la cavité du corps. embryons de contrôle ont été blessés avec une aiguille brisée contenant 1:4 de 1% toluidine colorant bleu et soluté sans produit chimique. Deux exemples présentés dans ce document sont le peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) et le méthyl-β-cyclodextrine (MβCD), parce que les deux solutions chimiques sont suffisantes pour activer globalement la localisation de la DDC-GFP enroulé journalistes 9 (figures 2C et 2D) . Le peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) a été dilué dans H 2 O à 0,6 M. méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) a été solubilisé dans une mM NaOH à 3 mM. En utilisant le protocole embryon de fixation, il est possible de détecter l&#39;activation de la transcription des gènes de la réponse enroulés dans un domaine localisé, entourant une plaie. Un exemple présenté dans cet article est l&#39;hybridation in situ de sondes d&#39;ARN pour détecter Ddc et transcriptions ples 4,6,9 (figures 3A et 3B). <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. Ddc-GFP et plé-DsRed enroulés journaliste localisation. Brightfield et images fluorescentes dans blessés embryons de type sauvage. (A) Haut-vue de DDC-rapporteur GFP plaies. (B) Haut-vue de plé-DsRed enroulés journaliste. Toutes les images ont été recueillies sur un Leica SP2 microscope confocal, avec 20X objectif. Les flèches marquent le site de la plaie. Les lignes pointillées dans le panneau de donnéess marquent les contours d&#39;embryons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Figure 2. Localisation de la journaliste Ddc-GFP enroulé en milieux mutants génétiques et chimiques micro-injection d&#39;embryons. Clair et images fluorescentes de blessés Flotillin-2 (Flo-2) embryons mutants. (A) Perte de fonction Flo-2 {} KG00210 mutants, expansion de l&#39;activité de journaliste dans toutes les cellules de l&#39;épiderme. (B) Gain de fonction Flo-2 (tatou-GAL4, SAMU-Flo2) mutants, l&#39;inhibition de l&#39;activité de journaliste dans toutes les cellules de l&#39;épiderme. (C) de peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2 ) micro-injection de la solution, l&#39;expansion de reporter activité tout au long de l&#39;ensemble des cellules de l&#39;épiderme. (D) méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) la micro-injection de la solution, l&#39;expansion de l&#39;activité du rapporteur dans toutes les cellules de l&#39;épiderme. Toutes les images ont été recueillies sur un Leica SP2 microscope confocal, avec 20X objectif. Les flèches marquent le site de la plaie. Les lignes pointillées dans les panneaux de données marquent les contours d&#39;embryons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Figure 3. Détection de réponse de la plaie transcrits d&#39;ARN du gène. Des images fluorescentes d&#39;hybridation in situ et la détection de l&#39;ARN dans des blessés embryons de type sauvage. DDC (A) et exemple (B) des transcrits d&#39;ARN s&#39;accumulent autour du site de la plaie. Toutes les images sont la collecteted sur un Leica SP2 microscope confocal, avec l&#39;objectif 20X. Les flèches marquent le site de la plaie. Les lignes pointillées dans les panneaux de données marquent les contours d&#39;embryons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Tableau 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tableau 1. Résumé des journalistes de réponse épidermique de la plaie. Insertions des journalistes quatre d&#39;intervention de la plaie (DDC, exemple, msn, KKV) sont disponibles sur les deuxième et troisième chromosomes. Tous les journalistes de réponse de la plaie activer le gène de fluorescence (GFP ou DsRed) dans un nombre limité de cellules épidermiques entourant le site de la lésion de ponction dans le type sauvage fond (par exemple de phénotype &quot;locale&quot;). Journalistes de réponse Ddc et msn plaies exigent Grh pour activation de la fluorescgène CE après la ponction blessures (ex: &quot;none&quot; phénotype). Tous les journalistes de la plaie nécessitent Flo-2 pour la localisation du gène de fluorescence après ponction blessures (par exemple de phénotype &quot;globale&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

L&#39;épiderme embryonnaires d&#39;embryons de drosophile au stade très tardif fournit un système in vivo pour l&#39;analyse rapide de réponse ponction de la plaie et peuvent être combinés à des manipulations génétiques de micro-injection ou de traitements chimiques, pour faire avancer les études dans la cicatrisation des plaies pour la traduction dans les modèles de mammifères.

Microinjection plaies dosage et<em&gt; In vivo</em&gt; Localisation des épidermique plaies Reporters réponse dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser in vivo un marqueur de la réponse épidermique à une plaie chez l'embryon de drosophile. Cela est réalisé en premier lieu en collectant le stade de développement auquel l'activité du marqueur peut être détectée de manière constante. La deuxième étape de la procédure consiste à percer l'embryon à l'aide d'une aiguille en verre et d'un appareil de microinjection.La troisième étape consiste à anesthésier l'embryon afin de visualiser le marqueur. L'étape finale est de valider la localisation du marqueur en détectant le profil d'expression de sondes ARN. En définitive, les résultats peuvent montrer l'activation spécifique du marqueur de réponse aux lésions épidermiques uniquement dans les cellules entourant le site de la blessure par piqûre, grâce à la microscopie confocale.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes qui impliquent l'observation de la fermeture de la plaie est que nous pouvons visualiser, chez des embryons vivants, l'expression génique induite par une blessure par piqûre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de la réparation tissulaire, telles que la manière dont les cellules entourant une lésion régulent une réponse immédiate à la plaie afin de favoriser la réparation. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie ou au diagnostic de la régénération tissulaire, car la régulation de la réponse à la plaie constitue la première étape.La cicatrisation peut être évaluée à n'importe quelle étape du développement. Toutefois, à l'étape 17, la cuticule est trop mature. Les marqueurs de blessure connus ne seront pas activés.Ainsi, pour démontrer la procédure, des stades 15 à 16 seront blessés afin de récolter les embryons. Réunissez des mouches adultes âgées de deux à trois jours, soit 50 femelles et 25 mâles. Transférez-les dans une cage de collecte d'embryons contenant une plaque fraîche de jus de pomme, d'agar et une petite quantité de pâte de levure.Garder la cage à 25 degrés Celsius chaque matin pendant les trois prochains jours. Remplacer la plaque par une plaque fraîche. L'après-midi du troisième jour, laisser les œufs s'accumuler sur une plaque fraîche pendant deux heures.Conserver cette boîte pendant 14 heures à 25 degrés Celsius. Un repos de deux heures devrait produire environ 200 embryons le lendemain. Ajouter quelques millilitres d'eau dans la boîte et agiter doucement.Ensuite, à l’aide d’un pinceau, transférez l’eau et les embryons de la plaque vers un panier en maille de nylon placé dans un tube de collecte. Préparez maintenant un bain de javel dilué et faites-y tremper les embryons pendant deux minutes. Cette étape élimine les COR, c’est-à-dire les œufs.Faire tourbillonner doucement le bain plusieurs fois pour éviter que les embryons ne s'agglomèrent. Après deux minutes, rincer les embryons à l'eau courante et dans une boîte de Pétri pendant cinq secondes chacun. Ensuite, transférer le panier contenant les embryons sur une serviette en papier pour sécher les embryons.Ensuite, à l’aide d’une aiguille de dissection, transférez environ 50 embryons de la maille vers une boîte de gélose préparée avec un colorant alimentaire vert. Ce colorant permet d’améliorer la visibilité des œufs de genou. Sous un microscope stéréoscopique, disposez les embryons en deux rangées parallèles espacées d’environ cinq millimètres.Espacez les rangées d'une largeur équivalente à celle d'un embryon afin de permettre les échanges gazeux. Ensuite, appuyez délicatement une lame munie de ruban adhésif double face sur les embryons de manière à ce que les rangées soient perpendiculaires à la longueur de la lame. Pour réduire leur pression interne, laissez les embryons sécher à l'air libre.Ainsi, ils n'exploseront pas lorsqu'ils seront blessés. Après 25 minutes, la première lame préparée doit être sèche. Recouvrez maintenant les embryons de deux à trois gouttes d'huile au halo carbone pour éviter une déshydratation supplémentaire et procédez immédiatement à la blessure des embryons desséchés.Placer la lame avec l'embryon sur la platine du microscope d'injection. Repérer les embryons dans le champ de vision et s'exercer à déplacer la platine du microscope inversé. Mettre ensuite au point sur le plan médian de l'embryon selon l'axe dorso-ventral et amener l'embryon supérieur de la première rangée alignée dans le champ de vision.Ensuite, placez et fixez soigneusement une pipette tirée dans le porte-aiguille. Utilisez le micromanipulateur pour abaisser la pipette jusqu’à la lame. Alignez la pipette avec l’embryon dans le même plan focal.Maintenant, ne pas régler davantage le micromanipulateur. Ensuite, déplacer la platine afin de transpercer l'embryon de part en part. Puis passer à l'embryon suivant dans la rangée.Après avoir blessé la première rangée, relevez complètement l'aiguille et éloignez-la de la platine. Ensuite, faites pivoter la lame et continuez à piquer les embryons de la deuxième rangée. Une fois tous les embryons blessés, ils peuvent être fixés immédiatement pour l'hybridation in situ ou la coloration immuno-histochimique.Pour examiner les marqueurs fluorescents, attendez quatre à six heures et transférez l'embryon sur une nouvelle lame, placez des billes de verre autour des embryons. Ajoutez ensuite quelques gouttes de phénoxypropanol à 50 %, qui est un anesthésique, et posez une lamelle sur les embryons pour les micro-injections. Chargez l'aiguille d'injection par l'arrière avec un microlitre de solution chimique additionnée de colorant, comme le peroxyde d'hydrogène à 0,6 molaire.Laisser l’action capillaire attirer la solution chimique jusqu’à l’extrémité de l’aiguille. Ensuite, casser l’extrémité de l’aiguille contre le bord d’un lame couvre-objet placée dans un mélange d’huile de carbone en halo. Tout d’abord, mettre l’aiguille montée au point en focalisant le bord de la lame couvre-objet inclinée à un angle légèrement inférieur à 90 degrés.Ensuite, déplacez doucement le bord de la lame couvre-objet le long de l'extrémité de l'aiguille jusqu'à ce qu'elle casse. Appliquez ensuite une pression sur l'appareil de microinjection et vérifiez que la solution s'écoule hors de l'aiguille. Si elle ne s'écoule pas, cassez légèrement davantage l'extrémité de l'aiguille.Effectuez maintenant la même procédure utilisée uniquement pour percer les embryons. Cette fois, micro-injectez la solution simultanément au percement. Idéalement, injectez 10 nanolitres.Si trop de solution est injectée dans l'embryon, la membrane vitelline éclatera lors de la procédure de fixation décrite dans le protocole écrit ; veillez donc à suivre attentivement les étapes suivantes. Utilisez une pipette en verre, et non en plastique, pour rincer l'heptane sur la lame, et utilisez du matériel en verre pour rassembler les embryons au centre de la boîte de Pétri en verre. Par la suite, agitez les embryons dans le fixateur pendant 25 minutes à 220 à 230 tr/min.Après agitation, attendez que les bulles à l'interface disparaissent avant de retirer complètement la phase aqueuse inférieure. Veillez également à ne pas remonter les embryons. Après l'ajout du méthanol, les embryons blessés doivent s'agglomérer à l'interface ; répartissez-les ensuite à la surface de la plaque comme indiqué, puis transférez-les sur une lame de verre munie d'un ruban adhésif double face de cette manière.Ensuite, repousser délicatement les embryons à l’aide de l’aiguille de dissection pour faire éclater la membrane vitelline et procéder à la déshydratation. Des mouches de type sauvage ont été transformées avec des capteurs fluorescents fusionnés à des régions régulatrices de la DOPA décarboxylase ou de la tyrosine hydroxylase, puis soumises au test décrit. En éclairage clair, il était possible d’observer le site de la blessure, tandis qu’en illumination fluorescente, l’activité du capteur de blessure DCD était visible.Le rapporteur de l'hydroxylase de la tyrosine a montré un résultat similaire. Les deux images ont été acquises sur un microscope confocal Leica SP deux avec un objectif 20 x. La procédure a été réalisée dans un mutant de type perte de fonction du flux deux.En condition de contrôle, l'activité du rapporteur de la DOPA décarboxylase s'est étendue à l'ensemble des cellules épidermiques chez les mutants présentant un gain de fonction dans le flux deux, générés par une expression ubiquitaire dans toutes les cellules. Une inhibition du rapporteur a été observée dans l'ensemble des cellules épidermiques. Ensuite, des embryons ont été simultanément blessés et injectés avec un composé solubilisé et du bleu d'uridine, du peroxyde d'hydrogène et de l'eau, ce qui a élargi l'activité du rapporteur de la DOPA décarboxylase dans les cellules épidermiques, tout comme une injection de méthyl-β-cyclodextrine dans l'hydroxyde de sodium en utilisant l'hybridation in situ U.L'activation transcriptionnelle des gènes de réponse à la blessure a été évaluée à l'aide de la DOPA décarboxylase endogène. L'expression ARN s'est révélée localisée autour du site de la blessure et, bien sûr, des transcrits d'ARN de la tyrosine hydroxylase ont également été détectés en accumulation au site de la blessure. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 60 minutes si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas passer trop de temps à aligner les embryons et de passer aux étapes suivantes de la procédure.

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Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l'imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d'utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l'imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du 3ème stade larvaire chez la drosophile.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

La peau adulte de C. elegans est un modèle traitable pour l’étude des réponses épithéliales des plaies, y compris la fermeture de la plaie, la formation de cicatrices et l’immunité innée.

Méthodes pour Blessant Peau et Essais pour les réponses de blessure dans C. elegans

Ce protocole présente une méthode efficace pour l’imagerie du neuroépithélium de l’œil nymphal vivant de la drosophile. Cette méthode compense le mouvement des tissus et la topologie inégale, améliore la visualisation des limites cellulaires grâce à l’utilisation de plusieurs protéines de jonction marquées GFP et utilise un banc d’imagerie facile à assembler.

Live-imagerie de la Drosophila Nymphe yeux

Nous présentons ici un protocole pour la création d’images en direct de la cicatrisation et la réponse inflammatoire associée à haute résolution spatio-temporelle in vivo. Cette méthode utilise la chrysalide du développement de la drosophile pour permettre à long terme d’imagerie et suivi des populations de cellules spécifiques au fil du temps et est compatible avec l’inactivation de gènes RNAi efficace.

À long terme In Vivo suivi de la dynamique de cellules inflammatoires dans les pupes de la drosophile

La polyploïdisation induite par les plaies est une stratégie de réparation des tissus conservée où les cellules se développent en taille au lieu de se diviser pour compenser la perte de cellules. Voici un protocole détaillé sur la façon d’utiliser la mouche des fruits comme un modèle pour mesurer le stratagème et sa régulation génétique dans la réparation des plaies épithéliales.

Un modèle de Drosophila pour étudier la polyploïdisation induite par les plaies

Présenté ici est un protocole de microinject et simultanément l’image de plusieurs embryons de Drosophila au cours du développement embryonnaire à l’aide d’une plaque à base, imageur à haute teneur.

Préparation et microinjection d’embryons de drosophile pour la microscopie cellulaire vivante effectuée à l’aide d’un analyseur automatisé à contenu élevé

Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole optimisé pour la micro-injection embryonnaire, une étape cruciale pour la création de mouches transgéniques.

Microinjection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile

Ces protocoles décrivent comment caractériser l’organisation et la fonction d’occllusion des jonctions septates plissées dans l’épithélium embryonnaire de Drosophila et mutant.

Expériences d’immunocoloration et de pénétration de colorants pour définir les protéines de jonction septate plissée du noyau dans les épithélios embryonnaires de Drosophila

Apprenez la microinjection et la localisation de reporters de réponse aux plaies épidermiques chez les embryons de Drosophila. Cette méthode permet de visualiser l'expression génique en temps réel pour étudier la cicatrisation tissulaire.

Microinjection plaies dosage et

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