Name: La culture et entretien Clostridium difficile Dans un environnement anaérobie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-14T21:25:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver Clostridium difficile en conditions anaérobies strictes pour la recherche en microbiologie. Cette méthode permet de préparer des stocks de glycérol et des spores pour des applications cliniques et moléculaires.

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Nous tenons à remercier Coy laboratoires pour fournir aimablement des photos de la chambre anaérobie. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé subvention DK087763 (SMM) et un curriculum STEP / HHMI développement de la fraternité (ANE).

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<li>Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cycloserine-cefoxitin-fructose+agar+%28CCFA%29+and+taurocholate-CCFA+for+recovery+of+Clostridium+difficile+during+surveillance+of+hospitalized+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).</li>
<li>Marler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+cultural+procedures+for+isolation+of+Clostridium+difficile+from+stools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools.</a> J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).</li>
<li>Sorg, J. A., Dineen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).</li>
<li>Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).</li>
<li>Lemee, L., Pons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for Clostridium difficile.</a> Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).</li>
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<li>Burns, D. A., Minton, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+studies+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sporulation studies in Clostridium difficile.</a> J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).</li>
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<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+initiation+of+Clostridium+difficile+spore+germination+using+analogs+of+chenodeoxycholic+acid%2C+a+bile+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid.</a> J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).</li>
<li>O'Connor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+chromosomal+Clostridium+difficile+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants.</a> Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).</li>
<li>Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+recovery+of+Clostridium+difficile+from+an+environmental+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface.</a> J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).</li>
<li>Koch, C. J., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+oxygen+from+polystyrene+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">The release of oxygen from polystyrene Petri dishes.</a> Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).</li>
<li>Ethapa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+modulate+biofilm+formation+by+the+anaerobic+pathogen+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile.</a> J. Bacteriol. , (2012).</li>
<li>Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic cell culture.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).</li>
<li>Lyras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin+B+is+essential+for+virulence+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile.</a> Nature. 458, 1176-1179 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les méthodes décrites ici permettent de récupération simple et rapide de C. difficile à partir d&#39;une variété d&#39;échantillons de matières fécales, y compris les humains, les souris et les hamsters, ainsi que le stockage à long terme de C. difficile comme le glycérol ou spores des stocks. C. difficile peut être un organisme difficile à cultiver, mais une maintenance rigoureuse d&#39;un environnement anaérobie et l&#39;application des techniques d&#39;asepsie peut prévoir une forte croissa...

Clostridium difficile est une bactérie sporulée Gram positif qui est un anaérobie strict et un agent pathogène gastro-intestinal potentiellement mortelle de l&#39;homme et les animaux. Initialement décrit en 1935 comme un organisme commensal trouvé dans les échantillons de selles des nouveau-nés 1, C. difficile a été démontré plus tard d&#39;être l&#39;agent causal de la colite pseudomembraneuse associée à un traitement antibiotique 2. C. infections difficile (ICD) sont généralement précédés par un traitement antibiotique qui se traduit par la perturbation de la flore colique normale, la création d&#39;une niche pour C. difficile de prospérer 2. C. difficile est transmis sous forme d&#39;une spore dormante par l&#39;intermédiaire de la voie fécale-orale et par la suite germe dans le tractus gastro-intestinal, la production de cellules végétatives capable de générer plusieurs toxines et provoquer une maladie grave et la colite 3. CDI sont souvent réfractaires aux traitements conventionnels et ceux-ci enperfections sont souvent récurrentes 4. En conséquence, le CDI sont responsables de jusqu&#39;à 4,8 milliards de dollars en coûts de soins de santé aux États-Unis 5-7. C. difficile est très sensible même pour les niveaux d&#39;oxygène dans l&#39;environnement de faibles. Pour C. difficile de persister dans l&#39;environnement et être efficacement transmis d&#39;hôte à hôte, la formation d&#39;une spore métaboliquement inactif est critique 8. Étant donné que le maintien et la manipulation de laboratoire de C. difficile nécessite un environnement anaérobie contrôlée, ces techniques nécessitent l&#39;utilisation d&#39;une chambre anaérobie. L&#39;utilisation de chambres d&#39;anaérobie a abouti à la récupération accrue et l&#39;isolement des anaérobies stricts 9-11, et a permis un certain nombre de techniques moléculaires devant être exécutés dans une atmosphère anaérobie. En plus de C. difficile, l&#39;anaérobie utilisation de la chambre et l&#39;entretien décrits ici sont applicablesà d&#39;autres anaérobies stricts tels que d&#39;autres espèces de Clostridium (par exemple C. perfringens), d&#39;autres espèces gastro-intestinaux (par exemple, les espèces Bacteroides 12) et pathogènes parodontaux (par exemple, les espèces Peptostreptococcus 13).

<table><tbody><tr><td>Proteose Peptone n° 2</td><td>BD</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (anhydre)</td><td>Fisher</td><td>M65</td><td></td></tr><tr><td>á'...-Fructose</td><td>Fisher</td><td>L96</td><td></td></tr><tr><td>Taurocholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td></td></tr><tr><td>á'...-cyclosérine</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitin</td><td>Fluka</td><td>C4786</td><td></td></tr><tr><td>Cerveau cœur perfusion moyen</td><td>BD</td><td>237300</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine</td><td>Sigma</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>gélose au sang de mouton colombien</td><td>Fisher</td><td>L21928</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher</td><td>BP2291</td><td></td></tr><tr><td>Boucles d’inoculation stériles</td><td>Fisher</td><td>22363596</td><td></td></tr><tr><td>Écouvillons stériles</td><td>Fisher</td><td>1495990</td><td></td></tr><tr><td>Coy Chambre anaérobie en vinyle et accessoires</td><td>Coy Laboratory Products, Inc</td><td>Spécifié par le client</td><td>Ces articles sont commandés sur mesure selon les besoins</td></tr><tr> du laboratoire<td colspan="4">Materials<</td></tr><tr>td colspan="4">TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydre) 0,1 g Fructose 6 g gélose 20 g Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et un autoclave à 121 &deg ; C pendant 20 min pour stériliser. Après autoclavage, ajouter : 10 ml de taurocholate de sodium à 10 % (p/v), stérilisé par filtre (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 0,1 %) 25 ml de 10 mg/ml á'...-cyclosérine, stérilisé par filtre (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 250 &mu ; g/ml) 1,6 ml de céfoxitine à 10 mg/ml, stérilisée par filtre (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 16 &mu ; g/ml) BHIS Medium Infusion de cerveau 37 g Extrait de levure 5 g Pour les assiettes, ajoutez 15 g d’agar. Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et de l’autoclave à 121 &deg ; C pendant 20 min pour stériliser. Facultatif (ajouter après autoclavage) : 3 ml de L-cystéine à 10 % (p/v) (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 0,03 %) 10 ml de taurocholate de sodium à 10 % (p/v) (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 0,1 %) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protéase peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1,5 g Agar 15 g Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et un autoclave à 121 &deg ; C pendant 20 min à stériliser. Facultatif (ajouter après autoclavage) : 3 ml de 10 % (p/v) L-cystéine (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 0,03 %) 70:30 Moyen</fort> BactoPeptone 63 g Protéase peptone 3,5 g Infusion de cerveau et de cœur 11,1 g Extrait de levure 1,5 g (NH4)2SO4 0,7 g Tris base 1,06 g Pour les assiettes, ajouter 15 g d’agar. Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et de l’autoclave à 121 &deg ; C pendant 20 min pour stériliser. Après l’autoclavage, ajouter 3 ml de L-cystéine à 10 % (p/v) (concentration finale, 0,03 %). Blood agar L’utilisation de plaques de gélose au sang de mouton anaérobie Columbia préfabriquées (Fisher Scientific, L21928)35 est recommandée. 1X Saline tamponnée au phosphate (PBS) NaCl 8,01 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,27 g Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Filtre Stériliser avant utilisation.</td></tr></tbody></table>

la culture et entretien<em&gt; clostridium difficile</em&gt; dans un environnement anaérobie

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile est un anaérobie, bactérie à Gram positif sporogène qui est principalement responsable de la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA) et est un agent pathogène nosocomial important. C. difficile est notoirement difficile à isoler et à cultiver et est extrêmement sensible à même les niveaux d&#39;oxygène dans l&#39;environnement faibles. Ici, les procédés d&#39;isolement de C. difficile à partir d&#39;échantillons fécaux et la culture de la suite C. difficile pour la préparation des stocks de glycérol pour le stockage à long terme sont présentés. Des techniques pour la préparation et l&#39;énumération des stocks de spores dans le laboratoire pour une variété d&#39;applications en aval, y compris des études de microscopie et animaux sont également décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui maintient un milieu anaérobie cohérente afin de garantir des conditions adéquates pour optimale C. croissance difficile. Nous fournissons des protocoles pour le transfert de matériaux dans et hors de la chambre sans caen utilisant une contamination importante de l&#39;oxygène ainsi que des suggestions pour l&#39;entretien régulier nécessaire pour préserver l&#39;environnement anaérobie approprié pour efficace et cohérente C. culture difficile.

Un exemple de C. difficile cultivé sur BHIS Britannique et anaérobie moutons milieux de gélose au sang peut être vu sur la figure 2. C. difficile forme des colonies irrégulières qui sont à plat et possèdent un aspect de verre dépoli qui est évident sur ​​les deux médias. Ici, un isolat clinique érythromycine sensible de C. difficile, 630E 30, est cultivé sur gélose BHIS, un milieu non sélectif enrichi, pendant 24 heures à 37 ° C (Figure 2A). Colonie...

Clostridium difficile est une bactérie pathogène qui est une bactérie anaérobie stricte et provoque la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA). Ici, des méthodes d&#39;isolement, la culture et le maintien C. des cellules et des spores végétatives difficile sont décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui nécessite un entretien régulier pour assurer des conditions adéquates pour optimale C. culture difficile.

La culture et entretien<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Dans un environnement anaérobie

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler C. difficile à partir d'échantillons fécaux afin de cultiver C. difficile pour la préparation de stocks glycérolés destinés à un stockage à long terme, ainsi que pour préparer et dénombrer des stocks de spores destinés à diverses applications en aval. Cette procédure consiste d'abord à isoler C. difficile à partir d'échantillons de selles par ensemencement sur un milieu sélectif. La deuxième étape consiste à cultiver C. difficile en milieu liquide et à conserver des stocks à long terme de C. difficile dans du glycérol.Ensuite, C difficile est prélevé à partir de stocks congelés dans du glycérol et étalé sur des boîtes de gélose. Dans la dernière étape, les stocks de spores de C difficile sont préparés et énumérés finalement en suivant ces protocoles. C difficile peut être cultivé sur divers milieux afin de vérifier et confirmer son identité, et peut être mis en culture et maintenu avec succès.Ces tiges de glycérol et ces cultures peuvent être utilisées ultérieurement dans de nombreuses applications en aval, notamment des études sur des animaux et d'autres études en biologie moléculaire. Le principal avantage de l'utilisation d'une

culturing-maintaining-clostridium-difficile-an-anaerobic

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Li, J., et. al., Développement d’un modèle d’infection larvaire du poisson-zèbre pour Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo démontre l’isolement et l’élevage de la bactérie Clostridioides difficile dans l’intestin de larves de poisson-zèbre. L’intestin infecté est disséqué, homogénéisé et incubé dans un milieu anaérobie sélectif contenant des antibiotiques. Ces conditions suppriment les microbes concurrents et favorisent la croissance de cellules viables.

Isolement et culture de bactéries Clostridioides difficile à partir de larves d’intestin de poisson-zèbre

Source : Anwar, Z., et al. Enrichissement et détection des toxinotypes de Clostridium perfringens dans des échantillons d’aliments vendus au détail. J. Vis. Exp. (2019).Dans cette vidéo, les bactéries sulfito-réductrices sont cultivées dans un milieu gélosé contenant des sulfites, où elles se développent en anaérobie et réduisent le sulfite en sulfure d’hydrogène, formant des précipités noirs avec des ions fer. Les colonies noires sont isolées à partir de la profondeur de la gélose à l’aide de...

Sous-culture de bactéries anaérobies sulfito-réductrices à partir d’une culture de gélose

Ce protocole décrit le modèle de souris céfopérazone d'infection à Clostridium difficile (CDI) en utilisant une souche cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. L' accent mis sur la surveillance clinique de la maladie, C. énumération bactérienne difficile, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques tout au long de CDI dans un modèle de souris sont détaillés dans le protocole.

Céfopérazone traité Souris Modèle de Cliniquement pertinentes<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

L’efficacité des antibiotiques est le plus souvent déterminée en effectuant des études cinétiques de destruction et en mesurant les unités formant colonies (UFC). En intégrant la microscopie électronique à balayage (MEB) à ces méthodes standard, nous pouvons distinguer les effets pharmacologiques du traitement entre différents antibiotiques.

Un protocole pour caractériser les changements morphologiques de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En réponse au traitement antibiotique

Comme les organismes anaérobies obligatoires sont incapables de croître lors de l'exposition à l'oxygène, l'utilisation de techniques de culture anaérobie est indispensable. Ici, nous démontrons une méthode simple et efficace pour cultiver une culture mélangée dérivée d'une usine de biogaz de la préparation des médias à la quantification des gaz et des acides gras volatils.

Préparation moyenne pour la culture de micro-organismes dans des conditions strictement anaérobies/anoxiques

L’objectif de cet article est de détailler les meilleures pratiques pour la fabrication de milieux pour les micro-organismes anaérobies exigeants acquis dans un environnement. Ces méthodes aident à gérer les cultures anaérobies et peuvent être appliquées pour soutenir la croissance de micro-organismes insaisissables non cultivés, la « matière noire microbienne ».

Ensemble de formats de milieux simulés in situ pour la culture de micro-organismes anaérobies acquis dans l’environnement

Le protocole présente deux méthodologies pour améliorer l’isolement des bactéries intestinales anaérobies. La première se concentre sur l’isolement d’un large éventail de bactéries à l’aide de différents milieux de culture. La seconde se concentre sur les étapes de culture d’un groupe microbien spécifique, assimilant éventuellement le myo-inositol, afin de bien comprendre sa signification écologique.

Stratégies pour améliorer l’élevage de bactéries anaérobies dans le tractus gastro-intestinal du poulet

Nous présentons des méthodes pour l'isolement / culture efficace et rapide de la microglie viable du cortex cérébral néonatal et la moelle épinière adulte. La dissection et le placage de la microglie corticale peuvent être accomplies dans les 90 minutes, avec la récolte des microglies subséquente aura lieu ~ 10 jours suivant la dissection initiale.

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Nous décrivons ici d'une simple hybridation fluorescente in situ (FISH) Méthode pour la localisation des virus et des bactéries dans les tissus d'insectes et de plantes. Ce protocole peut être étendu pour la visualisation de l'ARNm dans la montagne ensemble et coupes microscopiques.

Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridations (FISH) pour la localisation des virus et des bactéries dans Endosymbiotic plantes et d&#39;insectes tissus

Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour transfecter efficacement des lignées cellulaires de macrophages murins avec des siRNA à l’aide du système de navette Amaxa Nucleofector à 96 puits, stimuler les macrophages avec des lipopolysaccharides et surveiller les effets sur la production de cytokines inflammatoires.

En utilisant l&#39;ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Apprenez à isoler et cultiver Clostridium difficile en conditions anaérobies strictes pour la recherche en microbiologie. Cette méthode permet de préparer des stocks de glycérol et des spores pour des applications cliniques et moléculaires.

La culture et entretien

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