Name: Identification des populations spécifiques des neurones sensoriels pour létude des canaux ioniques exprimés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Découvrez l'identification des neurones afférents par marquage rétrograde au DAI et l'étude de leurs canaux ioniques par patch clamp et immunochimie. Cette méthode non invasive permet d'analyser les propriétés fonctionnelles des neurones sensoriels.

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Ce travail a été financé par la subvention AR059397 (KSE) des National Institutes of Health).

Remarque : Tous les travaux sur les animaux doivent être effectués conformément aux directives de l’établissement et aux soins aux animaux.
1. Préparation de l’animal et étiquetage
<ol>
	<li>Anesthésie des rats : Anesthésie un rat (généralement de 150 à 400 g) à l’aide d’une injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (50 mg/kg de poids corporel), de xylazine (5 mg/kg) et d’acépromazine (1 mg/kg). Vérifiez les réflexes en pinçant le pied, attendez qu’il n’y ait plus de réponse. Étant donné que la réponse anesthésique varie d’un animal à l’autre, il est préférable de déterminer l’effet des anesthésiques en testant les réflexes de douleur.</li>
	<li>Solution DiI : Peser la poudre DiI et la dissoudre dans du DMSO stérile à 100 % pour obtenir une solution à 1,5 % (15 mg/ml). Conservez la solution à température ambiante dans une atmosphère sèche jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Injections DiI : rasez les poils sur la zone du mollet sur les deux jambes du rat anesthésié à l’aide d’un rasoir électrique.
	<ol>
		<li>Remplir une seringue stérile de 1 ml (aiguille de 1 po 27 g) avec 200 μl de solution de DiI à 1,5 %. Insérez lentement l’aiguille parallèlement à l’axe long de chaque muscle gastrocnémien et injectez 100 μl de DiI dans le muscle tout en reculant lentement l’aiguille hors du muscle (~10 secondes) sans se retirer du muscle.</li>
		<li>Avant de retirer l’aiguille du muscle, tirez sur le piston de la seringue pour vous assurer que le colorant ne coule plus de la pointe, attendez 10 secondes, puis retirez l’aiguille du muscle. Cette étape empêche la fuite de DiI de l’aiguille vers la peau, ce qui pourrait étiqueter les afférences cutanées.</li>
		<li>Répétez l’opération pour l’autre jambe.</li>
		<li>Attendez 4 à 5 jours pour que le DiI soit transporté du muscle au DRG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dissection et isolement neuronal
<ol>
	<li>Solutions:
	<ol>
		<li>Préparez la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et la solution saline équilibrée d’Earle (EBSS) selon les instructions du fabricant, filtrez, stérilisez et conservez à 4 °C.</li>
		<li>Milieu de culture (MEM Plus) : Mélanger 89 ml de milieu essentiel minimal (MEM), 10 ml de sérum fœtal bovin (FBS), 1 ml de solution de pénicilline-streptomycine, filtrer, stériliser et conserver à 4 °C.</li>
		<li>Solution de polylysine : dissoudre la poudre de bromhydrate de poly-L-lysine (10 mg/100 ml) dans une solution de borate de sodium 0,1 M, pH 8,4, filtrer, stériliser et stocker les aliquotes à -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Revêtement des lamelles
	<ol>
		<li>Nettoyez les lamelles en verre (rond de 12 mm) avec de l’éthanol à 70 % pendant 3 à 4 heures et faites-les sécher à l’air libre dans une hotte de culture stérile.</li>
		<li>Placez les lamelles séchées dans la solution de polylysine O/N.</li>
		<li>Retirer de la solution de polylysine et laver dans de l’eau distillée stérile 2 fois pendant 5 minutes chacune pour éliminer tout excès de polylysine.</li>
		<li>Séparez les lamelles, faites-les sécher dans une hotte de culture et conservez-les à 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mise en place pour la dissection
	<ol>
		<li>Placez sur de la glace un bécher avec 10 ml de HBSS, une boîte de Pétri de 35 mm et une boîte de Pétri de 100 mm.</li>
		<li>Pesez les enzymes : 7 mg de collagénase, 1 mg de DNAse et 10 mg de trypsine.</li>
		<li>Préchauffez un bain-marie à 37 °C et placez dans le bain un tube à centrifuger de 15 ml contenant 10 ml d’EBSS pour le réchauffer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>dissection:
	<ol>
		<li>Sacrifice du rat selon un protocole approuvé par l’IACUC. C du dioxyde d’arbon a été utilisé pour euthanasier le rat.</li>
		<li>Retirez rapidement le dos en ouvrant la peau du dos, retirez le tissu conjonctif et musculaire le long de la colonne vertébrale pour une meilleure exposition et retirez la section lombaire de la colonne vertébrale (extrémité de la région thoracique à l’os iliaque ; Figure 1).</li>
		<li>Placez la colonne vertébrale isolée dans la boîte de Pétri de 100 mm et, à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, appliquez une solution HBSS réfrigérée pour maintenir la préparation humide et froide.</li>
		<li>Coupez les muscles des côtés de la colonne vertébrale. Effectuez une laminectomie dorsale, à l’aide de rongeurs ou de ciseaux, et retirez délicatement l’os entourant les évidements contenant le DRG.</li>
		<li>Appliquez à plusieurs reprises du HBSS glacé (~1 ml) pendant cette procédure.</li>
		<li>Isoler le DRG en coupant les nerfs périphériques et centraux (en laissant 1 à 2 mm de nerf pour faciliter la manipulation des ganglions)</li>
		<li>Placez le DRG isolé dans la boîte de Pétri de 35 mm contenant un tampon HBSS glacé.</li>
		<li>Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les DRG L-4 et L-5 aient été isolés. Le DRG thoracique peut être isolé et traité séparément en tant que témoin négatif pour le marquage DiI.</li>
		<li>Placez la boîte avec du DRG isolé sous un microscope de dissection et retirez les nerfs et les vaisseaux sanguins en excès à l’aide de micro-ciseaux et de pinces.</li>
		<li>Ouvrez le DRG pour une meilleure exposition aux enzymes, mais ne dégainez pas le DRG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissociation des neurones DRG :
	<ol>
		<li>Ajoutez les enzymes dans le milieu chaud EBSS (conservé dans le bain-marie). Agiter brièvement pour dissoudre et filtrer la stérilisation.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, placez tout le DRG dans la solution enzymatique. Réduire au minimum le volume de HBSS ajouté avec le DRG, car le HBSS diluera le mélange d’enzymes. Gazez le ballon avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 pendant 60 secondes avant de bien fermer le ballon.</li>
		<li>Incuber le ballon dans le bain-marie agitateur réglé à 37 °C pendant 60 min à 240 tr/min.</li>
		<li>A la fin de l’incubation, agiter vigoureusement le ballon 50x pour dissocier le DRG5.</li>
		<li>Dans des conditions stériles, ajoutez 5 ml de MEM Plus dans le ballon pour arrêter les enzymes.</li>
		<li>Transvaser le contenu de la fiole dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et centrifuger à 16 x g pendant 6 min.</li>
		<li>Retirez et jetez le surnageant, ajoutez 5 ml de MEM Plus à l’échantillon. Triturez doucement avec une pipette pour briser la pastille.</li>
		<li>Répétez l’étape de centrifugation, retirez et jetez le surnageant et ajoutez 500 μl de MEM Plus. Triturer doucement avec une pointe de pipette de 1 ml sur une pipette pour obtenir une suspension cellulaire.</li>
		<li>Placez une lamelle en verre revêtue de polylysine dans une boîte stérile vide de 35 mm. Ajoutez une goutte (~50 μl) de la suspension de la cellule au centre de la lamelle.</li>
		<li>Répétez l’opération jusqu’à ce que la solution cellulaire soit épuisée.</li>
		<li>Placez les plats de 35 mm dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 1 heure pour permettre aux neurones d’adhérer aux lamelles.</li>
		<li>Ajoutez 2 ml de milieu supplémentaire dans chaque plat et remettez dans l’incubateur.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Enregistrement par patch clamp
<ol>
	<li>Solutions d’enregistrement : ces solutions permettent d’enregistrer les courants de NaV. Des exemples de solutions de composition différente peuvent être trouvés dans ces références5-7.
	<ol>
		<li>Solution externe : (en mM) 45 NaCl, 100 N-méthyl-d-glucamine (NMG)•Cl, 4 MnCl2, 10 Na•HEPES et 10 glucose, avec pH = 7,4 et osmolarité = 320 mOsm.</li>
		<li>Solution interne : (en mM) 104 NMG•Cl, 14 créatine•PO4, 6 MgCl2, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG2•EGTA et 0,3 Tris2•GTP avec pH 7,4 et osmolarité = 300 mOsm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mesure des courants ioniques :
	<ol>
		<li>Tirez des électrodes d’enregistrement de capillaires en verre sur un extracteur d’électrodes et polissez à chaud les pointes à l’aide d’une microforge. La résistance des électrodes est généralement de 2-3 MΩ</li>
		<li>Identifiez les neurones DRG marqués au DiI à l’aide d’un microscope à épifluorescence et d’un cube TRITC. DiI a une longueur d’onde d’excitation de 550 nm et une longueur d’onde d’émission de 570 nm.</li>
		<li>Remplissez l’électrode en verre avec la solution interne (limage uniquement ~ 1 cm de la pointe de l’électrode) et tapotez doucement pour éliminer les bulles piégées. Placez-le dans le porte-électrode et déplacez-le vers la cellule à l’aide d’un micromanipulateur.</li>
		<li>Une fois que l’électrode touche la cellule, appliquez une légère aspiration via le tube d’aspiration, jusqu’à ce qu’un joint étanche se forme (déterminé par l’augmentation de la résistance de l’électrode).</li>
		<li>Fixez la tension de la membrane au potentiel de maintien souhaité (généralement -60 à -120 mV).</li>
		<li>Obtenez la configuration de la pince de patch à cellules entières en appliquant une aspiration plus forte pour retirer le patch de membrane à l’extrémité de l’électrode. La transition vers la configuration à cellules entières est observée électriquement sous la forme d’une augmentation du courant capacitif8-10.</li>
		<li>Compensez la résistance série à l’aide du circuit de compensation de l’amplificateur patch clamp (utilisez au moins 80 % de compensation)8,10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Immunocytochimie
<ol>
	<li>Fixez les neurones sur les lamelles avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 1 heure, puis perméabilisez avec 2 % de Tween 20 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 10 min.</li>
	<li>Incuber les cellules fixées O/N dans une solution bloquante (sérum normal ou albumine sérique bovine) plus l’anticorps primaire, qui est un anticorps développé pour se lier à un antigène d’intérêt spécifique.</li>
	<li>Incuber un ensemble de contrôle de neurones O/N dans une solution bloquante dépourvue d’anticorps primaires.</li>
	<li>Lavez les lamelles avec un tampon PBS 3x pendant 5 min, suivi de 2 lavages de 5 min chacun avec 1 % de Tween 20 pour éliminer l’anticorps primaire non lié.</li>
	<li>Incuber, tester et contrôler les lamelles avec l’anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence, qui se lie à l’anticorps primaire pour permettre la visualisation.</li>
	<li>Lavez les lamelles avec du PBS 3x pendant 5 minutes pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires.</li>
	<li>Montez les lamelles sur une glissière en verre propre à l’aide d’un support de montage.</li>
	<li>Appliquez du vernis à ongles transparent sur le bord de la lamelle pour la fixer en place. Une fois secs, visualisez les neurones et capturez des images à l’aide du logiciel accompagnant le microscope à fluorescence. 
	Remarque : Dans ce travail, un microscope Nikon a été utilisé avec le logiciel NIS-elements BR 3.2. Le temps d’exposition a été optimisé et conservé le même pour les lames de contrôle et de test.</li>
	<li>Mesurez l’intensité de la fluorescence et la taille des cellules à partir de neurones individuels à l’aide d’un logiciel d’imagerie tel qu’ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).</li>
</ol>

<ol><li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reactions+of+cutaneous+and+muscle+afferent+neurons+to+peripheral+nerve+transection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats.</a> J. Neurosci. 23, 10559-10567 (2003).</li>
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<li>Yarotskyy, V., Elmslie, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roscovitine+Inhibits+CaV3.1+%28T-Type%29+Channels+by+Preferentially+Affecting+Closed-State+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.Ther%22%5BJournal%5D)">Roscovitine Inhibits CaV3.1 (T-Type) Channels by Preferentially Affecting Closed-State Inactivation.</a> J. Pharmacol. Exp.Ther. 340, 463-472 (2012).</li>
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<li>Marty, A. aN., Erwin, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+AaN+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. rwin 2, Plenum Press. 31-52 (1995).</li>
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<li>Margas, W., Mahmoud, S., Ruiz-Velasco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+Acetylcholine+Receptor+Modulation+of+Mu+%28%7Bmicro%7D%29+Opioid+Receptors+in+Adult+Rat+Sphenopalatine+Ganglion+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic Acetylcholine Receptor Modulation of Mu ({micro}) Opioid Receptors in Adult Rat Sphenopalatine Ganglion Neurons.</a> J. Neurophysiol. 103, 172-182 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les afférences musculaires provenant des muscles triceps suraux (par exemple le gastrocnémien) ont été utilisées dans de nombreuses études pour étudier le réflexe de pression de l’effort (EPR)13. Compte tenu de l’intérêt suscité par l’étude des neurones sensoriels médiateurs de l’EPR, les muscles gastrocnémiens ont été sélectionnés pour l’injection de colorant. DiI a été choisi en raison de sa nature lipophile et parce qu’il n’est pas perdu du neurone par diffusion à travers la membrane plasmique inta...

Les ganglions de la racine dorsale (DRG) sont composés de soma provenant de neurones afférents innervant diverses parties du corps, et des informations importantes peuvent être obtenues en étudiant des neurones sensoriels avec différentes cibles d’innervation1. Diverses méthodes indirectes ou invasives sont utilisées pour isoler et identifier les neurones afférents, par exemple en injectant dans le nerf des marqueurs tels que le fluorogold1, en injectant un colorant dans les muscles par la méthode chirurgicale2. Parmi les différents colorants qui ont été utilisés avec succès pour marquer les neurones et les voies neuronales, les colorants fluorescents comme DiI sont largement utilisés dans les tracés neuroanatomiques en raison de leur absorption rapide par les terminaisons neuronales, de leur rétention à long terme dans les neurones et de l’absence de transfert entre les neurones3. Les neurones afférents marqués avec DiI peuvent être facilement visualisés à l’aide d’un microscope fluorescent pour une étude détaillée. Cependant, l’une des limites est que des marqueurs tels que DiI peuvent être perdus dans les cellules lors de la perméabilisation cellulaire nécessaire à l’immunocytochimie avec des épitopes intracellulaires4. Nous décrivons ici une méthode qui utilise le DiI injecté dans le muscle squelettique pour identifier les neurones afférents musculaires dans le DRG. Nous décrivons également une méthode de perméabilisation cellulaire qui retient DiI dans le neurone tout en permettant aux anticorps d’accéder aux épitopes intracellulaires. Nous démontrons l’utilisation de l’électrophysiologie et de l’immunocytochimie pour étudier ces neurones identifiés, et décrivons les avantages distincts de chaque technique dans l’étude des canaux ioniques qui contrôlent l’excitabilité neuronale. Enfin, nous décrivons les problèmes potentiels qui peuvent entraver l’interprétation des données électrophysiologiques. Nous avons utilisé ces méthodes pour identifier les neurones afférents musculaires et cutanés et déterminer les canaux sodiques voltage-dépendants (NaV) exprimés dans ces neurones identifiés8. Cependant, ces méthodes peuvent être adaptées à une variété de préparations pour l’étude de sous-ensembles identifiés de neurones innervant un tissu cible particulier ou un noyau cérébral.

<table><tbody><tr><td>NaV 1.8</td><td>Abcam</td><td>Ab93616</td><td></td></tr><tr><td>NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 et 1.9</td><td>Alamone Labs, Jérusalem, Israël</td><td>ASC- 001/ 009 /008 /017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anticorps secondaires</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr>Sérum <td></td><td></td><td></td><td>de chèvre normal</td></tr><tr><td>Fluoro-Gel</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>17985</td><td></td></tr></tbody></table>

identification des populations spécifiques des neurones sensoriels pour l&#39;étude des canaux ioniques exprimés

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Les neurones sensoriels transmettent des signaux de diverses parties du corps au système nerveux central. Le soma de ces neurones est situé dans les ganglions de la racine dorsale qui tapissent la colonne vertébrale. Comprendre les récepteurs et les canaux exprimés par ces neurones afférents sensoriels pourrait conduire à de nouvelles thérapies pour la maladie. La première étape consiste à identifier le sous-ensemble spécifique de neurones sensoriels d’intérêt. Nous décrivons ici une méthode pour identifier les neurones afférents innervant les muscles par marquage rétrograde à l'aide d'un colorant fluorescent DiI (perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindocarbocyanine). Comprendre la contribution des canaux ioniques à l’excitation des afférences musculaires pourrait aider à mieux contrôler l’excitabilité excessive induite par certains états pathologiques tels que les maladies vasculaires périphériques ou l’insuffisance cardiaque. Nous avons utilisé deux approches pour identifier les canaux ioniques voltage-dépendants exprimés par ces neurones, l’électrophysiologie par patch clamp et l’immunocytochimie. Alors que l’électrophysiologie et les bloqueurs pharmacologiques peuvent identifier les types de canaux ioniques fonctionnels, nous avons utilisé l’immunocytochimie pour identifier les canaux pour lesquels des bloqueurs spécifiques n’étaient pas disponibles et pour mieux comprendre le modèle de distribution des canaux ioniques dans la population cellulaire. Ces techniques peuvent être appliquées à d’autres zones du système nerveux pour étudier des groupes neuronaux spécifiques.

En utilisant la méthode décrite ici, nous avons identifié les neurones afférents musculaires dans les ganglions rachidiens (DRG) et déterminé ensuite les canaux sodiques voltage-dépendants (NaV) exprimés par ces neurones. Les neurones afférents musculaires marqués au DiI (Figure 1C) représentaient une petite fraction de l'ensemble des neurones du DRG, avec une moyenne de 16 % des neurones (167/1047) marqués. La quantification a été réalisée en mesurant d'abord la fluorescence à l'aide d'ImageJ, puis en t...

Les neurones sensoriels afférents signalent les informations sensorielles de la périphérie vers le système nerveux central. L’identification de neurones afférents spécifiques aidera à comprendre leur physiologie. Nous décrivons une méthode de marquage rétrograde pour identifier les neurones afférents et étudions les canaux ioniques voltage-dépendants dans ces neurones à l’aide de l’électrophysiologie et de l’immunocytochimie.

Identification des populations spécifiques des neurones sensoriels pour l&#39;étude des canaux ioniques exprimés

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les neurones afférents par marquage rétrograde au colorant et d'étudier les canaux ioniques dans ces neurones à l'aide de l'électrophysiologie en enregistrement en mode « patch clamp » et de l'immunochimie. Cela est réalisé en injectant d'abord du DAI dans le tissu cible afin de marquer les neurones afférents innervants. La deuxième étape consiste à isoler les neurones afférents des ganglions de la racine dorsale.Ensuite, les neurones marqués sont soumis à un enregistrement en configuration « patch clamp » afin de détecter les canaux ioniques régulés par un stimulus. La dernière étape consiste à identifier les canaux ioniques exprimés dans les neurones marqués à l’aide de l’immunohistochimie. En combinant finalement les techniques de « patch », de « clamp » et d’immunohistochimie, nous sommes en mesure de déterminer le profil d’expression ainsi que les propriétés fonctionnelles des canaux ioniques dans les neurones afférents. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux autres méthodes existantes réside dans son caractère non invasif, et le DAI que nous utilisons, le DAI I, est connu pour son absorption rapide par les terminaisons neuronales.Absence de transfert entre les neurones et rétentions à long terme au sein des neurones que nous injectons. La démonstration de la procédure sera assurée par mes soins et par Stephanie, technicienne de recherche de notre laboratoire, pour l'injection de colorant. Commencez par raser les poils de la région du mollet sur les deux pattes du rat anesthésié à l’aide d’un rasoir électrique.Ensuite, remplir une seringue stérile d'un cm³ avec 200 microlitres de solution de Dai à 1,5 %. Insérer lentement l'aiguille parallèlement à l'axe longitudinal de chaque muscle gastrocnémien et injecter 100 microlitres de Dai dans le muscle avant de retirer l'aiguille du muscle. Tirer légèrement sur le piston de la seringue pour s'assurer que le colorant ne s'écoule plus de l'extrémité.Attendre 10 secondes, puis retirer l'aiguille du muscle. Quatre à cinq jours sont nécessaires pour que la diffusion du colorant s'établisse avant la dissection. Placer un bécher contenant 10 millilitres de HBSS, une boîte de Pétri de 35 millimètres et une boîte de Pétri de 100 millimètres sur de la glace.Ensuite, peser sept milligrammes de collagénase, un milligramme d'ADN et dix milligrammes de trypsine, préchauffer un bain-marie agité à 37 degrés Celsius et réchauffer un tube de centrifugation de 15 millilitres contenant 10 millilitres de EBSS dans le bain. Après avoir euthanasié le rat avant la dissection, ouvrir rapidement la peau sur le dos de l'animal. Puis retirer les tissus conjonctif et musculaire le long de la colonne vertébrale afin d'obtenir une meilleure exposition.Ensuite, retirez la section lombaire de la colonne vertébrale. Puis, placez la colonne vertébrale isolée dans la boîte de Pétri de 100 millimètres. Appliquez une solution HBSS froide à l’aide d’une pipette Pasteur stérile pour maintenir la préparation humide et froide.Coupez les muscles situés sur les côtés de la colonne vertébrale. Effectuez une laminectomie dorsale en utilisant des rongeurs ou des ciseaux pour retirer délicatement l'os et fermer les logements contenant les ganglions de la racine dorsale. Répétez l'opération. Appliquez du HBSS glacé à plusieurs reprises pendant cette procédure.Au microscope, isoler le ganglion rachidien en sectionnant les nerfs périphérique et central, en laissant un à deux millimètres de nerf afin de faciliter la manipulation des ganglions. Ensuite, placer les ganglions rachidiens isolés dans la boîte de Pétri de 35 millimètres contenant du tampon HBSS glacé. Répéter les procédures jusqu'à ce que tous les ganglions rachidiens L quatre et L cinq aient été isolés.Retirez les nerfs et les vaisseaux sanguins excédentaires à l’aide de ciseaux et de pinces microchirurgicaux. Ouvrez le ganglion de la racine dorsale (DRG) pour une meilleure exposition aux enzymes, mais ne retirez pas la gaine du DRG pour la dissociation des neurones du DRG. Ajoutez les enzymes au milieu EBSS tiède, puis vortexez pour dissoudre et filtrer stérilisez.Ensuite, placez toutes les racines dorsales (DRG) dans la solution enzymatique à l’aide d’une pipette Pasteur stérile. Puis, barbotez le flacon avec un mélange de 95 % d’oxygène et de 5 % de CO₂ pendant 60 secondes avant de fermer hermétiquement le flacon. Incubez ensuite le flacon dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes à 240 tr/min.À la fin de l'incubation, agiter vigoureusement le flacon 50 fois pour dissocier les ganglions rachidiens dans des conditions stériles. Ajouter cinq millilitres de MEM plus au flacon afin d'arrêter les activités enzymatiques.Transférez le contenu du flacon dans un tube stérile de centrifugeuse de 15 millilitres et centrifugez à 16 ×g pendant six minutes. Ensuite, retirez et jetez le surnageant. Ajoutez cinq millilitres de MEM plus à l'échantillon et triturez délicatement à l'aide d'une pipette.Pour fragmenter le culot, répétez l'étape de centrifugation, retirez et jetez le surnageant, puis ajoutez 500 microlitres de MEM complémenté. Triturez délicatement à l’aide d’une pipette réglée sur un millilitre pour obtenir une suspension cellulaire. Ensuite, placez une lame de verre recouverte de polylysine dans une boîte stérile vide de 35 millimètres. Ajoutez ensuite une goutte de la suspension cellulaire au centre de la lame.Répétez cette procédure jusqu'à épuisement de la solution cellulaire. Placez les boîtes de 35 millimètres dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 pendant une heure afin de permettre aux neurones de s'adhérer aux lamelles. Ajoutez deux millilitres supplémentaires de milieu dans chaque boîte, puis remettez-les dans l'incubateur pour effectuer l'enregistrement en configuration patch clamp.Tout d'abord, identifier les neurones DRG marqués au colorant en utilisant un microscope à fluorescence épipolaire. Ensuite, remplir l'électrode en verre avec la solution interne. Tapoter doucement pour éliminer les bulles éventuellement piégées.Placez ensuite l'électrode dans le porte-électrode. Abaissez l'électrode vers la cellule à l'aide d'un micromanipulateur. Une fois que l'électrode touche la cellule, appliquez une aspiration douce par l'intermédiaire du tube d'aspiration jusqu'à ce qu'un scellement étanche soit formé.Ensuite, fixez le voltage de la membrane au potentiel de maintien souhaité. Obtenez la configuration de scellement en mode « tout-en-cellule » en appliquant une aspiration plus forte. Pour éliminer le fragment de membrane à l'extrémité de l'électrode, une fois la configuration de scellement en mode tout-en-cellule établie, commencez l'enregistrement.Dans cette procédure, fixez les neurones sur les lamelles avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant une heure. Ensuite, perméabilisez les neurones avec du Tween 20 à 2 % dans du PBS pendant 10 minutes. Puis, incubez les cellules dans une solution bloquante pendant une heure.Les cellules témoins sont incubées dans la solution de blocage plus l'anticorps primaire toute la nuit. L'ensemble de contrôle des neurones est laissé à l'incubation toute la nuit dans la solution de blocage sans aucun anticorps primaire. Le jour suivant, lavez les lamelles avec du tampon PBS trois fois pendant cinq minutes chacune, suivies de deux lavages de cinq minutes chacun avec du Tween 20 à 1 % pour éliminer l'anticorps primaire non lié.Incubez ensuite les lamelles de test et de contrôle avec l'anticorps secondaire marqué par un fluorochrome approprié pendant 30 minutes, ce qui permet la liaison à l'anticorps primaire et ainsi la visualisation. Par la suite, lavez les lamelles 3 fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune afin d'éliminer l'excès d'anticorps secondaire. Ensuite, montez les lamelles sur une lame en verre propre à l'aide d'un milieu de montage.Appliquez ensuite du vernis à ongles transparent sur le bord de la lame pour la fixer en place. Une fois sèche, observez les neurones et acquérez des images à l'aide du logiciel accompagnant le microscope à fluorescence. Ceci représente une injection de Dai dans le muscle gastrocnémien et le transport rétrograde du muscle vers le ganglion racine dorsal (DRG).Les ganglions rachidiens L4 et L5 sont indiqués ici. Les neurones afférents sont visibles sur l'image en champ clair, et cette image fluorescente montre un neurone afférent musculaire marqué par un colorant. Cet histogramme présente l'intensité fluorescente DII des neurones sensoriels.Le pic principal provient des neurones non marqués et est ajusté à l’aide d’une équation gaussienne afin de déterminer l’intensité moyenne et l’écart type. La ligne verticale en pointillés représente le seuil de marquage pour DAI. L’histogramme comprend des données provenant de 1047 neurones, dont 167 marqués avec dai.Voici un neurone afférent musculaire représentatif présentant un bon contrôle du potentiel membranaire. Les courants sodiques à moins 20, moins 10 et zéro millivolt sont affichés à gauche, et la relation courant-potentiel est présentée à droite. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'extraire rapidement mais délicatement les ganglions rachidiens et de maintenir la préparation constamment humide avec du HBSS glacé.En suivant cette procédure, d'autres neurones efférents peuvent être marqués et identifiés afin de comprendre leur rôle en physiologie.

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Il ya des obstacles techniques à la mesure du flux de courant à travers les canaux ioniques multiples simultanément, et plus tard exigeants quelle portion du courant transmembranaire est due à chaque type de canal. Pour répondre à ce besoin, cette méthode présente un moyen pour générer la courbe IV de types de canaux individuels en utilisant des composants de fréquence spécifique.

Rappel d&#39;une courbe Ion Channel IV Utilisation des composants de fréquence

Les neurones sont d'abord caractérisé électrophysiologique. Puis le cytoplasme du neurone enregistré est aspiré et soumis à une transcription inverse-PCR afin de détecter l'expression des ARNm des enzymes de synthèse des neurotransmetteurs, des canaux ioniques et les récepteurs.

Profilage voltage-dépendants expression d&#39;ARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR

Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Nous décrivons ici notre stratégie pour obtenir des enregistrements unitaires stables et bien isolés à partir d’interneurones inhibiteurs identifiés dans le cortex de souris anesthésié. Les neurones exprimant ChR2 sont identifiés par leur réponse à la lumière bleue. La méthode utilise un équipement d’enregistrement extracellulaire standard et constitue une alternative peu coûteuse à l’imagerie calcique ou au patching guidé visuellement.

Un guide pour In vivo Simple unité d'enregistrement de Optogenetically identifié corticale inhibitrice Interneurones

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Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

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Ici, nous décrivons une approche physiologique qui permet l’identification et l’analyse approfondie d’une population définie de neurones sensoriels dans des coupes aiguës de tissu coronal de l’organe voméronasal de souris à l’aide d’enregistrements patch-clamp de cellules entières.

En profondeur Physiological Analyse des populations de cellules définies dans le tissu Tranches aiguë de l&#39;Vomeronasal Organ Souris

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