Name: Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Découvrez un test de mutagenèse in vivo utilisant le modèle de souris transgénique LacI pour analyser les mutations ADN dans les cellules hématopoïétiques. Cette méthode permet d'évaluer les effets des génotoxines sur la stabilité génétique.

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Nous tenons à remercier David R. Rodriguez, MA pour la conception graphique et la photographie dans ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un financement de la GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) et la subvention d&#39;appui Cancer Center (P30CA054174) à l&#39;installation UTHSCSA cytométrie de flux de base et le Fonds UTHSCSA avancée Nucleic Acids Core.

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Le test in vivo de mutagenèse in décrite ici est basée sur le modèle de souris transgénique LacI initialement généré par Kohler et al. 18 Ce modèle utilise un vecteur de phage λ portant un gène rapporteur lad. Les deux sites cos flanquant le vecteur permettre une relativement simple récupération et le conditionnement ultérieur en particules infectieuses de phages, utilisés pour infecter E. coli. Une plaque bleue sera généré par phage infectées <em...

Dans la plupart des tissus, des cellules différenciées ont une durée de vie limitée. Afin de maintenir l&#39;intégrité fonctionnelle, les cellules souches spécifiques de tissu à long terme produisent en continu des cellules souches qui à leur tour donnent naissance à des cellules complètement différenciées nécessaires à la fonction de ce tissu particulier. Les cellules souches reconstituer aussi leur propre compartiment par un processus appelé auto-renouvellement. Ainsi, les cellules souches sont responsables du maintien de l&#39;intégrité fonctionnelle des tissus ils résident po Par conséquent, il est impératif qu&#39;ils sont équipés de mécanismes solides pour détecter et potentiellement réparer l&#39;ADN endommagé. Sinon, ils peuvent acquérir de multiples perturbations génomiques (potentiellement dangereux), qui peuvent être hérités par leur progéniture. Comprendre comment les cellules souches sauve-garde de leur génome au cours de la durée de vie d&#39;un organisme est une question importante et peut nous aider à comprendre pourquoi l&#39;instabilité génomique est liée à un cancer et d&#39;autres maladies liées à l&#39;âge (examinés dans 1,2). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Contrôle de l&#39;intégrité du génome d&#39;un tissu au niveau des cellules souches ou des populations de cellules progénitrices précoce peut être obtenu soit en éliminant tige défectueuse (ou progénitrices) des cellules par l&#39;intermédiaire de la mort cellulaire, la sénescence ou la différenciation, et / ou par une réparation efficace ADN endommagé. Des études récentes ont montré qu&#39;il est possible de mesurer certains types de réparation de l&#39;ADN directement dans ces populations rares 6.3. On a constaté que, par exemple, dans le système hématopoïétique, les cassures double brin de l&#39;ADN peuvent être réparées par recombinaison homologue (RH) ou de la fin non homologue de jonction (NHEJ), ce dernier étant un procédé de réparation d&#39;une fidélité plus faible et donc une augmentation du risque de prise erreurs. Les deux sont utilisés dans des cellules souches hématopoïétiques (CSH) 4,5, cependant, chez la souris, il semble qu&#39;il est essentiellement NHEJ dans les CSH tandis que les cellules progéniteurs précoces utilisent HR 4. Une observation similaire a été faite pour les cellules souches dans la peau 6. Fait intéressant, dans les CSH humaines HR, pas NHEJ,semble être le mécanisme de réparation de choix pour des cassures double brin 3. Si cette différence fonctionnelle entre les deux espèces est réelle ou représente une différence technologique ou simplement expérimental reste à voir. Un répertoire de cellules souches pour réparer l&#39;ADN endommagé est susceptible d&#39;inclure d&#39;autres mécanismes de réparation d&#39;ADN, telles que l&#39;excision de base de réparation (BER), la réparation par excision de nucléotides (NER) et la réparation des mésappariements (MMR). BER et NER sont responsables de la réparation des lésions de paires de bases simples ou multiples dans l&#39;ADN simple brin, alors que l&#39;inadéquation des correctifs ROR base de base et des boucles d&#39;insertion / délétion; ces types de dommages à l&#39;ADN peuvent pas être réparés par NHEJ ou RH. L&#39;appui de cette notion existe plusieurs études provenant du système hématopoïétique qui démontre un lien entre les modifications dans l&#39;une de ces voies et des anomalies dans le compartiment HSC 7-9, ainsi qu&#39;un risque accru de développer un syndrome myélodysplasique 10-16, une maladie qui prend naissance dans laHSC et qui est associée à l&#39;augmentation de l&#39;instabilité génomique que la maladie progresse 17. Pour l&#39;instant, les mesures de BER, NER et MMR directement dans les CSH n&#39;ont pas été signalés. En plus d&#39;élucider les divers processus qui contrôlent l&#39;intégrité des tissus au niveau mécanique, il est impératif de pouvoir mesurer l&#39;ampleur de l&#39;ADN muté, de sorte que les conséquences d&#39;aberrations dans l&#39;un de ces processus peuvent être testés, par exemple dans la normale par rapport génétiquement cellules souches modifiées ou vieux par rapport à jeune. Cependant, le développement d&#39;un test pertinent est difficile en raison de la rareté des cellules souches tissulaires spécifiques et le manque de conditions de culture qui préserve &quot;caractère souche&quot;. En outre, une telle analyse devrait être amendée à des manipulations génétiques et environnementaux. Une solution possible à ces limitations et exigences est l&#39;utilisation de modèles de souris qui sont spécifiquement conçues pour détecter des mutations de l&#39;ADN. Muldes modèles de souris transgéniques tiples pour la détection de mutations ont été développés. Par exemple, des souris transgéniques 18 LacI porter un vecteur de phage λ recouvrable codant pour le système rapporteur LacI, dans lequel le gène code pour un suppresseur LacI de l&#39;opérateur lac et sert de rapporteur de mutation. Lors de la mutation du gène LacI, l&#39;opérateur Lac est activé et β-galactosidase est produite. β-galactosidase clive le substrat chromogène X-gal (5-bromo-4-chloro-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), qui transforme le bleu. Les sites cos flanquant le vecteur Lacl permet une récupération facile par lambda protéines de phage et une infection ultérieure de E. coli. Après incubation E. infectée coli sur agarose contenant le substrat X-gal, plaques peut être marqué. Des plaques bleues contiennent un mutant putatif Lac-I portant un phage, alors que des plages claires abritent les non-mutants. La fréquence des plages bleues (e parmie ceux claires) indique la fréquence de mutants dans la population de cellules d&#39;origine de l&#39;ADN a été extrait à partir de. En outre, le phage λ accueillir la cible LacI peut être facilement séquencée en utilisant des techniques de PCR pour l&#39;analyse relativement à haut débit. Le séquençage des gènes multiples Laci mutants va révéler des informations importantes sur le spectre de mutation, qui à son tour peut pointer vers d&#39;éventuelles déficiences dans les voies spécifiques de réparation d&#39;ADN ou à des événements spécifiques génotoxiques. Le système transgénique Lad a été normalisé sur plusieurs laboratoires 19 et les réactifs sont disponibles dans le commerce. Un inconvénient majeur du système Lad est la capacité limitée pour détecter des délétions ou des réarrangements, par conséquent, d&#39;autres méthodes, par exemple FISH multi-couleur sur les spreads métaphase doivent être utilisés pour compléter cette lacune. Au sein du vecteur de phage λ du modèle de souris LacI, il existe un gène beaucoup plus petite, CII, Disponible pour l&#39;analyse des mutations. Sa taille et le fait que les mutants peuvent être sélectionnés en font un test de main-d&#39;œuvre et moins cher moins 20 que l&#39;analyse du gène Lad. Cependant, le gène LacI est plus largement étudié pour la mutagenèse 21 et la sensibilité du gène de mutations a été bien caractérisé de sorte qu&#39;il y ait une compréhension claire des résidus d&#39;acides aminés qui produisent une réponse phénotypique d&#39;un substrat chromogène de 22 à 25. D&#39;autres modèles de souris pour la détection de mutations incluent l&#39;utilisation de la ΦX174 ou les transgènes LacZ. Le modèle de souris transgénique ΦX174, avec le A initial: T → G: C réversion mutation dosage 26 ou le test de mutation directe 27 qui permet la détection d&#39;un spectre des substitutions de paires de bases, représente un système moins coûteux que le modèle Lad. Cependant, l&#39;écran de mutation dans le dosage de l&#39;avant n&#39;est pas anodin et la spécification de mutationtrum du transgène ΦX174 n&#39;est pas aussi bien caractérisé que celui de la LacI. Dans des modèles de souris portant des transgènes LacZ, le journaliste de mutation LacZ est récupéré en utilisant E. des cellules hôtes E. coli qui sont sensibles au galactose et un milieu contenant du galactose 28. Un inconvénient de ce système est que la récupération de la cible LacZ implique également la digestion d&#39;endonucléase de restriction suivie d&#39;une ligature et l&#39;électroporation de E. coli héberge, ce qui rend difficile d&#39;adapter le système pour de petits nombres de cellules. Bien que ce n&#39;est pas une exigence absolue pour travailler avec les populations de cellules souches / progénitrices (on peut toujours commencer avec plus souris), si un grand nombre de cellules sont nécessaires (par exemple, des millions ou plus), il deviendra vite impossible et un coût prohibitif. En outre, la taille relativement importante de LacZ, tout en offrant un reporter sensible mutationnelle, est lourd et plus coûteux pour une analyse de séquence d&#39;ADN et la détermination de spectres de mutation. Toutefois, un des grands avantages de ce modèle est sa capacité à détecter de grandes deletions et insertions, ainsi que des réarrangements chromosomiques. Etant donné que toutes les cellules dans les modèles de souris transgéniques LacI, ΦX174 et LacZ portent le système rapporteur, l&#39;un de ces modèles de souris peut être utilisée pour mesurer la mutagenèse dans n&#39;importe quel type de cellule d&#39;intérêt, y compris des cellules souches et progénitrices, tant qu&#39;ils peuvent être récoltées de façon fiable et en nombre suffisant. Parce que nous avions une grande expérience avec le modèle de la souris Lad et le test de mutation Lad, nous avons décidé de poursuivre encore ce système pour l&#39;analyse de mutagenèse dans souches hématopoïétiques et populations de cellules progénitrices. Le tissu hématopoïétique est bien caractérisée en termes de phénotype de surface cellulaire de ses composants individuels, y compris les cellules de repopulation à long terme souches, qui sont identifiables comme la population extrêmement rare de Lin - IL7R <sup&gt; - Sca-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - 29 cellules. . Mohrin et al 4 ont démontré que la population légèrement plus grand de LSK/Flk2 - cellules sont encore bons représentants pour les CSH et significativement différent de l&#39;ancêtre myéloïde engagé plus primitive (CMP) de la population quand il s&#39;agit de l&#39;étude de réparation de l&#39;ADN. En outre, lorsque le LSK HSC enrichi (Flk-2 + et Flk-2 -) des cellules ont été comparés à la Lin - IL7R - Sca-1-cKit + (cellules progénitrices LS-K) +, il y avait encore une différence significative dans NHEJ capacité 5 entre le moins pur, de la tige de LSK population enrichie en cellules, et les cellules progénitrices. Dans notre étude, nous utilisons HSC enrichi LSK (Flk-2 + et Flk-2 -) des cellules parce que nous avons constaté qu&#39;au moins 2 x 10 5 cellules sont nécessaires pour des résultats cohérents et fiables dans ce test de mutagenèse; ce numéro de cellule est extrêmement difficileà obtenir quand on trie le LSK/Flk2 - population CD150 + CD48 ou même la LSK/Flk2 - population (en termes de souris, les coûts et pratique). Ce protocole, sur la base de celui initialement mis au point par Kohler et al. 18 décrit en détail la façon dont la fréquence de mutants spontanés d&#39;ADN peut être déterminée dans des cellules LSK et des populations de cellules myéloïdes différenciées ainsi que des cellules de moelle osseuse non séparée et la rate définie.

<table><tbody><tr><td>LacI souris transgéniques&nbsp ;</td>Kit d’isolement d’ADN RecoverEase de <td>BioReliance Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, comprenant le cocktail de ribonucléase RNace-It</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>720202</td><td></td></tr><tr><td>l’extrait d’emballage Transpack, y compris les tubes de transpack orange et bleu et le SCS-8 E. coli</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>200221</td><td></td></tr><tr><td>Normes de taille d’ADN &ndash ; échelle lambda</td><td>Bio Rad</td><td>170-3635</td><td></td></tr><tr><td>0,025 mM Membranes poreuses&nbsp ;</td><td>Fisher (Millipore)</td><td>VSWP 025 00</td><td></td></tr><tr><td>245 mm2 Boîtes d’essai biologique (plateaux)&nbsp ;</td><td>Fisher (Corning)</td><td>07-200-600</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon NZY (poudre)</td><td>Fisher (Teknova)</td><td>N1144</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Fisher</td><td>AC34843-5000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Research Products Intl Corp (RPI)</td><td>B71800-10.0</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3-115-852</td><td></td></tr><tr><td>Prolongateur PCR Taq Polimerase kit</td><td>5 PRIME</td><td>2200500</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP kit de nettoyage</td><td>Beckman/Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr></tbody></table>

identifier adn mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Au cours des dernières années, il est devenu évident que l&#39;instabilité génomique est étroitement liée à de nombreux troubles du développement, des cancers et de vieillissement. Étant donné que les cellules souches sont responsables d&#39;assurer l&#39;homéostasie tissulaire et la réparation tout au long de la vie, il est raisonnable d&#39;émettre l&#39;hypothèse que la population de cellules souches est essentielle pour la préservation de l&#39;intégrité du génome de tissus. Par conséquent, beaucoup d&#39;intérêt a été soulevée dans l&#39;évaluation de l&#39;impact des facteurs endogènes et environnementaux sur l&#39;intégrité du génome dans les cellules souches et leur progéniture, visant à comprendre l&#39;étiologie des maladies à base de cellules souches. Souris transgéniques lacI portent un vecteur de phage λ recouvrable codant pour le système rapporteur LacI, dans lequel le gène LacI sert de rapporteur de mutation. Le résultat d&#39;un gène muté LacI est la production de β-galactosidase qui clive un substrat chromogène, le tournant dans le bleu. Le système rapporteur Lad est réalisée in toutes les cellules, y compris les cellules souches / progénitrices et peuvent facilement être récupérés et utilisés pour infecter ensuite E. coli. Après incubation E. infectée coli sur agarose contenant le substrat correct, plaques peut être marqué; plaques bleues indiquent un gène mutant Lad, tandis que les plaques claires abritent de type sauvage. La fréquence de bleu (entre les plaques claires) indique la fréquence de mutation dans la population de cellules d&#39;origine de l&#39;ADN a été extrait à partir de. Le séquençage du gène mutant LacI affiche l&#39;emplacement des mutations dans le gène et le type de mutation. Le modèle de souris transgénique Lad est bien établi comme un test in vivo de mutagenèse. En outre, les souris et les réactifs pour le test sont disponibles dans le commerce. Nous décrivons ici en détail comment ce modèle peut être adapté pour mesurer la fréquence d&#39;apparition spontanée de mutants d&#39;ADN dans les cellules souches enrichie en cellules Lin - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSK) et d&#39;autres sous-populations de cellules du système hématopoïétique.

<html> Le test in vivo de mutagenèse mesure un événement rare (mutant UFP) parmi beaucoup d&#39;événements (UFP). En effectuant le dosage avec un petit nombre de cellules, il est possible que le résultat est considérablement influencée par des résultats faux-positifs et faux-négatifs. Pour répondre à cette question nous avons réalisé une expérience de dilution en série avec des cellules de moelle osseuse non fractionnées, récoltées à partir de trois animaux différents. Nous avons mesuré la proportion de mutants ...

Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d&#39;ADN spontanément surgi ou après l&#39;exposition à génotoxines.

Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

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JoVE Journal

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