Protocole de dosage à base de cellules pour la prédiction du pronostic de la scoliose idiopathique de l'aide Cellular Spectroscopie Diélectrique

L’objectif global de l’expérience suivante est de prédire le pronostic de la scoliose idiopathique en fonction du regroupement fonctionnel des patients en criblant leur réponse PBM C à l’activation du RCPG R à l’aide de la spectroscopie diélectrique cellulaire. Ceci est réalisé en cultivant pbmc en présence de phyto hémagglutinine ou PHA pour augmenter le nombre de cellules. L’expansion cellulaire est terminée dans un tube, maintenu en position inclinée.

Dans un deuxième temps, les cellules sont traitées avec de l’OSTEOPONTIN ou OPN, ce qui augmente ou réduit l’activité des protéines GI. Selon les patients après le traitement, la suspension cellulaire est transférée dans la microplaque. Ensuite, les cellules sont stimulées avec des agonistes GI ou GS GPCR pour déterminer les changements d’impédance qui en résultent.

Les résultats fournissent des réponses cinétiques pour tous les puits et les réponses intégrées sont ensuite quantifiées en fonction des changements d’impédance. L’implication de cette technique va bien au-delà du simple diagnostic. Ainsi, pour la première fois, nous pouvons détecter à un stade précoce les patients symptomatiques à risque de développer une scoliose, et maintenant en sachant qui développera une scoliose ou à quel stade ils se trouvent, nous pouvons fournir de nouvelles thérapies pour les traiter.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’exposition aux rayons X, est que cette technique permet de prédire la scoliose ostéopathique pronostique sans avoir besoin de mesurer le covid et sans risque pour la santé. La chose la plus récente, la technique sera maintenant notre assistante de recherche Nita Franco, décongélation d’aliquote congelée de cellules mononucléées du sang périphérique dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette stérile, transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres contenant 15 millilitres de milieu complet et centrifugez.

Les cellules aspirent le surnageant. Ensuite, suspendez doucement la pastille de cellule dans un millilitre de milieu PHA, complétez le volume à 20 millilitres avec le même média et bouchez le tube sans serrer pour permettre à l’air d’entrer. Incuber le tube pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pour permettre aux lymphocytes quiescents de se transformer en lymphoblastes à prolifération rapide.

Serrez complètement les bouchons et granulez les cellules par centrifugation. Éliminer le surnageant par aspiration. Suspendez doucement la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu complet.

Complétez le volume à 20 millilitres avec le même milieu et fermez le tube sans serrer la culture pendant la nuit pour augmenter le nombre de cellules. Après deux lavages avec 10 millilitres de RPMI 1640, remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 600 microlitres de RPMI 1640. Mesurez la concentration et la viabilité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et d’un analyseur de viabilité.

Ajoutez ensuite un volume approprié de RPMI 1640 pour ajuster à une concentration cellulaire de 1,5 fois 10 à la cinquième cellule par 20 microlitres. Transférez 100 microlitres de suspension dans deux tubes stériles de 1,5 millilitre d’orph. Ajouter de l’ostéopontine recombinante dans un tube jusqu’à une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre.

Ajoutez un volume égal de PBS dans le deuxième tube. Mélangez délicatement chaque condition en pipetant deux fois à l’aide d’une pipette stérile réglée à 100 microlitres. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de RPMI 1640 dans chaque puits d’une centrifugeuse à plaque de 96 puits la plaque à 200 GS pendant trois minutes pour éliminer toutes les bulles d’air afin de transférer les cellules du tube à la microplaque.

Pipetez doucement de haut en bas une fois pour assurer une suspension uniforme des cellules. Grainez 40 microlitres de suspension cellulaire par puits en quadruple duplicata pour les cellules non traitées et en double pour les cellules traitées ROPN ou PBS. Laissez la plaque cellulaire sous le capot stérile pendant cinq minutes pour permettre aux cellules de se reposer et de se déposer uniformément au fond du puits.

Pour optimiser l’effet de la culture OPN, les cellules pendant 18 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone équilibrent les cultures à température ambiante pendant environ 30 minutes. Pendant ce temps, préparez un millilitre de 100 micromolaires de somatostatine et d’isoprotérénol dans RPMI 1640. Remplissez la plaque composée en distribuant 20 microlitres dans des puits appropriés.

Couvrez la plaque composée avec un joint durcissable. Chargez la plaque, les pointes de pipette et la plaque composée dans le système basé sur CDS. Nommez la plaque dans le logiciel de l’instrument basé sur CDS.

Accédez à la liste des protocoles et sélectionnez le protocole approprié pour lancer le protocole. Cliquez sur Démarrer. Le système fluidique intégré ajoute simultanément les composés à tous les puits.

Le système basé sur le CDS recueille automatiquement les données pendant 15 minutes après que la viabilité des cellules de l’édition composée ait été comparable entre tous les échantillons, avec des valeurs cohérentes dans la plage de 86 et 96 %. Parmi les échantillons sur les 32 échantillons, les deux utilisés avaient un nombre insuffisant de cellules et n’ont pas été classés. Cet exemple montre la classification fonctionnelle en fonction du degré de déséquilibre entre l’IG et la signalisation IG.

L’évaluation de l’effet OPN en réponse à la stimulation gastro-intestinale a révélé que l’OPN augmentait la réponse chez les patients 353 et 371. En revanche, la réponse a été réduite de plus de 50 % chez les patients 345 et 382 et de moins de 50 % chez le patient 370 après un traitement par ROPN. Ainsi, selon nos critères de classification, nous avons pu catégoriser les patients 353 et 371 dans le FG un, les patients 300 contre 45 et 382 dans le FG 2 et le patient 370 dans le FG 3.

En parallèle, tous les patients ont été dépistés pour leur réponse à la stimulation des protéines GI et comparés à des sujets témoins. Comme prévu, tous les patients étaient moins réactifs que les sujets témoins. Les patients classés dans le même groupe fonctionnel présentaient des niveaux similaires de réponse maximale.

La classification d’une large cohorte de patients SC régulièrement suivis dans notre clinique spécialisée à l’hôpital San Justine a révélé que les trois groupes fonctionnels étaient répartis de manière similaire. Parmi les cas modérés, le FG deux était prédominant parmi les cas graves. Après avoir attendu cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de classer le patient en deux, trois groupes fonctionnels à l’aide de la spectroscopie diélectrique cellulaire.