Name: Cultures neuronales stratifiées selon le sexe pour étudier les voies de mort des cellules ischémiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez la préparation de cultures neuronales hippocampiques dissociées stratifiées selon le sexe à partir d'embryons de jour 18. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de signalisation spécifiques dans la mort neuronale ischémique.

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Travail soutenu en partie par la Fondation Walter S. et Lucienne Driskill et NIH R01NS058792.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les cultures neuronales primaires dissociées de l’hippocampe stratifiées selon le sexe dans lesquelles les hippocampes mâles et femelles sont disséqués, dissociés et cultivés séparément présentent un outil utile pour étudier la signalisation cellulaire spécifique au sexe dans la mort cellulaire des neurones. Bien que les neuroscientifiques utilisent couramment des cultures neuronales primaires, les protocoles varient d’un laboratoire à l’autre en fonction de leurs objectifs et intérêts expérimentaux spécifiques. De nombr...

Les mammifères sont sexuellement dimorphes, les mâles et les femelles présentant des traits et des caractéristiques différents. Les différences entre les sexes s’étendent même au cerveau et sont évidentes dans la susceptibilité neuronale aux blessures et aux maladies (examiné dans1-5). Par exemple, le cerveau masculin est plus sensible aux lésions neuronales ischémiques causées par un accident vasculaire cérébral ou un arrêt cardiaque, suivi d’une réanimation (examiné dans6). La maladie de Parkinson (examinée dans7) et la schizophrénie (revue dans8) sont plus fréquentes chez les hommes que chez les femmes, tandis que le cerveau humain féminin semble plus sensible à la maladie d'Alzheimer (examinée dans9) et aux troubles de l'humeur tels que la dépression (revue dans10). Malgré des différences observables entre les sexes en ce qui concerne la susceptibilité aux lésions et aux maladies neuronales, la plupart des paradigmes de traitement actuels ne tiennent pas compte du sexe et sont similaires chez les hommes et les femmes. On pourrait obtenir un plus grand succès si les différences entre les sexes étaient prises en compte et comprises.
Les modèles animaux in vivo de lésions et de maladies neuronales présentent un dimorphisme sexuel similaire à celui des humains et sont essentiels pour améliorer notre compréhension des différences entre les sexes et de la manière dont ces différences contribuent à la survie et au fonctionnement neuronaux. Des preuves ont démontré, par exemple, que les rongeurs mâles sont plus sensibles que les femelles aux lésions neuronales ischémiques11-15. On pense que cette différence dépend au moins partiellement de la signalisation moléculaire de la testostérone, la principale hormone stéroïde sexuelle masculine, et de l’œstrogène, la principale hormone stéroïde sexuelle féminine. Des études avec des rongeurs mâles et femelles gonectomisés révèlent que la testostérone et le métabolite de la testostérone, la dihydrotestostérone (DHT) exacerbent et que l’œstrogène diminue les lésions neuronales après une ischémie cérébrale12-14,16-18. Cependant, des différences entre les sexes dans l’ischémie cérébrale sont présentes chez les animaux nouveau-nés et adultes19,20. Les nouveau-nés connaissent des poussées d’œstrogène ou de testostérone in utero au cours du développement, mais ont des niveaux d’hormones relativement faibles après la naissance jusqu’à la puberté (examiné dans21). Ainsi, la présence ou l’absence d’hormone sexuelle primaire n’est pas le seul déterminant de la susceptibilité neuronale aux lésions influencée par le sexe. En effet, il est probable que des dimorphismes sexuels s’établissent au cours du développement, ce qui entraîne des différences dans la signalisation cellulaire et la réponse à l’ischémie, même lorsque les niveaux d’hormones sont faibles.
Que les différences entre les sexes dépendent de la présence d’hormones stéroïdes sexuelles ou qu’elles soient dues à des dimorphismes établis au cours du développement, il devient clair avec des études plus approfondies qu’il existe des différences dans la signalisation cellulaire entre les mâles et les femelles dans le cerveau. Dans le laboratoire Herson de la faculté de médecine de l’Université du Colorado, nous avons identifié une telle différence. Nous avons constaté que le canal ionique perméable au calcium, au sodium et au potassium, TRPM2 (examiné dans22,23), induit la mort des cellules neuronales à la suite d’une agression ischémique in vivo chez la souris mâle mais pas chez la souris femelle24. Nous démontrons que l’inhibition pharmacologique ou l’inhibition génétique de TRPM2 est protectrice chez la souris mâle mais pas chez la souris femelle dans notre modèle in vivo d’occlusion artérielle carotide moyenne (MCAO) de l’AVC24.
Malgré leur utilité, les modèles animaux in vivo de lésions neuronales ischémiques peuvent parfois être limités pour les études moléculaires de la mort neuronale, en raison de la difficulté ou de l’incapacité à cibler spécifiquement les neurones à étudier. Pour cette raison, notre laboratoire utilise in vitro des neurones primaires corticaux ou hippocampiques dissociés pour compléter nos travaux in vivo. Les cultures de neurones primaires dissociés constituent un outil utile pour étudier les voies de signalisation cellulaire impliquées dans les lésions et les maladies neuronales. Les neurones en culture peuvent être maintenus dans un environnement étroitement contrôlé, avec ou sans apport glial. En l’absence de glie, toutes les réponses observées en culture sont neuronales. Les agents pharmacologiques peuvent être administrés en culture sans se soucier de l’absorption à travers la barrière hémato-encéphalique, ce qui permet l’inhibition ou l’activation de composants spécifiques d’une voie de transduction de signal donnée. La biologie moléculaire peut être utilisée pour surexprimer ou neutraliser diverses protéines d’intérêt, et des mesures électrophysiologiques peuvent être effectuées sur des cellules individuelles, ce qui ne serait pas possible dans un système modèle in vivo.
Le laboratoire Herson élargit l’utilité des cultures neuronales primaires dissociées en sexant d’abord les embryons utilisés pour préparer les cultures. Les cultures de neurones mâles et femelles stratifiées en fonction du sexe montrent clairement que les neurones mâles sont plus sensibles que les neurones femelles à la mort des cellules neuronales suite à une privation d’oxygène et de glucose25. La privation d’oxygène et de glucose est un modèle in vitro accepté de l’ischémie neuronale, car l’ischémie réduit la disponibilité de l’oxygène et du glucose dans le cerveau. De plus, nous avons démontré par des expériences électrophysiologiques dans des neurones dissociés et stratifiés en fonction sexuelle que TRPM2 est activé dans les neurones mâles mais pas dans les neurones femelles24,26. Nous étudions actuellement les régulateurs moléculaires spécifiques au sexe de l’activité24,26 de TRPM2. Ici, nous partageons et discutons de notre protocole pour établir des cultures de neurones embryonnaires primaires dissociés de l’hippocampe stratifiés selon le sexe et présentons des données représentatives utilisant cette méthode qui suggèrent que l’enzyme de réparation de l’ADN, PARP-1, contribue à la mort cellulaire ischémique d’une manière spécifique au sexe similaire à TRPM2. PARP-1 est activé par la rupture de l’ADN due au stress oxydatif (examiné dans27,28). Lorsque les dommages à l’ADN sont minimes, l’activité de PARP-1 améliore la survie cellulaire, mais lorsque les dommages sont excessifs, l’activité accrue de PARP-1 exacerbe la mort cellulaire. PARP-1 produit du poly-(ADP)ribose, un activateur connu du canal TRPM228-31, et certaines preuves suggèrent que PARP-1 est activé préférentiellement dans le cerveau masculin mais pas féminin en réponse au stress oxydatif32,33. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que PARP-1 active TRPM2 chez le mâle mais pas chez la femelle, induisant la mort des cellules neuronales en réponse à la privation d’oxygène et de glucose.

<table><tbody><tr><td>Supplément B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>71997</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM, sans glutamine, sans rouge de phénol</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal, sans glutamine, sans rouge de phénol</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine, MW 70,000-150,000</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4 %</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ÉQUIPEMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pince coudée</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 &ndash ; Pince incurvée fine</td><td>Outils de science fine</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Dentelée (Londres) Pince Fine</td><td>Science Tools</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Pince Graefe extra fine 1 x 2 dents</td><td>Outils de science fine</td><td>11153-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Moria</td><td>Outils de science fine</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux opératoires moyens</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de microdissection extra fins</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 24 puits</td><td>Fisher</td><td>87721</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire, 40 & micro ; M Nylon Mesh</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

cultures neuronales stratifiées selon le sexe pour étudier les voies de mort des cellules ischémiques

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Des différences entre les sexes en matière de susceptibilité neuronale aux lésions ischémiques et aux maladies neurodégénératives ont longtemps été observées, mais les mécanismes de signalisation responsables de ces différences restent incertains. La culture neuronale embryonnaire primaire dissociée fournit un modèle expérimental simplifié permettant d’étudier la signalisation cellulaire neuronale impliquée dans la mort cellulaire à la suite d’une ischémie ou d’une maladie ; Cependant, la plupart des cultures neuronales utilisées aujourd’hui dans la recherche sont mixtes. Les chercheurs peuvent tester et testent les effets du traitement aux stéroïdes sexuels dans des cultures neuronales mixtes dans des modèles de lésions et de maladies neuronales, mais de plus en plus de preuves suggèrent que le cerveau féminin réagit aux androgènes, aux œstrogènes et à la progestérone différemment du cerveau masculin. De plus, les rongeurs mâles et femelles nouveau-nés réagissent différemment aux lésions ischémiques, les mâles subissant des lésions plus importantes à la suite d’une ischémie cérébrale que les femelles. Ainsi, les cultures neuronales mixtes pourraient obscurcir et confondre les résultats expérimentaux ; Des informations importantes peuvent être manquées. Pour cette raison, le laboratoire Herson de la faculté de médecine de l’Université du Colorado prépare régulièrement des cultures neuronales embryonnaires primaires dissociées stratifiées selon le sexe à partir de l’hippocampe et du cortex. Les embryons sont sexés avant le prélèvement du tissu cérébral et les tissus mâles et femelles sont dissociés, plaqués séparément et conservés séparément. À l’aide de cette méthode, le laboratoire Herson a démontré un rôle spécifique chez l’homme pour le canal ionique TRPM2 dans la mort cellulaire ischémique. Dans ce manuscrit, nous partageons et discutons de notre protocole de sexage des souris embryonnaires et de préparation de cultures de neurones primaires dissociés de l’hippocampe stratifiés selon le sexe. Cette méthode peut être adaptée pour préparer des cultures corticales stratifiées selon le sexe, et la méthode de sexage de l’embryon peut être utilisée conjointement avec d’autres protocoles pour toute étude dans laquelle le sexe est considéré comme un déterminant important du résultat.

Le sexage correct des souriceaux embryonnaires est une étape cruciale dans la préparation de cultures primaires de neurones stratifiées par sexe. Afin de s'assurer que les hippocampes mâles et femelles étaient cultivés séparément à partir de souriceaux correctement sexés, les embryons ont été séparés par sexe et leur cortex ainsi que leur hippocampe ont été isolés. L'ADN génomique a été extrait des tissus isolés de chaque embryon selon des procédures standard, en veillant à maintenir la séparation par sexe. Une réaction ...

Les cultures neuronales embryonnaires primaires dissociées de l’hippocampe sont utiles pour étudier les mécanismes de signalisation impliqués dans la mort des neurones. Le sexage des embryons avant l’isolement et la dissociation de l’hippocampe permet de préparer des cultures masculines et féminines distinctes, ce qui permet au chercheur d’identifier et d’étudier la signalisation cellulaire spécifique au sexe.

Cultures neuronales stratifiées selon le sexe pour étudier les voies de mort des cellules ischémiques

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des cultures primaires de neurones dissociés de l'hippocampe stratifiées selon le sexe. La première étape de la procédure consiste à déterminer le sexe et à disséquer les embryons au dix-huitième jour embryonnaire, afin d'obtenir des cultures neuronales primaires stratifiées selon le sexe. L'étape suivante consiste à préparer les neurones associés à partir du tissu neuronal.La dernière étape consiste à ensemencer les neurones à la densité appropriée et à les cultiver pour l'expérimentation. En définitive, cette méthode, combinée à d'autres protocoles, peut être utilisée pour toute étude dans laquelle le sexe est considéré comme un déterminant important du résultat. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le sexe, comme de savoir si les rongeurs mâles et femelles réagissent différemment à l'ischémie neuronale. Parmi les différentes préparations nécessaires, certaines méritent d'être revues, comme les plaques de culture tissulaire.Préparer une solution diluée de poly-L-lysine à 0,1 milligramme par millilitre. Ensuite, sous une hotte de culture cellulaire à flux laminaire, recouv

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Cocher les cultures neuronales pour étudier les voies de la mort cellulaire ischémique

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Essai de mort neuronale pour évaluer la mort cellulaire dans un modèle d’épilepsie ex vivo

Cette vidéo présente une technique ex vivo pour induire la mort des cellules cérébrales médiée par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Lors de l’obtention de coupes cérébrales, des lymphocytes T CD8+ activés dirigés contre les oligodendrocytes sont transférés sur les tranches pour cibler la gaine de myéline et les oligodendrocytes. Après l’incubation, les dommages à la myéline et la mort neuronale peuvent être évalués histologiquement dans les régions d’intérêt.

Une technique ex vivo pour induire la mort neuronale via des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes

Occlusion carotidienne bilatérale associée à une hypotension systémique produit ischémie globale du cerveau chez le rat, causant des dommages à l'hippocampe avec sévérité reproductible. sujets animaux sont altérées avec des modèles prévisibles de lésions cérébrales, ils récupèrent opportunément, et les taux de mortalité sont relativement faibles.

Occlusion 2 Navire / Hypotension: un modèle de rat d&#39;ischémie cérébrale globale

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Une manière robuste à l'étude des avalanches neuronale, c'est à dire invariante d'échelle éclate l'activité spatio-temporelle, indicative de la dynamique de l'état critique dans le cortex. Avalanches émergent spontanément dans le développement de couches superficielles du cortex culture qui permet de mesures à long terme de l'activité avec des tableaux intégrés planaires multi-électrodes (MEA) dans des conditions contrôlées avec précision.

Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

Découvrez la préparation de cultures neuronales hippocampiques dissociées stratifiées selon le sexe à partir d'embryons de jour 18. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de signalisation spécifiques dans la mort neuronale ischémique.

Cultures neuronales stratifiées selon le sexe pour étudier les voies de mort des cellules ischémiques

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