La culture et entretien

L'objectif général de cette procédure est d'isoler C. difficile à partir d'échantillons fécaux afin de cultiver C. difficile pour la préparation de stocks glycérolés destinés à un stockage à long terme, ainsi que pour préparer et dénombrer des stocks de spores destinés à diverses applications en aval. Cette procédure consiste d'abord à isoler C. difficile à partir d'échantillons de selles par ensemencement sur un milieu sélectif. La deuxième étape consiste à cultiver C. difficile en milieu liquide et à conserver des stocks à long terme de C. difficile dans du glycérol.

Ensuite, C difficile est prélevé à partir de stocks congelés dans du glycérol et étalé sur des boîtes de gélose. Dans la dernière étape, les stocks de spores de C difficile sont préparés et énumérés finalement en suivant ces protocoles. C difficile peut être cultivé sur divers milieux afin de vérifier et confirmer son identité, et peut être mis en culture et maintenu avec succès.

Ces tiges de glycérol et ces cultures peuvent être utilisées ultérieurement dans de nombreuses applications en aval, notamment des études sur des animaux et d'autres études en biologie moléculaire. Le principal avantage de l'utilisation d'une enceinte anaérobie en vinyle pour cultiver C difficile par rapport à d'autres méthodes, comme les bocaux à bougie, réside dans la possibilité de maintenir un environnement strictement anaérobie, permettant ainsi une croissance constante et fiable de C difficile. En général, les personnes novices dans ces techniques peuvent rencontrer des difficultés dues au manque de dextérité à l'intérieur de l'enceinte causé par les gants, ainsi qu'au besoin crucial de planifier leurs expériences à l'avance.

Un technicien de mon laboratoire, Jose Suarez, démontrera ces procédures au début. Cette procédure peut être réalisée en conditions aérobies. Tout d'abord, peser l'échantillon de selles.

Cela est nécessaire pour dénombrer les C. difficile présents dans les selles. Ensuite, resuspendez l'échantillon de selles dans un XPBS et vortexez pour vous assurer que l'échantillon est complètement resuspendu. Puis, effectuez des dilutions sériées de l'échantillon de selles resuspendu dans un XPBS afin d'isoler ou de dénombrer correctement les unités formant des colonies, ou UFC, par gramme de selles à partir de ce point.

Réalisez la procédure dans des conditions anaérobies afin de garantir que les cellules végétatives de C difficile ne soient exposées à aucun oxygène. La chambre anaérobie utilisée dans cette expérience est maintenue à 37 degrés Celsius. En utilisant une technique aseptique.

Appliquer 100 microlitres de chaque dilution en série sur des boîtes de gélose Toro collate oxétane, cyclo Seine, fructose agar ou T-C-C-F-A. Ces boîtes ont été pré-réduites pendant au moins une à deux heures dans une chambre anaérobie afin de garantir l'élimination de l'oxygène résiduel. Pour isoler des colonies en vue d'une numération précise ou d'autres applications en aval.

Utilisez une boucle d'ensemencement stérile pour étaler uniformément la culture appliquée à la surface de la boîte de T-C-C-F-A. Incubez les boîtes anaérobiquement pendant 48 heures à 37 degrés Celsius. Identifiez les colonies de c difficile en fonction de leur aspect plat et irrégulier, semblable à du verre dépoli, afin de garantir que les formes végétatives de c difficile ne soient pas tuées par l'exposition à l'oxygène.

Les boîtes destinées à l'isolement de colonies pour des applications ultérieures doivent rester en permanence à l'intérieur de la chambre anaérobie. Pour le dénombrement des colonies, les boîtes peuvent être sorties de la chambre anaérobie. Notez qu'une fois qu'une boîte est sortie de la chambre, les formes végétatives de C. difficile seront exposées à l'oxygène et mourront.

Les colonies de C difficile ne peuvent pas être récupérées, même si la boîte est replacée dans la chambre. Comptez les colonies de C difficile pour chaque dilution et calculez le nombre d'UFC par gramme d'échantillon de selles afin de réaliser une culture et de préparer des stocks glycérolés de C difficile. Utilisez une anse de prélèvement stérile pour prélever une colonie isolée et réaliser un étalage sur un bouillon infusé cerveau-cœur préalablement réduit.

Compléter la gélose contenant de l'extrait de levure ou la gélose BHIS avec 0,03 % de cystéine, puis ensemencer individuellement les colonies et les quadrants à l’aide d’une nouvelle anse stérile pour chaque quadrant. Incuber les géloses anaérobiquement à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Une fois les colonies isolées apparues sur les géloses BHIS, prélever une colonie isolée individuelle et resuspendre la colonie dans 10 millilitres de milieu liquide BHIS pré-réduit, complété avec 0,03 % de L-cystéine, puis incuber toute la nuit.

De manière anaérobie à 37 degrés Celsius ou jusqu'à ce que la culture devienne trouble. Le jour suivant, ajouter 333 microlitres de glycérol à 50 % et 666 microlitres de la culture de C. difficile dans un tube cryogénique de 1,8 millilitre. Pour préparer un stock de glycérol à 15 % de la souche isolée, refermer hermétiquement le tube cryogénique et mélanger.

Retirer immédiatement la souche de la chambre anaérobie et la placer dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour une conservation à long terme. Pour commencer cette procédure, retirer la souche de glycérol congelée de Clostridioides difficile du congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour éviter la décongélation.

Placer immédiatement la cryovial de stock glycérol congelé dans un porte-tubes préalablement stocké à moins 80 degrés Celsius. Introduire la cryovial de stock glycérol dans l'enceinte anaérobie à l'aide d'une technique aseptique et d'un anneau d'inoculation stérile. Déposer une petite quantité du stock sur la boîte de culture et tracer des stries sur un quadrant de la boîte.

Faites pivoter la boîte de 90 degrés et, à l’aide d’une nouvelle boucle d’inoculation stérile, tracez des stries en travers du deuxième quadrant. Répétez l’opération pour les troisième et quatrième quadrants afin de garantir l’isolement de colonies individuelles. Retirez immédiatement la cryovial de glycérol congelée de la chambre anaérobie et remettez-la au congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Incuber la plaque anaérobiquement toute la nuit à 37 degrés Celsius pour purifier les spores à partir d'une culture de C. difficile. Ensemencer des souches à partir d'un stock de glycérol congelé sur des plaques BHIS pré-réduites. Suivre la procédure démontrée dans le segment précédent.

Incuber anaérobiquement toute la nuit à 37 degrés Celsius le jour suivant. Repiquer des colonies individuelles dans plusieurs boîtes de culture 70-30 préalablement réduites. Incuber anaérobiquement à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures.

Une fois les spores formées, retirez les boîtes de la chambre anaérobie. Grattez les boîtes à l’aide d’un anneau d’inoculation stérile et remettez en suspension les cellules dans 10 millilitres de PBS 1× stérile. Jetez les boîtes, puis centrifugez les cellules à 3000 G pendant 15 minutes.

Éliminer le surnageant, ajouter un millilitre de PBS 1X pour la resuspension, resuspendre et recentrifuger de cette manière. Laver les cellules deux fois dans du PBS, puis incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit pour faciliter la lyse des cellules végétatives et des cellules mères le jour suivant ; incuber ensuite à 70 degrés Celsius pendant 20 minutes afin d'éliminer toute cellule végétative résiduelle. Pour déterminer le nombre d'UFC par millilitre, diluer en série chaque préparation de spores dans du PBS 1X et ensemencer sur des géloses BHIS pré-réduites additionnées de 0,1 % de tétraoxyde de sodium, puis incuber les géloses à 37 degrés Celsius pendant au moins 24 heures avant de dénombrer les colonies.

Les spores peuvent être conservées dans un XPBS soit à température ambiante pour une conservation à court terme, soit à quatre degrés Celsius pour une conservation à long terme. A. Un exemple de C. difficile cultivé sur milieu BHIS et sur milieu Columbia anaérobie au sang de mouton est visible ici.

C. difficile forme des colonies irrégulières, plates, présentant un aspect mat semblable au verre dépoli, visible sur les deux milieux. Le panneau A montre un isolat clinique sensible à l'érythromycine, C. difficile 630 E, cultivé sur gélose BHIS, un milieu enrichi non sélectif, pendant 24 heures. À 37 degrés Celsius, les colonies sur gélose Columbia au sang de mouton anaérobie, illustrées dans le panneau B, apparaissent similaires à celles cultivées sur BHIS sous lumière blanche.

Cependant, l'utilisation de ce milieu permet également la détection de la fluorescence verdâtre ou citronnée exhibée par C difficile sous lumière ultraviolette à onde longue, illustrée dans le panneau C suivant cette procédure. D'autres méthodes telles que les courbes de croissance en milieu liquide, l'isolement de colonies, l'analyse d'ADN et d'ARN, la PCR et d'autres techniques de biologie moléculaire, ainsi que des manipulations adaptées à C difficile, y compris l'utilisation de spores de C difficile pour des études animales, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires de biologie moléculaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler, de cultiver et de maintenir les cellules végétatives et les spores de C difficile dans un environnement anaérobie.

N'oubliez pas que *C. difficile* est un agent pathogène humain et animal pouvant provoquer des maladies gastro-intestinales. Les expériences avec *C. difficile* doivent être réalisées dans des conditions appropriées de niveau de biosécurité 2.