Name: MicroRNA In situ Hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Découvrez l'hybridation in situ colorimétrique pour détecter les microARN dans les coupes rénales fixées au formol. Cette méthode permet de localiser et quantifier l'expression des microARN dans les tissus rénaux.

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Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health accorde HL082798 et HL111580.

Une. coupes de tissus rénaux <ol><li> Fixés au formol (10%) des sections de rein paraffine sont coupés sur des lames de microscope à 5 mm d&#39;épaisseur en utilisant un Microm HM 355 S. Les lames peuvent être stockées pendant plusieurs mois avant l&#39;analyse. </li></ol> 2. Préparation de la solution <ol><li> Préparer 1 L de PBS 1x dans le trou DDH 2 O dans une bouteille avec vis autoclavable. Remplir une autre bouteille de 1 L de ddH 2 O. Ajouter 1 ml de DEPC à chaque bouteille, couvercle et agiter vigoureusement. Que les solutions reposer toute la nuit à température ambiante pour détruire RNAses puis autoclave. Ajouter 400 ml de Tween-20 à 1 L de PBS 1x à faire du PBS-T. </li><li> Préparer le tampon de la protéinase K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 et 1 mM de CaCl2 dans de l&#39;eau traitée au DEPC). </li><li> Préparer une solution de 0,2% de glycine dans du PBS-T. </li></ol> 3. Préparation des tissus <ol><li> Préparer un grand volume de tampon d&#39;hybridation (de 50 à 100 ml), composée de 50% de formamide, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2mM d&#39;acide citrique pour ajuster le pH à 6, 50 pg / ml d&#39;héparine, et 500 pg / ml d&#39;ARN de levure dans DEPC traitées ddH 2 O. Diviser en aliquotes de 1 ml et conserver à -80 ° C. </li><li> Retirez la paraffine du tissu par lavage 3x dans le xylène frais pendant 5 minutes chacun. </li><li> Réhydrater les coupes de tissu par incubation 5 min dans des concentrations décroissantes d&#39;éthanol (100%, 75%, 50% et 25%) dans le trou DDH 2 O. </li><li> Traiter les diapositives avec DEPC suffisamment pour couvrir complètement les coupes de tissu (environ 0,4 à 0,5 ml) pendant 1 min. Assurez-vous que les tissus ne se dessèchent pas. </li><li> Rincer les lames dans DEPC traitées PBS-T deux fois pendant 5 min, recueillir le DEPC contenant des déchets pour une élimination appropriée. Tous les réactifs doivent être DEPC traitées pour éliminer RNAses partir de ce point. </li><li> Préchauffer la protéinase K en mémoire tampon et ajouter la protéinase K à une concentration finale de 10 pg / ml. Couvrir les coupes de tissus avec une solution de protéinase K et incuber à 37 º C pendant 5 min. </li><li> Supprimer rapidement les proteinassolution e K et ajouter 0,2% de glycine dans du PBS-T pendant 30 sec. </li><li> Rincer les lames dans DEPC traitées PBS-T deux fois pendant 30 secondes chacun. </li><li> Fixer sections fraîchement paraformaldéhyde 4% pendant 10 min. </li></ol> 4. Hybridation <ol><li> Ajouter 50 ul de tampon d&#39;hybridation (formamide 50%, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2 mM d&#39;acide citrique pour ajuster le pH à 6, 50 pg / ml d&#39;héparine, 500 ug / ml d&#39;ARN de levure) par coupe de tissu et recouvrir avec de la RNase HybriSlips libres couper juste plus grande que les sections de tissu. </li><li> Sections Prehybridize à humidité contrôlée four à hybridation pendant 2 heures à la température d&#39;hybridation calculée pour le «sonde digoxigénine marqué 3 (habituellement l&#39;ADN Tm de la sonde -21 ° C, (c&#39;est à dire 54 ° C pour miR-382, la sonde ADN Tm = 75 ° C ), en utilisant des lingettes de laboratoire de tissus trempés dans 50% formamide/50% 5x SSC à garder la chambre humidifié. </li><li> Diluer la sonde miARN, le contrôle positif (U6, petit ARN nucléaire) et de contrôle négatif (brouillésséquence) à 40 nM dans du tampon d&#39;hybridation (75 pi de tampon est nécessaire pour la section). </li><li> Chauffer la sonde dans le tampon d&#39;hybridation à 65 ° C pendant 5 min. </li><li> Retirer les lames de l&#39;hybridation four et retirer les lamelles et le tampon d&#39;hybridation excès de pré-hybridation. </li><li> Ajouter 75 ul de sonde contenant un tampon par section de tissu, directement au tissu. Couvrir tissu avec HybriSlips juste assez larges pour couvrir les coupes de tissus. </li><li> Garder le niveau de support de diapositives, de retour à l&#39;hybridation four pour une nuit d&#39;incubation à la température de l&#39;étape 4.2 (environ 16 heures). </li></ol> 5. Rigueur de lavage <ol><li> Ajouter 200 ul de 2 x SSC, on chauffe à la température d&#39;hybridation, un peu moins d&#39;un bord de la lamelle pour aider à libérer la lamelle couvre-objet à partir du tissu. Retirer la lamelle en inclinant la lame. </li><li> Laver les lames dans 200 ul de formamide à 50%, 50% SSC 2x à 3x hybridation de température pendant 30 minutes chacun. </li><li> Rincerles lames 5x dans du PBS-T à la température ambiante pendant 5 min chacun sur agitateur orbital à vitesse réduite. </li></ol> 6. Détection <ol><li> Incuber lame dans du tampon de blocage (2% de sérum de chèvre ou de cheval, 2 mg / ml de BSA dans du PBS-T) pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur orbital à vitesse réduite. </li><li> Diluer fragments anti-DIG-AP Fab dans un tampon de blocage à 1:100. Ajouter 100 ul par section de tissu et couvrir avec HybriSlips coupé juste assez grand pour couvrir la section. </li><li> Incuber l&#39;anticorps dans une chambre humidifiée à 4 ° C pendant une nuit (environ 16 heures). </li><li> Laver les lames dans du PBS-T 7x, pendant 5 min chacun sur agitateur orbital à vitesse réduite. </li><li> Laver les lames dans du tampon AP (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, pendant 5 minutes chacune. </li><li> Ajouter la solution de NBT / BCIP de tampon AP (200 μl/10 tampon ml) </li><li> Ajouter 400-500 ml de solution diluée NBT / BCIP à chaque diapositive pour couvrir complètement toutes les sections de tissus. Développer dans un endroit sombre, niveau, Humidified chambre pour 4-5 heures. </li></ol> 7. Diapositives de montage <ol><li> Déshydrater sections dans des concentrations croissantes d&#39;éthanol (25%, 50%, 75%, 100%) pendant 5 min chacun. </li><li> Incuber dans 5x xylène afin de dégager sections. </li><li> Mont glisse dans Permount milieu de montage et sécher pendant la nuit. </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
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<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
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<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

Il n&#39;y a rien à divulguer.

Le but de cet article est de décrire un protocole de miARN hybridation in situ qui fonctionne bien dans les tissus rénaux fixés au formol. Tout en travaillant sur ce protocole plusieurs sources importantes d&#39;artefact coloration ont été identifiés. Une attention particulière à ces points peut aider à éviter la coloration artefact et augmenter la probabilité d&#39;une course de ISH succès. Une des causes les plus évitables de artefact coloration peut se produire lorsque des coupes...

MicroARN sont de petite taille (environ 22 nucléotides de long) non codantes des ARN qui sont produites de façon endogène. Ils fonctionnent généralement à supprimer l&#39;expression de la protéine par la répression de translation ou la dégradation de l&#39;ARNm. miARN se lient à des cibles ARNm avec complémentarité incomplète, ce qui permet à un seul miARN pour supprimer plusieurs cibles. Comprendre les types et les structures cellulaires expriment miARN est une partie importante de la compréhension des mécanismes par lesquels des modifications dans miRNA influence d&#39;expression cellulaire et des phénotypes de tissus. Bien que les méthodes telles que le séquençage miRNA, qPCR et Northern blot peuvent être utilisés pour la détection de miARN dans les tissus entiers, cette approche ne permet pas de déterminer quel type de cellule spécifique ils sont venus dans un tissu donné. Dissection de composants cellulaires et structurelles avant l&#39;analyse à l&#39;aide de ces méthodes peut être très difficile et les conditions nécessaires à la réalisation des isolations appropriées peut conduire à alterations dans l&#39;expression génique ou de la dégradation d&#39;ARN. microRNA hybridation in situ est une méthode utilisée pour visualiser l&#39;emplacement de micro-ARN et des niveaux d&#39;expression dans les tissus. Cette technique est particulièrement utile dans les tissus constitués de structures hétérogènes, tels que le rein. Les microARN ont été montré à jouer un rôle de régulation dans 2,3 de développement du rein et de la physiologie 4. modifications d&#39;expression de microARN ont également été montré pour être impliqué dans la pathologie rénale telles que la fibrose 5-10, la néphropathie diabétique 7, carcinome rénal 11,12, et l&#39;insuffisance rénale aiguë 13. Dans notre recherche, nous avons constaté que l&#39;optimisation de microARN hybridation in situ pour les tissus rénaux en était précieux pour déterminer les emplacements exacts structurelles d&#39;expression des miARN dans la santé et la maladie 14. Détermination de l&#39;expression tubulaire et cellulaire de différentes microARN est important parce que leur réglementation de targets peuvent dépendre de fonctions cellulaires. Dans les états pathologiques, il est également important de déterminer comment altérations de l&#39;expression des miARN peuvent avoir des répercussions sur la fonction. Le but de la méthode décrite ici était de construire des méthodologies ISH existants élaborés par Kloosterman et al. 15, d&#39;autres enquêteurs 16,17, et ceux suggérés par Exiqon 1 et d&#39;optimiser la méthode pour les tissus rénaux fixes au formol. Nous avons utilisé cette méthode avec succès pour identifier les différences régionales dans les microARN miR rénale expression-382 avec obstruction urétérale unilatérale 18. Cette approche peut être utilisée avec d&#39;autres tissus, avec une optimisation supplémentaire.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Ultra Pure</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>ARN de levure</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- sonde miARN</td><td>Exiqon</td><td>miR dépendant-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Sonde miR brouillée</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- U6 sonde miR</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigénine-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-lames</td><td>Fisher</td><td>Fit to tissue size</td><td></td></tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation coulissant</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de plateau en aluminium</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Insert de grille en acier inoxydable</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna<em&gt; in situ</em&gt; hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

Dans cet article, on décrit un procédé de détection colorimétrique de miARN dans le rein par hybridation in situ avec de la digoxigénine marqué dans les sondes de microARN. Ce protocole, développé à l&#39;origine par Kloosterman et ses collègues pour une large utilisation de sondes Exiqon miRNA 1, a été modifié pour surmonter les difficultés inhérentes à l&#39;analyse des miRNA dans les tissus rénaux. Il s&#39;agit notamment des questions telles que l&#39;identification de la structure et difficile à retirer la sonde résiduelle et anticorps. L&#39;utilisation de relativement mince, 5 mm d&#39;épaisseur, les coupes de tissus autorisés pour une visualisation claire des structures du rein, alors qu&#39;un signal de la sonde solide a été maintenu dans les cellules. En outre, la concentration de la sonde et des conditions d&#39;incubation ont été optimisés pour faciliter la visualisation de l&#39;expression de microARN avec faible bruit de fond et le signal non spécifique. Ici, le protocole optimisé est décrit, couvrant la collecte de tissu initial et de la préparation à travers le montage de lames à la fin de la procédure. Le compone de basents de ce protocole peuvent être modifiés pour l&#39;application à d&#39;autres tissus et des modèles de culture cellulaire.

Les zones d&#39;une section de tissu qui se dessécher pendant les hybridations, des incubations ou étapes de lavage généralement finissent par coloration plus sombre lors de l&#39;élaboration du NBT / BCIP. Figure 1 montre une partie d&#39;une section de rein, dans lequel le HybriSlip glissé hors du bord d&#39; le tissu, lui permettant de devenir partiellement déshydraté. Malgré la réhydratation et la couverture dans les étapes restantes, le signal dans la partie déshydraté est artificiellement élevé. <...

Cet article décrit un protocole d&#39;hybridation in situ optimisé pour la détection colorimétrique de l&#39;expression de micro-ARN dans des sections de rein fixés au formol.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de localiser et de quantifier l'expression des microARN dans les tissus rénaux. Cela est réalisé en premier lieu par l'hybridation d'une sonde marquée à la digoxigénine avec un microARN donné au sein du tissu rénal. Dans un deuxième temps, un anticorps dirigé contre la digoxigénine, conjugué à une phosphatase alcaline, est incubé avec le tissu.Ensuite, un substrat N-B-T-B-C-I-P est ajouté au tissu afin de visualiser l'emplacement du micro ARN grâce au développement d'un produit de couleur bleue aux sites d'hybridation des sondes de micro ARN. Les résultats obtenus montrent où les micro ARN sont exprimés dans les régions du rein et les segments du néphron, en fonction de l'hybridation de sondes complémentaires de micro ARN. Cette procédure utilise des coupes rénales en paraffine fixées et incluses en milieu formolé, montées sur des lames de microscope à une épaisseur de cinq micromètres. Pour préparer les coupes rénales en vue de l'analyse, commencez par éliminer la paraffine du tissu par trois lavages dans du xylène frais, chacun de cinq minutes.Réhydrater chaque section tissulaire par des incubations de cinq minutes dans des concentrations décroissantes d'éthanol dans de l'eau doublement distillée. Ensuite, traiter les lames avec suffisamment de dathyl, de percarbonate ou de desy pour recouvrir complètement les sections tissulaires pendant une minute. Veiller à ce que les tissus ne s'assèchent pas.Retirer le dessy et rincer les lames dans du PBST pendant cinq minutes, deux fois. S'assurer que le dessy contenant les déchets est collecté pour une élimination appropriée.À partir de ce stade, tous les réactifs doivent être traités pour éliminer les ARN. Ajouter de la protéinase K dans le tampon de protéinase K préalablement réchauffé, afin d'obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Recouvrir les sections tissulaires avec la solution de protéinase K et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirer rapidement la solution de protéinase K, puis ajouter 0,2 % de glycine dans du PBST pendant 30 secondes.Rincez les lames dans du PBST deux fois pendant 30 secondes chacune. Enfin, fixez les sections de tissu dans du paraformaldéhyde 4 % fraîchement préparé pendant 10 minutes.Pour commencer cette procédure, ajouter 50 microlitres de tampon d'hybridation par section tissulaire et recouvrir avec des lamelles d'hybridation RNAses libres, légèrement plus grandes que les sections tissulaires. Placer les lames dans une chambre humidifiée par des lingettes de laboratoire imprégnées de 50 % de formamide et 50 % de 5X SSC. Pré-hybridiser les sections tissulaires en plaçant la chambre humidifiée pendant deux heures dans une étuve à la température d'hybridation déterminée pour la sonde marquée à l'oxygène digoxigénine en position trois prime. La température d'hybridation pour la sonde est généralement la température de fusion de l'ADN, ou TM de la sonde, moins 21 degrés Celsius.Par exemple, la température d'hybridation de la sonde 3 82 est de 54 degrés Celsius car sa température de fusion (TM) est de 75 degrés Celsius. Préparez la sonde d'ARN micro et les contrôles positif et négatif en diluant chacun à 40 nano-molaire dans le tampon d'hybridation. Le contrôle positif est l'ARN nucléaire petit U six et le contrôle négatif est une séquence aléatoire.Chauffer la sonde et les contrôles à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirer les lames du four d'hybridation. Enlever les lamelles et l'excès de tampon d'hybridation du montage de pré-hybridation.Ajouter 75 microlitres de sonde contenant du tampon directement sur chaque section tissulaire. Recouvrir avec des lamelles de taille suffisante pour couvrir uniquement les sections tissulaires. Garder le porte-lame à l’horizontale.Remettre les lames dans le four d'hybridation à la température appropriée. Incuber toute la nuit pendant environ 16 heures. Une fois l'hybridation terminée, retirer les lames du four d'hybridation.Ajouter 200 microlitres de deux XSSC chauffé à la température d'hybridation juste sous un bord de la lame couvre-objet afin d'aider à détacher la lame couvre-objet du tissu. Retirer la lame couvre-objet en inclinant la lame. Une fois les lames couvre-objets retirées, laver les lames avec 200 microlitres de 50 % de formamide à 50 % de deux XSSC à la température d'hybridation déterminée, trois fois pendant 30 minutes chacune.Rincez les lames cinq fois dans du PBST à température ambiante pendant cinq minutes chacune sur un agitateur orbital à faible vitesse. Commencez cette procédure en incubant les lames dans du tampon de blocage pendant une heure à température ambiante sur un agitateur orbital à faible vitesse. Après une heure, ajoutez 100 microlitres de fragments FAB anti-dig AP à chaque section tissulaire et recouvrez avec des lamelles.Decouper suffisamment grand pour couvrir la section. Incuber les lames dans une chambre humidifiée à quatre degrés Celsius pendant la nuit ou environ 16 heures le jour suivant. Laver les lames sept fois dans du PBST à température ambiante pendant cinq minutes chaque fois sur un agitateur orbital réglé à faible vitesse.Ensuite, laver les lames dans le tampon AP trois fois, cinq minutes chacune. Préparer la solution de développement N-B-T-B-C-I-P en ajoutant 200 microlitres de solution N-B-T-B-C-I-P à 10 millilitres de tampon AP. Ajouter de 400 à 500 microlitres de la solution N-B-T-B-C-I-P diluée à chaque lame afin de recouvrir complètement toutes les sections tissulaires.Développer dans une chambre sombre et humidifiée pendant quatre à cinq heures à température ambiante une fois la détection colorimétrique terminée. Déshydrater les sections dans des concentrations croissantes d'éthanol pendant cinq minutes chacune, puis clarifier les sections par cinq incubations dans le xylène, cinq minutes à chaque fois. Enfin, monter les lames dans un milieu de montage Permount et les faire sécher toute la nuit.Il est essentiel de veiller à ce que la section tissulaire ne s'assèche pas pour assurer la réussite de ce protocole d'hybridation in situ. La partie gauche de cette figure montre une portion d'une section de rein où le lamelle d'hybridation s'est détachée du bord du tissu, entraînant une déshydratation partielle. Malgré la réhydratation et la couverture aux étapes suivantes, le signal dans la portion déshydratée est artificiellement élevé par rapport à la portion restée recouverte par la lamelle d'hybridation.La barre de calibration représente 100 microns sur cette image. L'importance d'optimiser la durée de développement de N-B-T-B-C-I-P est illustrée dans les figures suivantes. Le panneau A montre que des périodes de développement supérieures à quatre ou cinq heures entraînent un développement coloré non spécifique marqué et des tissus contrôles pour micro ARN brouillés dans tout le rein.Le panneau B montre que des incubations de plus de quatre à cinq heures ne conduisent pas à une amélioration supplémentaire du signal lorsque les reins sont analysés pour des cibles abondantes telles que la contrôle ARN nucléolaire petit U six. Ces figures, adaptées d'une étude précédente, confirment l'applicabilité de cette méthode d'hybridation in situ à la détection des micro ARN dans le tissu rénal. Le panneau A présente des images représentatives de l'expression de mere 3 82 obtenues par hybridation in situ sur des sections rénales de souris avec ou sans obstruction unilatérale de l'uretère, ou UUO, et traitées soit avec anti-ME 3 82, soit avec une séquence contrôle désordonnée. L'UUO induit une augmentation de l'expression de mere 3 82, comme le montre la coloration plus foncée dans le tissu UUO plus antis désordonné par rapport au tissu sham plus antis désordonné.Cet accroissement a été bloqué par un traitement avec l'anti-ME 3 82. Les graphiques du panneau B montrent l'expression de mere 3 82 chez des souris traitées au sham plus antis désordonné, exprimée en pourcentage de la densité optique intégrée moyenne. Mesure de l'intensité des pixels telle qu'observée, l'UUO induit un accroissement significatif de l'expression de mere 3 82 dans la médulla externe et interne, et l'anti-ME 3 82 bloque cet effet.Cet accroissement, qui peut entièrement être visualisé et mesuré par hybridation in situ de microARN. Ces résultats sont également cohérents avec des résultats obtenus par RT-qPCR non montrés ici, indiquant que l'utilisation de l'hybridation INI deux pour détecter l'expression du microARN 3 82 dans le rein fixé au formaldéhyde est suffisamment sensible pour fournir des résultats quantifiables reflétant l'analyse d'expression basée sur la RT-qPCR. De plus, l'hybridation C deux permet la mesure de différences régionales distinctes dans l'expression des microARN au sein du rein.

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