La chaleur induite par un antigène de récupération: une méthode efficace pour détecter et identifier les types de cellules progénitrices adultes au cours de l'hippocampe neurogenèse

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une récupération d'antigène sur un tissu cérébral hippocampique afin de mieux visualiser les types de cellules progénitrices donnant naissance à de nouveaux neurones. Cette étape est réalisée en premier lieu en prélevant le cerveau perfusé chez la souris, en découpant de fines sections coronales et en montant ces sections sur une lame en verre spécialement conçue pour adhérer fortement au tissu. La deuxième étape consiste à faire bouillir les lames contenant le tissu avec un traitement kay atypique, puis à laisser suffisamment refroidir.

Ensuite, colorer le tissu avec les anticorps primaires toute la nuit. La dernière étape consiste à effectuer la coloration par anticorps secondaires sur le tissu le lendemain pendant au moins deux heures. Enfin, visualiser les différents types cellulaires progéniteurs selon les divers stades de développement au cours de la neurogenèse adulte du tissu hippocampique, à l’aide de microscopie en temps réel ou de microscopie confocale.

Bonjour, je m'appelle Hun Jo, postdoctorat, membre du laboratoire du Dr Ian John au Mayo Clinic. Notre objectif principal dans le laboratoire John est d'étudier le processus de néurogenèse dans les troubles neurologiques et psychiatriques. Notre but final est de traduire avec succès ces connaissances en applications thérapeutiques. Notre procédure de récupération d'antigène sera présentée par Quam Hui, et bonjour à John de notre laboratoire.

L'avantage principal de notre technique par rapport aux méthodes existantes d'immunohistochimie réside dans sa capacité à permettre une visualisation efficace de types cellulaires distincts au cours de la neurogenèse hippocampique adulte. Ces types cellulaires, notamment les cellules souches neurales précurseurs, difficiles à détecter autrement, peuvent être marqués et visualisés efficacement grâce à notre méthode de récupération des antigènes. Cette méthode permettra de mieux comprendre le développement et la régulation des neurones nouvellement formés lors de la neurogenèse hippocampique adulte.

Pour ceux qui s'intéressent à l'étude des troubles mentaux et à leur traitement pharmacologique, notre récupération d'antigène s'avérera utile pour examiner le rôle du développement neuronal durant cette pathogenèse. Commencez la procédure en plaçant le cerveau d'une souris perfusée dans du paraformaldéhyde à 4 % dans un tube conique de 10 millilitres pendant une nuit à quatre degrés Celsius, ou pendant au moins 12 à 24 heures, mais pas plus de 36 heures pour une fixation complète. Après la fixation nocturne, retirez le PFA et laissez le cerveau dans le tube conique.

Ensuite, rincez le cerveau avec du saccharose à 30 % pour éliminer tout résidu de PFA et jetez le saccharose. Puis, remplissez à nouveau le tube avec du saccharose à 30 % et conservez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le cerveau coule au fond du tube. Par la suite, découpez l’hippocampe en sections cérébrales de 40 micromètres à l’aide d’un microtome.

Conserver les sections dans la solution antigèle jusqu'à ce qu'elles soient prêtes pour l'immunohistochimie. Ensuite, monter les tranches sur des lames de microscope spécialement conçues pour adhérer fortement au tissu. Après le montage du tissu, laisser sécher les lames environ 10 minutes.

Le séchage peut être accéléré si les lames sont posées verticalement sur une serviette en papier afin d'assurer l'élimination complète des produits chimiques précédents. Une fois les lames sèches, les rincer au PBS trois fois pendant cinq minutes à chaque fois. Puis les laisser sécher à nouveau.

Dans cette procédure, préparez la solution pour l'ébullition des tissus conformément à la description figurant dans le manuscrit accompagnant. Ensuite, faites bouillir la solution pendant cinq minutes dans un micro-ondes standard à réglage standard. Une fois l'ébullition terminée, retirez soigneusement le récipient du micro-ondes.

Après cela, transférez les lames séchées dans la solution. Assurez-vous que le côté portant les sections d'hippocampe est entièrement exposé à la solution. Si possible, placez les lames en biais contre les parois du récipient et disposez d'autres lames autour d'elles.

Ensuite, faites bouillir le mélange avec les lames pendant sept minutes au micro-ondes à puissance maximale. Pendant ce temps, remplissez à moitié deux seaux à glace avec de la glace. Une fois l'ébullition terminée, retirez le récipient du micro-ondes et placez-le à l'intérieur de l'un des seaux à glace.

Verser le reste de la glace provenant de l'autre seau tout autour du récipient et le recouvrir complètement. Ensuite, laisser reposer pendant une heure. Retirer les lames du récipient.

Lavez-les trois fois avec du tampon TBST, cinq minutes à chaque fois. Ensuite, faites sécher les lames à l'obscurité pendant cinq à dix minutes, ou jusqu'à ce que la lame soit complètement sèche. Pendant ce temps, préparez une chambre humide avec de l'eau DDH₂O pour la coloration par anticorps primaire durant la nuit.

Une fois que les lames sont sèches, dessinez un contour autour des sections de tissu à l’aide d’un stylo hydrophobe. Ce contour agit comme une barrière empêchant le mélange d’anticorps de s’étendre. Préparez ensuite le mélange d’anticorps primaire dans du T-B-S-T-T.

Placez les lames sèches sur la platine dans la chambre de coloration. Ajoutez lentement 500 microlitres d'anticorps primaire afin de recouvrir entièrement la surface. Ensuite, recouvrez la chambre de coloration pour bloquer la lumière extérieure et laissez-la toute la nuit à température ambiante. Le jour suivant, lavez les lames trois fois, cinq minutes à chaque fois, avec du tampon TBST.

Après cela, faites-les sécher à l'abri de la lumière. Préparez ensuite le mélange d'anticorps secondaire dans du T-B-S-T-T. Puis placez les lames sèches dans la chambre de coloration.

Ajouter 500 microlitres d'anticorps secondaire. Recouvrir lentement la chambre de coloration et l'abriter de la lumière extérieure pendant au moins deux heures à température ambiante. Après la coloration secondaire, laver les lames trois fois pendant cinq minutes chacune avec du tampon TBST, puis sécher les lames à l'obscurité après le séchage. Ajouter la solution de montage sur les lames.

Les recouvrir soigneusement avec des lamelles afin d'éviter l'introduction de bulles. Ensuite, conserver les lames à l'obscurité pendant au moins deux heures avant l'analyse ultérieure ou l'acquisition d'images en lapse de temps ou d'analyses de type convo sur le tissu coloré. La neurogenèse hippocampique adulte est représentée au niveau de la zone sous-granulaire du gyrus denté.

Une cellule souche de type 1, semblable à une cellule gliale radiaire activée, traverse des phases distinctes lorsqu'elle se différencie, mûrit et s'intègre fonctionnellement avec une morphologie complexe au circuit neuronal. Chaque phase et les types cellulaires correspondants peuvent être identifiés selon leur expression d'une combinaison de marqueurs. MCM2 est un marqueur de prolifération exprimé dans tous les types de cellules progénitrices mitotiques, tandis que NEUN est exprimé chez les cellules souches semblables aux cellules gliales radiaires et non radiaires.

Lorsque les progéniteurs de type II A se différencient, l'expression imbriquée est d'abord désactivée. L'expression de l'anti-TBR2 augmente dans le progéniteur post-mitotique, tandis que l'expression de MCM2 est perdue ; l'expression de DCX et de NEUROD1 détermine alors la migration et la maturation en un neurone fonctionnel. Il s'agit d'une image confocale représentative montrant une coloration violette pour MCM2, verte pour nestine et rouge pour DAPI.

Les images agrandies dans les encadrés montrent un précurseur radial de type GL exprimant la néstine, MCM deux et dpi. Voici une image confocale représentative avec MCM deux en bleu, TBR deux en rouge, DCX en vert et dpi en gris. La coloration, caractéristique d'un type de cellule précurseur de type deux B, est illustrée dans les images agrandies des encadrés exprimant MCM deux, TBR 2D, c, X et dpi.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de trois points. Premièrement, utiliser un tissu bien perfusé et fixé, d'une épaisseur coronaire adéquate. Deuxièmement, monter le tissu à plat sur les lames et éviter tout dommage pendant cette manipulation.

Et enfin, trois, en prenant suffisamment de temps pour l’ébullition et le refroidissement ultérieur lors de la récupération de l’antigène. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la reconstruction tissulaire en microscopie confocale et des expériences comportementales peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la manière dont les neurones nouvellement formés s'intègrent dans les circuits hippocampiques et contribuent à la fonction cognitive. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'effectuer la récupération d'antigènes sur vos échantillons tissulaires hippocampiques afin de visualiser de manière plus efficace les types cellulaires présents qui donnent naissance à de nouveaux neurones lors de la neurogenèse hippocampique.