Identification des populations spécifiques des neurones sensoriels pour l'étude des canaux ioniques exprimés

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les neurones afférents par marquage anticolore rétrograde et d’étudier les canaux ioniques dans ces neurones à l’aide de l’électrophysiologie et de l’immunochimie par patch clamp. Ceci est accompli en injectant d’abord du DAI dans le tissu cible pour marquer les neurones afférents innervants. La deuxième étape consiste à isoler les neurones afférents des ganglions de la racine dorsale.

Ensuite, les neurones marqués sont clampés pour enregistrer les canaux ioniques dépendants, la dernière étape consiste à identifier les canaux ioniques exprimés dans les neurones marqués à l’aide de l’immunochimie. En utilisant une combinaison de patch, de pince et d’immunochimie, nous sommes en mesure d’identifier le modèle d’expression ainsi que les propriétés fonctionnelles des canaux ioniques dans les neurones afférents. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux autres méthodes existantes est qu’il s’agit d’une méthode non invasive et que le DAI que nous utilisons, le DAI I, est connu pour son adoption rapide par les terminaisons neuronales.

Manque de transfert entre les neurones et rétentions à long terme dans les neurones que nous injectons. La démonstration de la procédure sera faite par moi-même et Stephanie, technicienne de recherche de notre laboratoire pour l’injection de colorant. Tout d’abord, rasez les poils sur la zone du mollet sur les deux jambes du rat anesthésié à l’aide d’un rasoir électrique.

Ensuite, remplissez une seringue stérile CC avec 200 microlitres de solution Dai à 1,5 %. Insérez lentement l’aiguille parallèlement à l’axe long de chaque muscle gastro et injectez 100 microlitres de dai dans le muscle avant de retirer l’aiguille du muscle. Tirez sur le piston de la seringue pour vous assurer que le colorant ne coule plus de l’embout.

Attendez 10 secondes, puis retirez l’aiguille du muscle. Quatre à cinq jours sont nécessaires pour que la distribution du colorant se mette en place pour la dissection. Placez un bécher avec 10 millilitres de HBSS, une boîte de Pétri de 35 millimètres et une boîte de Pétri de 100 millimètres sur de la glace.

Ensuite, pesez sept milligrammes de collagénase, un milligramme d’ADN et 10 milligrammes de trypsine préchauffés, un bain d’eau agitée à 37 degrés Celsius et réchauffez un tube à centrifuger de 15 millilitres contenant 10 millilitres d’EBSS dans le bain. Après avoir euthanasié le rat avant la dissection, ouvrez rapidement la peau du dos de l’animal. Ensuite, retirez le tissu conjonctif et musculaire le long de la colonne vertébrale pour une meilleure exposition.

Par la suite, retirez la section lombaire de la colonne vertébrale. Ensuite, placez la colonne vertébrale isolée dans la boîte de Pétri de 100 millimètres. Appliquez une solution HBSS réfrigérée à l’aide d’une pipette de pâturage stérile pour maintenir la préparation humide et froide.

Coupez les muscles des côtés de la colonne vertébrale. Effectuez une laminectomie dorsale à l’aide de rongeurs ou de ciseaux pour retirer délicatement l’os et fermer les cavités contenant les ganglions de la racine dorsale. Plusieurs fois. Appliquez du HBSS glacé pendant cette procédure.

Au microscope, isolez le DRG en coupant les nerfs périphériques et centraux, en laissant un à deux millimètres de nerf pour faciliter la manipulation des ganglions. Placez ensuite le DRG isolé dans la boîte de Pétri de 35 millimètres contenant un tampon HBSS glacé. Répétez les procédures jusqu’à ce que tous les DRG L quatre et L cinq aient été isolés.

Retirez l’excès de nerfs et de vaisseaux sanguins à l’aide de micro-ciseaux et de pinces. Coupez le DRG pour une meilleure exposition aux enzymes, mais ne dégainez pas le DRG pour la dissociation des neurones DRG. Ajoutez les enzymes dans le média EBSS chaud, puis vortex pour dissoudre et filtrer la stérilisation.

Ensuite, placez tout le DRG dans la solution enzymatique avec une tête de tuyau de pâturage stérile. Ensuite, faites bouillir le ballon avec 95 % d’oxygène et 5 % de CO2 pendant 60 secondes avant de le recouvrir hermétiquement. Ensuite, incubez le ballon dans le bain-marie à 37 degrés Celsius en secouant pendant 60 minutes à 240 tr/min.

À la fin de l’incubation vigoureusement. Agiter 50 fois le ballon pour dissocier le DRG dans des conditions stériles. Ajoutez cinq millilitres de MEM plus dans le ballon pour arrêter les activités enzymatiques.

Transférez le contenu du ballon dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres et centrifugez-le à 16 fois G pendant six minutes. Ensuite, retirez et jetez le surnageant. Ajoutez doucement cinq millilitres de MEM plus au tritrate d’échantillon à l’aide d’une pipette.

Pour briser l’étape de centrifugation répétée des granulés, retirez et jetez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de MEM plus du tritrate doucement avec la pointe de pipette d’un millilitre sur une pipette pour former une suspension cellulaire. Après cela, placez un couvercle en verre recouvert de polylysine dans une parabole vide et stérile de 35 millimètres. Ajoutez ensuite une goutte de la suspension cellulaire au centre de la lamelle.

Répétez cette procédure jusqu’à ce que la solution cellulaire soit épuisée. Placez les paraboles de 35 millimètres dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant une heure pour permettre aux neurones d’adhérer aux lèvres du couvercle au bout d’une heure. Ajoutez deux millilitres supplémentaires de média dans chaque plat et remettez-les dans l’incubateur pour effectuer l’enregistrement par pince de patch.

Tout d’abord, identifiez les neurones DRG marqués au colorant à l’aide d’un microscope avec épifluorescence. Ensuite, remplissez l’électrode de verre avec une solution interne. Tapotez doucement pour éliminer les bulles piégées.

Placez ensuite l’électrode dans le porte-électrode. Abaissez l’électrode sur la cellule à l’aide d’un micromanipulateur. Une fois que l’électrode touche la cellule, appliquez une légère aspiration via le tube d’aspiration jusqu’à ce qu’un joint étanche se forme.

Fixez ensuite la tension de la membrane au potentiel de maintien souhaité. Obtenez la configuration de la pince de patch de cellule entière en appliquant une aspiration plus forte. Pour retirer le patch de membrane à l’extrémité de l’électrode, une fois que la configuration de la pince de patch de cellule entière a été établie, démarrez l’enregistrement.

Dans cette procédure, fixez les neurones sur les lamelles avec 4 % de paraformaldéhyde pendant une heure. Ensuite, perméez les neurones avec 2 %tween 20 dans PBS pendant 10 minutes. Ensuite, incubez les cellules dans une solution bloquante pendant une heure.

Les cellules d’essai sont incubées dans la solution bloquante et l’anticorps primaire pendant la nuit. L’ensemble des neurones de contrôle est laissé à incuber pendant la nuit dans une solution bloquante sans aucun anticorps primaire. Le lendemain, laver les lamelles avec un tampon PBS trois fois pendant cinq minutes chacune, suivies de deux lavages de cinq minutes chacun avec 1 % entre 20 pour éliminer l’anticorps primaire non lié.

Ensuite, incubez les lamelles de test et de contrôle avec l’anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence pendant 30 minutes, qui se lie à l’anticorps primaire pour permettre la visualisation. Après cela, lavez les lamelles avec du PB S3 plusieurs fois pendant cinq minutes chacune pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires. Ensuite, montez les lamelles de recouvrement sur une glissière en verre propre à l’aide d’un support de montage.

Appliquez ensuite du vernis à ongles transparent sur le bord de la lamelle pour la fixer en place. Une fois secs, visualisez les neurones et capturez des images à l’aide du logiciel accompagnant le microscope à fluorescence. Il s’agit d’une représentation de l’injection de Dai dans le muscle gastro et du transport rétrograde du muscle vers le DRG.

Les DRG L quatre et L cinq sont étiquetés ici. Les neurones afférents sont représentés dans l’image en champ clair et cette image fluorescente montre un neurone afférent musculaire marqué à un colorant. Cet histogramme montre l’intensité fluorescente DII des neurones sensoriels.

Le grand pic provient de neurones non marqués et est ajusté avec une équation gaussienne pour déterminer l’intensité moyenne et l’écart-type. La ligne verticale pointillée représente le seuil pour l’étiquetage DAI. L’histogramme comprend des données provenant de 1047 neurones, dont 167 sont marqués avec dai.

Voici un neurone afférent musculaire représentatif avec un bon contrôle de la tension membranaire. Les courants sodiques à moins 20, moins 10 et zéro millivolts sont indiqués à gauche et la relation courant-tension est illustrée à droite. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de disséquer rapidement mais doucement les DRG et de garder la préparation humide à plusieurs reprises au code d’glace hbss.

À la suite de cette procédure, d’autres neurones efférents peuvent être marqués et identifiés pour comprendre leur rôle dans la physiologie.