Name: Létude des interactions de Staphylococcus aureus Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Découvrez l'analyse de l'activation des neutrophiles par les PSMs de Staphylococcus aureus en utilisant la cytométrie en flux et la microscopie à fluorescence. Cette méthode permet d'étudier les réponses immunitaires in vitro.

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<p class="jove_content"&gt; RN a été partiellement financée par une bourse Marie subventions Re-Curie d&#39;intégration européens (ERG) du septième programme-cadre de la Communauté européenne, le numéro de projet 268324.</p&gt;

1. Isolation des PMN du sang humain par centrifugation par densité <ol><li> Dessinez 5 9 tubes ml de sang veineux hépariné. </li><li> Préparer double couche gradients Ficoll (4 gradients de 5 tubes de sang), comme suit: verser 12 ml d&#39;une solution de ficoll de densité 1,119 g / ml dans un tube de 50 ml et la couche soigneusement 10 ml d&#39;une solution de ficoll de densité 1,077 g / ml sur le dessus. </li><li> Diluer le sang avec un volume égal de PBS. </li><li> La couche de sang dilué avec soin sur la couche double gradient Ficoll; 20-25 ml par gradient. </li><li> Centrifuger 20 min à 396 x g dans un rotor à godets oscillants, 22 ° C sans freinage. </li><li> Préparer RPMI froid contenant 0,05% de l&#39;albumine sérique humaine (RPMI-HSA). Préparez aussi 9 ml stérile déminéralisée H 2 O. Pré-cool à la fois le RPMI et H 2 O sur la glace. </li><li> Aspirer la couche de Ficoll supérieure contenant le plasma (de couleur jaune) et des PBMC, et la seconde couche de Ficoll (couleur blanche) avec l&#39;utilisation d&#39;une pompe à vide (mettre une pointe de pipette stérile surla pipette). </li><li> Recueillir les PMN en tubes de 50 ml à l&#39;aide d&#39;une petite pipette en plastique (1 Tube pour les fractions de PMN tous les 2 gradients), et les placer sur la glace. </li><li> Ajouter froid RPMI-HSA pour un volume total de 50 ml et centrifuger pendant 10 min à 249 xg à 4 ° C. </li><li> Enlever le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pompe à vide et le culot vortex doucement (érythrocytes et PMN). </li><li> Ajouter 9 ml stérile déminéralisée H 2 O et lancer le chronomètre. Arrêter le choc osmotique hyper après 30 secondes exactement, en ajoutant 1 ml 10 fois concentré PBS. Note: le 30 sec sont très critiques. </li><li> Ajouter froid RPMI-HSA pour un volume total de 50 ml et centrifuger pendant 10 min à 249 xg à 4 ° C. </li><li> Enlever le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pompe à vide et de recueillir le PMN culot dans 1 tube avec un volume défini (2.1 ml) de milieu RPMI-HSA. </li><li> Déterminer la quantité de cellules et ajuster la concentration de 1.10 7 cellules / ml. Selon le donateur, le rendement du PMN isolés sont betweFR 5 x 10 6 et 3 x 10 7 PMN de chaque tube 9 ml de sang </li></ol> 2. Débit Assay Cytometric pour l&#39;évaluation de la mobilisation de calcium dans PMN humains <ol><li> Les cellules de charge (5 x 10 6 cellules / ml) avec 2uM Fluo-3-AM dans RPMI-HSA et incuber pendant 20 min à température ambiante bascule lentement, en utilisant par exemple une plate-forme à bascule shaker, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> En attendant préparer une dilution en série (par exemple 3 fois) du stimulus à 10x la concentration finale. PSMα3 est utilisé dans ce protocole, mais tout stimulus de GPCR qui agit sur les neutrophiles est approprié. </li><li> Préparer inhibiteur concentré 10x du récepteur dans RPMI-HSA. Lorsque l&#39;inhibiteur agit sur ​​la stimulation (par exemple HDL sur PSMα3) pré-incuber 25 stimulus ul avec un volume égal d&#39;inhibiteur pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 10 ml de RPMI-HSA et centrifugeuse pour 249 g à température ambiante. Remettre les cellules à 5 x10 6 cellules / ml. </li><li> Juste avant l&#39;expérience, diluer les cellules à 2x10 6 cellules / ml dans du RPMI-HSA et ajouter 200 pi de cellules par tube FACS. PMN dilué sont très fragiles. Les garder trop longtemps à cette concentration va conduire à l&#39;activation automatique; la même chose pour secouer vigoureusement ou pipetage. </li><li> Attachez le tube à la cytométrie en flux, attendre 3 secondes et lancer l&#39;acquisition. Après une période de temps fixe (par exemple 8 sec), enlever le tube et ajouter rapidement 50 stimulus ul de l&#39;échantillon. Immédiatement ré-attacher le tube sur le porte-échantillon et de continuer l&#39;acquisition. </li><li> Commencez par le bas et à la fin avec la plus forte concentration de stimulus. Laver l&#39;aiguille de cytomètre de flux régulièrement après chaque course avec RPMI-HSA. </li><li> Analyser des données avec le logiciel d&#39;analyse de cytométrie en flux. Comparer le signal de fluorescence moyenne avant l&#39;ajout du stimulus pour que, après plus de stimulus et d&#39;utiliser les contrôles positifs et négatifs appropriés pour calculer l&#39;acrésistance à la vation mesurée pour chaque dilution. </li></ol> En variante lorsque l&#39;inhibiteur agit sur les récepteurs de pré-incuber les cellules avec l&#39;inhibiteur. 3. Analyse par microscopie de fluorescence de la GFP bactéries expression après phagocytose par les PMN <ol><li> Croître S. souches de Staphylococcus contenant une construction reporter d&#39;intérêt pendant la nuit dans un bouillon (avec des antibiotiques lorsque cela est nécessaire pour maintenir le plasmide rapporteur). Dans ce cas, la souche de MW2 contenant une construction rapporteur GFP PSMα 10 est utilisé, cultivées dans un tube en matière plastique de 50 ml avec 5 ml de milieu de culture LB. </li><li> Pour supprimer tous GFP de l&#39;expression O / N, diluer les cultures à OD 660 0,01 croître et à OD 660 0.1. Redilute ce 1h30 de culture, et de surveiller la croissance jusqu&#39;à ce que la culture atteint une DO660 de 0,1. Recueillir les bactéries par centrifugation et les laver une fois dans DPBS. Reprendre en 1h10 du volume initial pour obtenir une DO 660 de 1,0 ou roughly 5.10 8 ufc / ml. </li><li> Mélanger les bactéries (1.10 7 / ml) avec PMN fraîchement isolés (1.10 6 / ml) dans du RPMI-HSA (10:1) dans un microtube de 1,5 ml et ajouter le sérum humain mis en commun à une concentration finale de 10%. Secouez sur une plate-forme agitation pendant 10 min à 37 ° C pour stimuler la phagocytose. Diluer les PMN chargées de bactéries à 5.10 5 PN / ml et pipette 250 ul dans un puits d&#39;une lamelle bien chambré 8. </li><li> Image PMN avec des bactéries sur un microscope. Un microscope inversé équipé d&#39;un objectif NA 40X/0.85 fonctionne bien et ne doit être enfermé dans une chambre à environnement sombre pour maintenir l&#39;environnement de manière stable à 37 ° C. Acquérir les images pour un certain nombre de positions prédéfinies à l&#39;aide de la caméra toutes les 5-10 min à la fois dans le champ lumineux et le canal GFP de suivre la production de GFP dans le temps. </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Dans les procédés décrits ici quelques étapes sont très critiques. Nous allons mettre en évidence ces ici. Pour l&#39;isolement des neutrophiles par centrifugation en gradient de densité, il est important de ne pas perturber les couches pendant ou après les étapes de centrifugation. Lors de l&#39;aspiration des neutrophiles à l&#39;aide d&#39;une pipette en plastique, assurez-vous de ne pas presser le ballon alors que dans la couche de cellules, comme éjecter un liquide va perturber les couc...

Neutrophiles (PMN) sont des phagocytes professionnels qui jouent un rôle clé dans la réponse immunitaire innée contre le Staphylococcus aureus 1. La bataille constante entre l&#39;hôte et microbe a conduit à une course aux armements des deux. Récemment, la communauté-associés souches (CA) de résistant à la méticilline S. aureus (MRSA) ont vu le jour qui semble être très efficace dans la neutralisation des neutrophiles meurtre 2,3. Modulin (PSM), la production soluble phénol excessif de CA-MRSA a été associée avec une plus grande virulence 4,5. Neutrophiles humains peuvent reconnaître ces PSM via FPR2 qui conduisent à l&#39;activation de cette protéine-G récepteur couplé à 6. Un des premiers événements est la mobilisation des réserves intracellulaires de calcium (Ca 2 +). Ca 2 + agit comme un messager secondaire pour une variété de fonctions effectrices des PMN dont la dégranulation et la phagocytose 7. Par conséquent Ca 2 + est un indicateur très sensible de lala capacité fonctionnelle du PSM pour activer PMN. Pour étudier les effets de PSM sur les neutrophiles, les neutrophiles frais sont isolées et chargées avec un colorant fluorescent qui lors de la mobilisation du calcium. Dans une expérience de cytométrie en flux cette mobilisation rapide peut être mesurée. En utilisant cette méthode, il est possible d&#39;étudier les effets directs des composants toxiques et d&#39;autres sur les neutrophiles, et de déterminer la concentration minimale à laquelle ceux-ci sont actifs. Pour nous, c&#39;est un outil très utile pour étudier l&#39;effet de nombreuses protéines produites par S. aureus impliquée dans l&#39;évasion immunitaire, comme FPR2 protéine inhibitrice (FlipR) 8, FlipR-like 7 et Chemotaxis protéine inhibitrice de Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Toutes ces protéines ont été montré pour empêcher la mobilisation du calcium dans les neutrophiles en se liant au récepteur reconnaissant l&#39;agoniste. Récemment, notre groupe a indiqué que les MSP sont fonctionnellement inhibés par les lipoprotéines du sérum 10 &lt;/ Sup&gt;. Ces lipoprotéines sont abondamment présents dans le sang et les tissus humains, ce qui indique que les MSP exercent leur fonction principalement dans le milieu intracellulaire. La disponibilité du test de mobilisation du calcium permis de mesurer précisément l&#39;effet des lipoprotéines du sérum sur l&#39;activation des neutrophiles par les PSM, indiquée par l&#39;inhibition considérable par de très faibles concentrations de sérum. Depuis les PSM sont fonctionnellement inhibée par le sérum, nous avons émis l&#39;hypothèse qu&#39;il existe une fonction importante pour PSM que les toxines intracellulaires. Nous avons donc cherché à déterminer le rôle de PSM après phagocytose. Pour étudier l&#39;expression des MPS dans l&#39;espace intercellulaire, nous avons construit des fusions rapporteurs du promoteur de l&#39;opéron psmα à la GFP. Lorsque ces souches rapporteuses de S. aureus ont été phagocytés par les neutrophiles, l&#39;induction de l&#39;expression était observable en utilisant la microscopie à fluorescence 10. Évidemment, cette technique permet l&#39;étude de l&#39;expression d&#39;un grand nombre de gènes de S. aureus ou d&#39;autres agents pathogènes après phagocytose. Étant donné que pour S. aureus survivre dans la niche intercellulaire est très important pour surmonter le système immunitaire inné 11 10 12, étudier le rôle des gènes activés dans ce créneau est très pertinente pour la compréhension de sa virulence.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Sondes moléculaires / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>densité 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>densité 1,119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>contient 25 mM HEPES et L-glutamine</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 microscope</td><td>Leica Microsystèmes, Pays-Bas</td><td>TCS SP5</td><td>objectif : HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Il est très important que le tube puisse être retiré et remplacé pendant le processus de mesure</td></tr></tbody></table>

l&#39;étude des interactions de<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie time lapse

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Nous présentons les méthodes pour étudier l&#39;effet de modulins solubles phénol (PSM) et d&#39;autres toxines produites et sécrétées par Staphylococcus aureus sur les neutrophiles. Pour étudier les effets des MPS sur les neutrophiles nous isolons neutrophiles frais en utilisant un gradient de densité centrifugation. Ces neutrophiles sont chargées avec un colorant fluorescent qui lors de la mobilisation du calcium. L&#39;activation des neutrophiles par les MSP lance une augmentation rapide et transitoire de la concentration de calcium intracellulaire libre. Dans une expérience de cytométrie en flux cette mobilisation rapide peut être mesurée en surveillant la fluorescence d&#39;un colorant pré-chargé qui réagit à l&#39;augmentation de la concentration de Ca 2 + libre. En utilisant cette méthode, nous pouvons déterminer la concentration de PSM nécessaire d&#39;activer le neutrophiles, et de mesurer les effets des inhibiteurs spécifiques et générales de l&#39;activation des neutrophiles. Pour étudier l&#39;expression des MPS dans l&#39;espace intracellulaire, we ont construit fusions rapporteurs du promoteur de l&#39;opéron PSMα à la GFP. Lorsque ces souches rapporteuses de S. aureus sont phagocytés par les neutrophiles, l&#39;induction de l&#39;expression peut être observée en utilisant la microscopie à fluorescence.

Débit test de cytométrie pour l&#39;évaluation de la mobilisation du calcium dans les PMN humains Incuber des neutrophiles avec une série de concentrations de PSMα3 synthétiques résultant en une activation rapide, tel que mesuré par le flux de calcium, qui est représenté par une augmentation du signal dans FL-1. La pré-incubation de synthèse PSMα3 avec 0,01%, 0,1% ou 1% de sérum humain inhibé de manière significative la capacité de susciter des flux de calcium (Figure 1). <...

Nous présentons les méthodes pour étudier l&#39;effet du PSM et d&#39;autres toxines sécrétées par<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Sur les neutrophiles en utilisant la cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence.

L&#39;étude des interactions de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier les effets du phénol staphylococcique, du moduline soluble ou des PSM sur les neutrophiles humains. Cela est réalisé en isolant d'abord les neutrophiles à partir de sang humain pour une analyse ultérieure in vitro. Ensuite, les neutrophiles sont soit chargés avec un colorant fluorescent et mélangés à une série de concentrations de PSM avec ou sans inhibiteurs, soit laissés à phagocyter des bactéries S. aureus contenant une construction rapporteuse GFP sous le promoteur alpha de PSM.En fin de compte, l'activation des neutrophiles par la stimulation avec les PSM peut être surveillée par cytométrie en flux et l'expression de la GFP par les bactéries phagocytées peut être analysée par microscopie à fluorescence à l'aide de cette méthode. Vous pouvez étudier les effets des staphylocoques, du phényle, du soja, des molines ou des neutrophiles.Bien sûr, cette méthode peut être appliquée à de nombreux autres types cellulaires, stimuli et antagonistes. Nous avons eu l'idée initiale concernant la partie microscopie de cette méthode en discutant d'une manière d'observer les effets des PSM à l'intérieur des neutrophiles. L'utilisation d'une construction bactérienne exprimant la GFP et d'une microscopie en temps réel nous permet de faire exactement cela.Après avoir prélevé cinq tubes de sang veineux hépariné, versez 12 millilitres d'une solution de fial de densité 1,119 gramme par millilitre dans un tube de 50 millilitres, puis recouvrez soigneusement de 10 millilitres d'une solution FI call de densité 1,077 gramme par millilitre. Ensuite, diluez le sang avec un volume égal de PBS et déposez 20 à 25 millilitres de sang soigneusement sur chaque gradient double couche de FI call. Faites centrifuger les gradients pendant 20 minutes à 396 fois G et à 22 degrés Celsius sans freinage.Ensuite, utilisez une pompe à vide équipée d'une pointe de pipette stérile pour aspirer les couches supérieures de plasma jaune et de PBMC. Puis aspirez la troisième couche blanche. Utilisez maintenant une petite pipette en plastique pour transférer la fraction de neutrophiles polynucléaires ou PMN de chaque tube dans un nouveau tube de 50 millilitres.Ajoutez à chaque tube 50 millilitres au total de PMI fraîchement préparé et prérefroidi, complété par de l'albumine sérique humaine ou de RPMI-HSA, pour atteindre un volume final de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules, aspirez le surnageant à l’aide d’une pompe à vide et vortexez doucement le culot contenant les érythrocytes rouges et les PNN. Puis, ajoutez 9 millilitres d’eau stérile désionisée aux cellules et déclenchez un minuteur.Ajoutez exactement 30 secondes. Ajoutez un millilitre de PBS concentré 10 fois pour arrêter le choc hyperosmotique. Ensuite, lavez les cellules dans un volume total de 50 millilitres de R-P-M-I-H-S-A froide.Après avoir retiré le surnageant, ajoutez un millilitre de R-P-M-I-H-S-A à chaque palette, qui est maintenant blanche en raison de la lyse des érythrocytes. Ensuite, resuspendez par pipetage et regroupez les culots dans un même tube. Comptez maintenant les cellules et ajustez la concentration à un fois dix puissance sept cellules par millilitre.Chargez maintenant cinq fois 10 à la puissance six cellules par millilitre avec deux micromolaire de fluoh 3:00 AM dans du R-P-M-I-H-S-A. Recouvrez le tube de papier d'aluminium pour le protéger de la lumière. Incubez ensuite les cellules pendant 20 minutes à température ambiante sous agitation.Entre-temps, préparez une dilution sérielle au tiers du stimulus à 10 fois la concentration finale. Incubez ensuite 30 microlitres du stimulus avec un volume égal d'inhibiteur fraîchement préparé concentré 10 fois ou avec du tampon pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules dans 10 millilitres de R-P-M-I-H-S-A et resuspendez les cellules dans du R-P-M-I-H-S-A frais à une concentration de cinq fois 10 à la puissance six cellules par millilitre.Juste avant l'analyse en flux, diluez les cellules à deux fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre dans du R-P-M-I-H-S-A et ajoutez 200 microlitres de cellules par tube FACS. En prenant soin de ne pas activer les cellules par agitation ou pipetage, chargez le premier tube sur le cytomètre en flux. Attendez trois secondes, puis démarrez l'acquisition ; après une période de temps fixe, par exemple huit secondes, retirez le tube et ajoutez rapidement 50 microlitres de la dilution la plus faible du stimulus à l'échantillon.Rechargez immédiatement le tube et poursuivez l'acquisition. Lorsqu'une série de dilutions est terminée, rincez l'aiguille du cytomètre en flux avec du R-P-M-I-H-S-A frais avant de mesurer une nouvelle série. Après avoir analysé le dernier échantillon, analysez les données à l'aide d'un logiciel d'analyse de cytométrie en flux pour évaluer l'expression bactérienne de la GFP.Après la phagocytose par les PMN, cultiver une souche S. aureus contenant le construit rapporteur d'intérêt pendant la nuit dans un bouillon, puis éliminer toute expression de GFP survenue pendant la culture nocturne en diluant les cellules jusqu'à une DO600 de 0,01. Faire croître la culture jusqu'à une DO600 de 0,1. Diluer les cellules au 1/30, puis surveiller la croissance jusqu'à ce que la culture atteigne à nouveau une DO600 de 0,1.Ensuite, recueillir les bactéries par centrifugation. Laver les cellules une fois dans du DPBS et du Resus. Suspendre la culture.Ajoutez un à 10 fois le volume initial pour obtenir une DO à 600 nm de 1,0 ou environ cinq fois 10 à la puissance huit UFC par millilitre. Mélangez maintenant les bactéries avec le SNA fraîchement isolé dans du RPMI-HSA selon un rapport de 10 pour 1. Ajoutez ensuite du sérum humain poolé à un volume final total correspondant à un dixième de sérum humain poolé dans la solution cellulaire.Stimuler la phagocytose en agitant le mélange cellulaire pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, diluer les PMN chargés en bactéries à cinq fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre, puis transférer 250 microlitres des cellules dans chaque puits d'une lamelle-chambre à huit puits. Enfin, observer les cellules au microscope inversé équipé d'un objectif 40 x et placé dans une chambre d'environnement sombre, et acquérir des images à plusieurs emplacements dans les chambres de la lamelle toutes les cinq à dix minutes, en champ clair et dans le canal GFP, afin de suivre en temps réel la production bactérienne de GFP. L'incubation des neutrophiles avec une série de concentrations de PSM alpha trois synthétique induit une activation rapide des cellules dépendante de la dose, mesurée par le flux calcique.La pré-incubation du peptide PSM alpha trois avec 0,01 %, 0,1 % ou 1 % de sérum humain a fortement inhibé la capacité du stimulus à induire une réponse calcique. Là encore, de manière dépendante de la dose, à 1 % de sérum, presque aucune activation n'est visible à ces concentrations de PSM alpha trois.Dans ces images, deux neutrophiles contenant des bactéries ayant phagocytées un construit rapporteur PSM alpha GFP sont montrés. Les bactéries commencent à fluorescer environ une heure après la phagocytose, indiquant l'expression de la GFP sous le promoteur PSM alpha. Les bactéries situées à l'extérieur des neutrophiles ne fluorescent pas, ce qui indique que l'expression du PSM alpha s'active rapidement uniquement lorsque les bactéries sont phagocytées.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de toujours utiliser des neutrophiles frais pour obtenir des résultats optimaux. Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous comprenez bien comment mesurer le flux de calcium par cytométrie en flux et comment évaluer l'expression génique bactérienne à l'intérieur des cellules eucaryotes à l'aide de la microscopie à fluorescence.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Cette vidéo présente un test in vitro pour étudier l’interaction neutrophile-biofilm. Les bactéries pathogènes intégrées dans le biofilm et les neutrophiles isolés ont été marqués à l’aide de marqueurs fluorescents, et la réponse immunitaire des neutrophiles et l’évasion de la réponse immunitaire par les bactéries ont été évaluées à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Un essai in vitro pour étudier l’interaction entre les neutrophiles et le biofilm

La vidéo présente une méthode d’étude de l’impact des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes. Dans un modèle de chambre d’écoulement de plaques parallèles, les cytokines pro-inflammatoires induisent l’expression des récepteurs d’adhésion par les cellules endothéliales, facilitant le recrutement et la migration des neutrophiles. La diaphonie entre les cellules stromales et les cellules endothéliales diminue le recrutement des neutrophiles dans les cellules endothéliales.

Une étude in vitro de l’effet des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes

Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

La capacité de l'endothélium enflammé de recruter leucocytes du débit est régulé par les cellules stromales mésenchymateuses. Nous décrivons deux modèles in vitro incorporant cellules humaines primaires qui peuvent être utilisés pour évaluer le recrutement des neutrophiles de flux et d'examiner le rôle que les cellules stromales mésenchymateuses jouent dans la régulation de ce processus.

Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

Cette étude décrit la surveillance microscopique de l'adhérence au pneumocoque aux chaînes de facteur von Willebrand produites à la surface des cellules endothéliales primaires humaines différenciées sous l'effort de cisaillement dans des conditions définies d'écoulement. Ce protocole peut être étendu à la visualisation détaillée de structures cellulaires spécifiques et à la quantification des bactéries en appliquant des procédures d'immunostaining différentielles.

Infection de Pneumococcus des cellules endothéliales humaines primaires dans le flux constant

Ce protocole d’imagerie cellulaire bactérienne vivante permet de visualiser les interactions entre plusieurs espèces bactériennes au niveau unicellulaire au fil du temps. L’imagerie par time-lapse permet d’observer chaque espèce bactérienne en monoculture ou en coculture afin d’interroger les interactions inter-espèces dans les communautés bactériennes multi-espèces, y compris la motilité cellulaire individuelle et la viabilité.

Visualisation cinétique des interactions bactériennes interspécifiqueuses unicellulaires

Le présent protocole décrit l’étude des interactions neutrophiles-biofilm. Les biofilms de Staphylococcus aureus sont établis in vitro et incubés avec des neutrophiles humains dérivés du sang périphérique. La réponse oxydative des neutrophiles est quantifiée et la localisation des neutrophiles dans le biofilm est déterminée par microscopie.

Essais in vitro standardisés pour visualiser et quantifier les interactions entre les neutrophiles humains et les biofilms de Staphylococcus aureus

Ce protocole décrit une approche quantitative pour mesurer l’auto-agrégation microbienne à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie.

Cytométrie en flux d’imagerie pour étudier l’auto-agrégation microbienne

Dans ce manuscrit, nous fournissons un protocole complet pour évaluer la survie aux antibiotiques de Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus, en transformant les plasmides en P. aeruginosa et S. aureus pour créer des souches rapporteures et visualiser des variantes phénotypiques, telles que les persistants, par microscopie à épifluorescence time-lapse.

Imagerie par microscopie à épifluorescence time-lapse de Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus Phénotypes hétérogènes

Découvrez l'analyse de l'activation des neutrophiles par les PSMs de Staphylococcus aureus en utilisant la cytométrie en flux et la microscopie à fluorescence. Cette méthode permet d'étudier les réponses immunitaires in vitro.

L'étude des interactions de

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