Un protocole rapide pour l’intégration de puces extrachromosomiques à haut taux de transmission dans le génome de C. elegans

Le but général de cette procédure est d'intégrer des constructions transgéniques extrachromosomiques dans le génome de Caenorhabditis elegans à l'aide d'une irradiation ultraviolette. Tout d'abord, sélectionnez la lignée transgénique présentant le taux de transmission le plus élevé possible, idéalement supérieur à 80 %. Ensuite, exposez les larves L4 transgéniques sélectionnées à une irradiation UV. Isolez quatre animaux transgéniques fluorescents F2 par boîte F1 sélectionnée. Puis, analysez les boîtes F2 afin d'obtenir 100 % d'animaux transgéniques fluorescents.

F trois vers. En fin de compte, le choix d'animaux fluorescents de la génération F trois peut révéler l'héritage à 100 % du transgène. Cette approche expérimentale convient bien aux lignées transgéniques qui transmettent des chromosomes supplémentaires sous forme de réseaux à un taux élevé.

La procédure sera démontrée par Stephanie Belman, technicienne de notre laboratoire. Commencez avec 500 boîtes de Pétri grandes contenant du milieu de croissance pour nématodes. Ensemencez chaque boîte avec 0,3 millilitre de *E. coli* en culture saturée.

Culture OP 50. Évaluer le taux de transmission de la lignée transgénique à intégrer pour chaque lignée transgénique. Sélectionner 10 adultes fluorescents par gravité sur 10 boîtes de culture distinctes sous un stéréoscope à fluorescence.

Les animaux sont placés dans un incubateur à vers réglé à une température permissive pour la reproduction du fond génétique. Surveiller chaque jour la descendance afin d'évaluer à quel stade de développement le marqueur de co-injection est exprimé et peut être observé de manière optimale par microscopie fluorescente. Évaluer le taux de transmission chez la descendance en déterminant le pourcentage d'individus fluorescents.

Pour l'insertion du transgène, sélectionnez la lignée transgénique présentant le taux de transmission le plus élevé. Obtenez une population d'animaux transgéniques synchronisés au stade larvaire L4. Pour l'insertion, sélectionnez 30 adultes GRA fluorescents sur cinq boîtes de culture.

Après que les vers ont pondu des œufs pendant trois à quatre heures à 15 degrés Celsius, vérifiez la présence d’au moins 30 œufs par boîte, puis éliminez les adultes des boîtes et faites cultiver les animaux dans une enceinte d’incubation pour vers jusqu’à ce que la descendance atteigne le stade larvaire L4. Placez chaque boîte contenant 15 à 20 animaux transgéniques fluorescents au stade L4 dans un crosslinker UV dont les couvercles auront été préalablement retirés, puis irradiez les vers pour récupération. Incubez les vers irradiés toute la nuit à 15 degrés Celsius.

Vérifiez le nombre d'animaux vivants en votre possession. Un taux de survie d'environ 80 à 90 % est adapté pour une irradiation efficace. Élevez les animaux irradiés à une température de 15 à 25 degrés Celsius jusqu'à ce que la descendance ait atteint le stade de développement permettant l'observation de l'expression du marqueur de co-injection.

Transférer des animaux F1 uniques fluorescents sur des plaques de culture séparées. Conserver ces plaques F1 à une température de 15 à 25 degrés Celsius jusqu'à ce que la descendance atteigne un stade approprié pour l'observation des animaux F2 fluorescents, selon le marqueur de liaison utilisé. Dans ce cas particulier, nous avons observé les vers à l'état adulte et écarté toutes les plaques F1 présentant soit un seul ou aucun descendant, indiquant que l'animal F1 était stérile ou était mort, soit deux non, ou seulement quelques animaux F2 fluorescents, indiquant que l'animal F1 n'avait pas transmis le transgène au taux attendu.

Sélectionnez quatre vers transgéniques fluorescents F2 sur chacune des boîtes F1 choisies. Lorsque vous utilisez des transgènes fluorescents, choisissez des vers F2 présentant un niveau élevé de fluorescence, car cela pourrait indiquer que ces animaux sont homozygotes pour le greffon intégré. Notez que lors de la sélection des vers F2, il est essentiel de ne pas emporter d'œufs ou de larves afin d'éviter des faux négatifs à l'étape suivante.

Après avoir fait croître les animaux F deux, examiner les boîtes F deux à la recherche de vers transgéniques F trois présentant une fluorescence à 100 %. Le dépistage est très rapide, car la présence d'un seul ver non fluorescent indique que la boîte doit être jetée. Sélectionner huit animaux F trois fluorescents provenant de boîtes choisies pour confirmer l'héritage du transgène à 100 %. Si possible, conserver plusieurs souches transgéniques intégrées indépendantes.

Des intégrations de transgènes dans deux lignées différentes, transmettant des réarrangements extrachromosomiques à une fréquence environ identique, ont été réalisées. À l'aide des protocoles standard et amélioré, le temps et le nombre de boîtes nécessaires par lignée intégrée sont optimisés dans le protocole amélioré. Ensuite, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle un taux de transmission plus élevé du transgène dans une lignée non intégrée facilite l'intégration de ce transgène dans le génome.

Un transgène particulier a été intégré dans des lignées transmises à des taux différents à l’aide du protocole amélioré pour la lignée présentant le taux de transmission le plus élevé. Trois lignées intégrées ont été obtenues à partir de seulement 90 animaux F1 sélectionnés, tandis que pour la lignée transgénique transmise à 50 à 60 %, une seule lignée intégrée a été obtenue à partir de 110 animaux F1 sélectionnés. Après cette procédure, différentes méthodes peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la détermination de l’expression génique, du profil et de la régulation, de la localisation protéique et de la surexpression protéique, ou encore le développement de marqueurs subcellulaires.