L'étude des interactions de Staphylococcus aureus Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier les effets du phénol staphylococcique, de la modline soluble ou des PSM sur les neutrophiles humains. Ceci est réalisé en isolant d’abord les neutrophiles du sang humain pour une analyse ultérieure in vitro. Ensuite, les neutrophiles sont soit chargés d’un colorant fluorescent et mélangés à une série de concentrations de MSP avec et sans inhibiteurs, soit on leur permet de phagocyter les bactéries S reus contenant une construction de rapporteur GFP promoteur alpha PSM.

En fin de compte, l’activation des neutrophiles par stimulation PSM peut être surveillée par cytométrie en flux et l’expression de la GFP par le phagocyté. Les bactéries peuvent être analysées par microscopie à fluorescence par cette méthode. Vous pouvez étudier les effets des staphylocoques, des phényles, du soja, des molins ou des neutrophiles.

Bien sûr, cette méthode peut être appliquée à de nombreux autres types de cellules, stimuli et antagonistes. Nous avons d’abord eu l’idée de la partie microscopie de cette méthode lorsque nous avons discuté d’un moyen d’observer les effets des MSP à l’intérieur des neutrophiles. L’utilisation d’une construction d’expression de GFP bactérienne et de la microscopie time-lapse nous permet de faire exactement cela.

Après avoir prélevé cinq tubes de sang veineux hépariné, versez 12 millilitres d’une solution fiale de densité de 1,119 gramme par millilitre dans un tube de 50 millilitres, puis superposez soigneusement 10 millilitres d’une solution d’appel FI de densité de 1,077 gramme par millilitre. Ensuite, diluez le sang avec un volume égal de PBS et superposez soigneusement 20 à 25 millilitres de sang sur chaque gradient d’appel fi à double couche. Centrifugez les gradients pendant 20 minutes à 396 fois G et 22 degrés Celsius sans casser.

Ensuite, utilisez une pompe à vide équipée d’un embout de pipette stérile pour aspirer les couches supérieures de plasma jaune et de PBMC. Et puis la troisième couche blanche. À l’aide d’une petite pipette en plastique, transférez la fraction polymorphonucléaire, neutrophile ou PMN, de chaque tube dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Ajoutez notre PMI fraîchement préparé, pré-refroidi, complété par du sérum humain, de l’albumine ou du R-P-M-I-H-S-A dans chaque tube pour porter le volume total à 50 millilitres. Ensuite, faites tourner les cellules, aspirez le surnageant avec une pompe à vide et vortex doucement l’érythrocyte rouge et les pastilles contenant du PMN. Ensuite, ajoutez neuf millilitres d’eau déminéralisée stérile dans les cellules et démarrez une minuterie.

Ajoutez exactement 30 secondes. Ajoutez un millilitre de PBS 10 fois concentré pour arrêter le choc hyperosmotique. Ensuite, lavez les cellules dans un volume total de 50 millilitres de R-P-M-I-H-S-A.

Après avoir retiré le surnageant, ajoutez un millilitre de R-P-M-I-H-S-A à chaque palais, qui est maintenant blanc en raison de la lyse des érythrocytes. Ensuite, réanimez, suspendez par pipetage et combinez les granulés dans un seul tube. Maintenant, comptez les cellules et ajustez la concentration à une fois 10 à la septième cellule par millilitre.

Chargez maintenant cinq fois 10 à la sixième cellules par millilitre avec deux micromolaires de grippe oh 3h00 du matin en R-P-M-I-H-S-A. Et couvrez le tube avec du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Ensuite, incubez les cellules pendant 20 minutes à température sous agitation.

Pendant ce temps, préparez une dilution en série triple du stimulus à 10 fois la concentration finale. Ensuite, pré-incubez 30 microlitres du stimulus avec un volume égal d’inhibiteur ou de tampon 10 fois concentré fraîchement préparé pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules dans 10 millilitres de R-P-M-I-H-S-A et remettez les cellules en suspension dans du R-P-M-I-H-S-A frais à raison de cinq fois 10 à 10 à la sixième cellules par millilitre.

Juste avant l’analyse de flux, diluez les cellules à deux fois 10 à six cellules par millilitre en R-P-M-I-H-S-A et ajoutez 200 microlitres de cellules par tube de fax. En faisant attention à ne pas activer les cellules en secouant ou en pipetant, chargez le premier tube sur le cytomètre en flux. Attendez trois secondes, puis commencez l’acquisition après une période de temps fixe, par exemple huit secondes, retirez le tube et ajoutez rapidement 50 microlitres de la dilution la plus faible du stimulus à l’échantillon.

Rechargez immédiatement le tube et poursuivez l’acquisition. Lorsqu’une série de dilution est terminée, laver l’aiguille du cytomètre en flux avec du R-P-M-I-H-S-A frais avant de mesurer une nouvelle série. Après avoir analysé le dernier échantillon, analysez les données avec un logiciel d’analyse par cytométrie en flux pour analyser l’expression de la GFP bactérienne.

Après la phagocytose de PMN, cultiver une souche S ous contenant la construction rapporteure d’intérêt pendant la nuit dans un bouillon, éliminer toute GFP exprimée pendant la culture pendant la nuit en diluant les cellules à OD 6 60 0 0,01. Cultiver la culture à OD 6 60 0 0,1. Diluez les cellules un à 30, puis surveillez la croissance jusqu’à ce que la culture atteigne à nouveau une DO six 60 de 0,1.

Récupérez ensuite les bactéries par centrifugation. Lavez les cellules une fois dans DPBS et Resus. Suspendez la culture.

Ajoutez un à 10 du volume d’origine pour obtenir une DO six 60 de 1,0 ou environ cinq fois 10 à la huitième UFC par millilitre. Mélangez maintenant la bactérie avec le PNS fraîchement isolé dans R-P-M-I-H-S-A dans un rapport de 10 pour un. Ajoutez ensuite du sérum humain mélangé à un dixième du volume final total de sérum humain mélangé dans la solution cellulaire.

Stimulez la phagocytose en secouant le mélange cellulaire pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, diluez les PMN chargés de bactéries à cinq fois 10 à la cinquième cellules par millilitre, et transférez 250 microlitres de cellules dans chaque puits d’une lamelle à huit compartiments. Enfin, imagez les cellules sur un microscope inversé équipé d’un objectif 40x et enfermé dans une chambre d’environnement sombre et acquérez des images à plusieurs endroits dans les chambres de lamelle toutes les cinq à 10 minutes à la fois en fond clair et dans le canal GFP pour suivre la production bactérienne de GFP en temps réel, l’incubation de neutrophiles avec une série de concentrations de PSM alpha trois synthétiques entraîne une activation rapide dose-dépendante de la cellules mesurées par le flux de calcium.

La pré-incubation du peptide PSM alpha trois avec 0,01 %, 0,1 % ou 1 % de sérum humain a inhibé de manière significative la capacité du stimulus à provoquer une réponse calcique. Encore une fois de manière dose-dépendante à 1 % de sérum. Pratiquement aucune activation n’est visible à ces concentrations de PSM alpha trois.

Sur ces images, deux neutrophiles contenant des bactéries phagocytes contenant une construction rapporteure PSM alpha GFP sont représentés. Les bactéries commencent à devenir fluorescentes environ une heure après la phagocytose, indiquant l’expression de la GFP à partir du promoteur PSM Alpha. Les bactéries à l’extérieur des neutrophiles ne sont pas fluorescentes, ce qui indique que l’expression alpha de PSM n’est rapidement activée que lorsque les bactéries sont phagocytées.

Lors de cette tentative, il est important de se rappeler de toujours utiliser des neutrophiles frais pour des résultats optimaux. Après avoir regardé cette vidéo, j’espère que vous avez une bonne compréhension de la façon de mesurer le flux de calcium par cytométrie en flux et de la façon de mesurer l’expression des gènes bactériens à l’intérieur des cellules eucaryotes à l’aide de la microscopie à fluorescence.